我们介绍一种利用质量光度法（MP）进行抗原-抗体亲和力测量的单分子方法。基于MP的实验方案快速、准确，仅需极少量样品，且无需对蛋白质进行修饰。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力测定在医学和科研应用中至关重要。本方案中，我们介绍了一种用于此目的的新型单分子技术——质量光度法（mass photometry, MP）的实施方法。MP 是一种无需标记和固定的技术，可在单分子水平上检测并量化抗体及抗原-抗体复合物的分子质量与种群分布。MP 可在数分钟内完成对抗原-抗体样品的分析，从而精确测定结合亲和力，同时提供有关蛋白质化学计量比和寡聚状态的信息。该技术操作简便，仅需皮摩尔量级的蛋白质，且无需昂贵的耗材。相同的方法也可用于研究分子质量大于 50 kDa 的蛋白质之间的蛋白-蛋白结合。对于多价蛋白相互作用，可在一次测量中获得多个结合位点的亲和力。然而，单分子检测模式以及无标记特性也带来一定的实验限制。该方法在测定亚微摩尔级相互作用亲和力、分子质量为 20 kDa 或更大的抗原，以及相对纯净的蛋白样品时效果最佳。我们还介绍了如何使用基础的数据分析软件完成必要的拟合与计算步骤。
引言
抗体已成为分子生物学中普遍使用的工具，广泛应用于医学和科研领域。在医学上，抗体在诊断中具有至关重要的作用，同时其治疗应用也在不断拓展，基于抗体的新疗法正在持续开发中1,2,3,4。抗体的科研应用包括多种不可或缺的实验技术，如免疫荧光5、免疫沉淀6、流式细胞术7、ELISA 和蛋白质印迹（western blotting）。对于这些应用而言，准确测定抗体的结合特性（包括结合亲和力和特异性）至关重要。
自1990年首台商用表面等离子体共振（SPR）仪器问世以来，光学生物传感器已成为抗体表征的“金标准”，但其他技术（包括ELISA）也常用于测量抗体亲和力8,9。这些方法通常需要对被分析分子进行固定或标记，这可能会影响目标相互作用。此外，它们速度相对较慢，在获得可用于数据分析的结果之前需经历多个检测步骤。一种近期开发的单分子方法——质量光度法（MP），可在分子落在显微镜盖玻片表面时直接在溶液中检测分子10,11。MP所采用的基于光散射的光学检测技术无需对蛋白质进行标记或修饰。单个蛋白质分子在图像中以暗斑形式被干涉散射显微镜记录（图1D），在一分钟的数据采集过程中可检测数千个分子12。每个单个粒子产生的信号被量化，并计算其对比度值（相对暗度）。干涉对比度值与蛋白质的分子质量成正比，从而可识别抗原-抗体混合物中结合态与游离态的组分。同时，通过统计分子着落事件，MP可直接测量各组分的种群数量。这使得基于MP的方法具备独特的能力，可独立量化多个结合位点的亲和力。
抗原（Ag）分子与完整抗体（Ab）的两个结合位点之间的结合可用下式描述：
其中平衡结合常数 Ka1 和 Ka2 定义如下：
式中 ci 和 fi 分别表示组分 i 的浓度和摩尔分数。总抗原浓度（cAg）tot 可表示为：
由于抗体（cAb)tot和抗原（cAg)tot的总浓度已知，因此可利用该方程直接拟合从MP测量中获得的实验组分分数，并计算平衡结合常数Ka1和Ka2（见补充信息）。
MP 数据还可用于估算两个抗体结合位点之间的协同性11。对于两个具有相同微观结合常数的抗体互补位，描述 Ab·Ag 和 Ab·Ag2 复合物形成过程的统计因子表明，表观宏观平衡常数 Ka1 与 Ka2 在数值上并不相等，且 Ka1 = 4Ka2。因此，实验测得的 Ka1 < 4Ka2 表明两个抗体结合位点之间存在正协同性。类似地，Ka1 > 4Ka2 表明存在负协同性。
测量抗原-抗体结合亲和力的微流控技术（MP）快速且所需材料量少。用于平衡常数计算的MP质量分布可提供有关样品特性的额外信息，能够在单次实验中评估样品纯度、寡聚化及聚集状态。该方法同样可用于测量高亲和力的蛋白质-蛋白质相互作用，而MP在研究多价蛋白质相互作用方面尤为有用。多蛋白复合物通常具有较大的分子质量，非常适合MP检测，且可利用单分子数据同时测定化学计量比以及多个结合位点的亲和力。这些信息通常难以通过基于整体样品的检测方法获得。
在不作修改的情况下，本方案适用于分子量为20 kDa或更大、且亲和力相对较高（亚微摩尔级别）的抗原相互作用的测定。为获得最佳结果，蛋白质储备液应具有高纯度，但对缓冲液无特殊要求。通过使用MP技术，可在不到五分钟内完成抗原-抗体结合的评估。用于准确计算Kd值所需的数据采集与分析可在30分钟内完成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备流式室
- 清洗玻璃盖玻片
- 使用装有蒸馏水、乙醇和异丙醇的洗瓶，按以下顺序冲洗 24 mm × 50 mm 的盖玻片：水、乙醇、水、异丙醇、水。用洁净的氮气流吹干盖玻片。冲洗时应自上而下进行，用尖端柔软的镊子夹住盖玻片底部边缘。干燥时也应沿相同方向吹气，以避免镊子污染盖玻片（图 2A）。
- 同样，用蒸馏水、乙醇和蒸馏水依次冲洗 24 mm × 24 mm 的盖玻片，并用洁净的氮气流吹干。
- 确定盖玻片的工作面：在洁净盖玻片表面滴加一滴蒸馏水，然后按照方案中的步骤 3.1–3.2 进行操作。通常只有 24 mm × 50 mm 盖玻片的一面具有适合多光子（MP）测量的光学质量。
注意：聚焦后应无法检测到明显的表面缺陷，数据采集软件中显示的“信号”值应小于 0.05%（图 1A-C）。盒中所有盖玻片的工作面均朝向同一方向。应采用相同程序测试盖玻片清洗效果。
- 组装流动池
- 将 24 mm × 24 mm 的盖玻片放置在一张铝箔上。如 图 2B 所示，在 24 mm × 24 mm 盖玻片上贴上双面胶条，并沿玻璃边缘裁剪胶带。将盖玻片从铝箔上取下，将其粘附在 24 mm × 50 mm 盖玻片的工作面上（图 2C）。
注意：通道尺寸可调整，但建议宽度为 3 mm–5 mm。过宽的通道需要更大的样品体积，而过窄的通道可能难以加样。通常可在 24 mm × 24 mm 盖玻片上轻松制作两条平行通道。此处可暂停实验流程。
- 将 24 mm × 24 mm 的盖玻片放置在一张铝箔上。如 图 2B 所示，在 24 mm × 24 mm 盖玻片上贴上双面胶条，并沿玻璃边缘裁剪胶带。将盖玻片从铝箔上取下，将其粘附在 24 mm × 50 mm 盖玻片的工作面上（图 2C）。
2. 准备用于亲和力测定的抗体-抗原样品
- 使用 0.22 µm 注射器滤器过滤至少 2 mL PBS 缓冲液，以去除灰尘颗粒或聚集体。将蛋白储备液在台式离心机中以最大速度（约 16,000 × g）离心 10 分钟。
注意：本方案推荐使用 PBS 缓冲液，但微尺度泳动（MP）对缓冲液无特殊要求，其他生物缓冲液也可接受。然而，高浓度甘油（>10%）和极低离子强度（盐浓度 <10 mM）可能影响图像和数据质量，不推荐使用。 - 通过测定 280 nm 紫外吸收值，确定抗体和抗原储备液的实际浓度。
- 计算抗原-抗体混合物的检测浓度。若抗体结合亲和力的估计值未知，建议配制含 30 nM 抗原和 20 nM 抗体的样品。当已知大致亲和力时，应根据预期的 Kd 值优化抗体与抗原的比例及其浓度。在下式中，使用混合物中抗原的总浓度等于预期 Kd 值与抗体总浓度之和。假设抗体两个抗原结合位点的 Kd1 = Kd2，这将使样品中游离抗体与抗原-抗体复合物的浓度相近。
调整抗体浓度，使样品中总蛋白浓度保持在 10 nM 至 50 nM 范围内。使用抗体浓度在 5 nM 至 25 nM 之间的混合物可获得最佳结果。
注意：MP 可检测分子量大于 40 kDa 的蛋白质。因此，分子量小于 40 kDa 的抗原样品浓度可超过典型的 50 nM 上限。然而，当浓度高于约 100 nM 时，即使是低分子量抗原也可能影响图像质量及 Kd 测定的准确性。 - 按照步骤 2.3 中计算的最终检测浓度，配制 50 µL 抗原-抗体混合液。
注意：进行 Kd 测定仅需一种抗原-抗体混合样品。但配制多种不同抗原/抗体比例的样品有助于优化浓度。若收集多个样品的数据，可通过全局拟合进行分析。 - 将抗原-抗体混合液在室温下孵育约 10 分钟，使结合反应达到化学平衡。避免不必要的长时间孵育。
注意：孵育时间可能因结合动力学而异。为确认是否达到化学平衡，可在不同孵育时间重复测量样品。Kd 值不随时间变化表明孵育时间已足够。过长的孵育可能导致蛋白质显著吸附于塑料实验器皿表面，从而引起蛋白浓度测定的显著误差。因此，强烈建议在 MP 样品制备中使用低吸附性实验耗材13。
3. 收集质量光度数据
- 在 MP 仪器的物镜上滴加一滴显微镜浸油，并将组装好的流动室放置在显微镜载物台上。确保油完全覆盖盖玻片与物镜之间的间隙。
- 加载流动室并聚焦质量光度计。
- 在第 1 步制备的流动室通道一端加入 10 µL 干净且经过滤的缓冲液。液体将通过毛细作用进入通道。
- 调节载物台的 Z 轴位置，使显微镜聚焦于 24 × 50 mm 盖玻片的工作表面。
- 在数据采集软件的 聚焦控制 选项卡中，使用粗调载物台移动的 向上 和 向下 按钮进行初步调节。
- 点击 清晰度 按钮以显示清晰度信号读数，并使用精细调节的 向上 和 向下 按钮将 清晰度 值最大化。
- 点击 设置聚焦 和 锁定聚焦 按钮以激活聚焦跟踪功能。正确聚焦的图像（图 1A,C）其“信号”值应低于 0.05%。
注意：若在最大清晰度位置时“信号”值高于 0.05%，可能表明玻璃表面或缓冲液中存在杂质。
- 使用同一通道，在通道一端加入 20 µL 抗体-抗原样品，并用一小片吸水纸从另一端吸去液体（图 2D）。
注意：宽度为 3–5 mm 的通道体积约为 10 µL。建议使用额外样品体积以完全置换通道中的缓冲液，避免样品被稀释。 - 加载样品后，立即点击 记录 按钮开始数据采集，获取一段 100 秒的视频（图 1D）。
- 数据采集结束后，输入文件名并点击 确定 以保存数据文件。
- 丢弃盖玻片，并用浸有异丙醇的棉质光学擦拭棒清洁物镜上的浸油。
注意：此处可暂停实验流程。
4. 分析微塑料数据
- 使用 MP 数据处理软件处理采集的视频文件，以识别着陆事件。
- 使用 文件/打开 菜单选项加载待分析文件，然后点击 分析。
- 点击 加载 按钮以载入校准函数，并通过 文件/另存结果为 菜单选项保存分析后的数据。
- 使用高斯函数拟合分子量分布，以获得样品中各组分的相对浓度。该分析可使用常见的科学绘图软件完成（参见 材料表）。
- 将“eventsFitted.csv”文件导入软件中，并使用 绘图/统计/直方图 功能绘制分子量分布（对应 .csv 文件中的 M 列）。
- 双击直方图以打开 绘图属性 窗口。关闭自动分组功能，并选择 2.5 kDa 的组距。点击 应用 和 确定 按钮，生成 组中心 和 计数 数据。
- 选中 组中心 和 计数 两列，使用 分析/峰与基线/多峰拟合 菜单功能，以高斯函数对直方图进行拟合。双击以在分布图上标出各峰的大致位置，然后点击 打开 NLFit 按钮。
- 勾选“xc”峰中心参数的 固定 复选框，并将其值设置为游离抗体以及单、双抗原-抗体复合物的预期分子量。对宽度参数勾选 共享 选项。点击 拟合 按钮。高斯组分的拟合峰高值代表样品中各组分的相对浓度11。
注：可调整组距以优化分子量分布图的分辨率。MP 的精度极限约为 1 kDa，过小的组距可能放大分布噪声，而不会提供额外信息；过大的组距则会掩盖分子量分布的细微特征。
- 使用以下公式计算各样品组分的浓度分数：
其中 hi 和 fi 分别表示样品中游离抗体以及单结合态和双结合态抗体的峰高和浓度分数。
5. 计算平衡常数数值
- 将第4.3步中计算得到的相互作用物种的浓度分数，使用合适的分析软件，按照公式1和公式2进行拟合。本文以电子表格软件为例，演示计算平衡常数的方法14 （参见 补充信息).
- 打开“Kd calculation.xlsx”工作表。在此工作表中，第1至第10行中以黄色高亮显示的单元格数值可进行修改，以执行平衡常数的计算。
- 输入估算值 Kd 将纳摩尔单位的数值输入表格中的 B1 和 B2 单元格。这些初始值将在拟合过程中进行优化。如果估计的 Kd 若未知具体数值，请保持 B1 和 B2 单元格中的默认值不变。
- 输入（cAb)总 以及（c银)总 以纳摩尔为单位将数值输入到 D2 和 E2 单元格中。将步骤 4.3 中计算得到的分数值输入到 F2、G2 和 H2 单元格中。如果测量了不同浓度比例的多个样品，可将这些样品获得的额外浓度值输入到第 2 至第 10 行中。
- 选择 数据/求解器 菜单功能。在“设置目标”框中输入“$B$15”，在“可变单元格”框中输入“$B$1:$B$2”。选择 分钟 单选按钮用于 致： 选项。检查 使无约束变量为非负数 复选框并选择 GRG 非线性 作为解决方法。点击 解决 按钮。最佳拟合 Kd1 和 Kd2 B1 和 B2 单元格将显示数值，B15 单元格将显示误差平方和的最终结果。
注意：如果 求解器 功能未激活，请选择 选项 在……之下 文件 电子表格程序中的菜单。在 加载项 类别选择 求解器加载项 在……之下 非活动的应用程序加载项 并点击 开始 按钮。检查 求解器加载项 复选框并单击 好的.
图1：质量光度图像。（A）在洁净盖玻片上采集的成像缓冲液的代表性天然状态图像，以及（B）在表面有缺陷的盖玻片上采集的图像。（C）成像缓冲液的差分比值图像，以及（D）AHT·HT 溶液的差分比值图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：微囊泡（MP）流动室的制备与加样。（A）清洗步骤中盖玻片的固定位置。（B）将24 × 24 mm盖玻片（中间层）和双面胶带（顶层）在铝箔表面（底层，未显示）上对齐。蓝色虚线表示切割线位置。（C）组装完成的流动室的俯视图和侧视图，包含两个样品通道，以及组装后流动室的实际照片。（D）将样品加入预先充满缓冲液的流动通道的操作流程。请点击此处查看该图的放大版本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们先前使用基于 MP 的检测方法研究了人α凝血酶（HT）与小鼠抗人凝血酶单克隆抗体（AHT）之间的相互作用11。由于 HT 的分子质量（37 kDa）低于 40 kDa 的检测限，因此样品的最大浓度可以在不影响质量分布分辨率的前提下超过 50 nM 的 MP 浓度限制。本实验设计为滴定系列，其中 AHT 抗体浓度固定为 25 nM，HT 的浓度分别为 7.5 nM、15 nM、30 nM、60 nM 和 120 nM。图3展示了抗原-抗体混合物以及仅含抗体样品的分子质量分布。本文采用本方案中描述的方法对数据进行分析。使用科学绘图软件将质量分布拟合为三个高斯组分，分别代表游离的 AHT、AHT·HT 和 AHT·HT2。三个组分的已知分子质量值被固定，并对三种物种使用单一的峰宽参数进行拟合。通过公式 3 对高斯组分的最佳拟合峰高参数进行归一化处理，以获得各物种的浓度分数（表1）。这些数值连同每个样品中抗体和抗原的总浓度被输入至“Kd calculation.xlsx”文件中。...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的基于质量光度法（Mass Photometry）的实验方案提供了一种快速且准确测定抗原-抗体结合亲和力的方法。质量光度分析仅需极少量样品，且可从同一组数据中获取其他信息，包括化学计量比、寡聚状态和样品纯度（图5）。在无需修改的情况下，该方法适用于解离常数在约5 nM至500 nM范围内、且配体分子质量约为20 kDa或更大的结合反应测定。相同的实验流程不仅可用于分析抗原-抗体结合，还可用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力，前提是至少一个结合组分的分子质量大于50 kDa。由于质量光度检测无特异性，因此不能在含有高浓度载体蛋白或大分子杂质的样品中进行MP测量。
表面等离子体共振（SPR）常用于抗原-抗体结合的表征，直接比较这两种方法有助于实验方案的选择。与SPR相比，磁珠（MP）结合实验速度更快，且无需进行蛋白质固定化。在典型的结合实验中，MP所需的样品量少于SPR。MP数据可揭示复合物的化学计量关系，而该信息难以直接从SPR10,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Keir Neuman 对手稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NHLBI）院内项目资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AcquireMP | Refeyn | MP 数据采集软件 | |
| 抗人凝血酶抗体 | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| 棉签 | Thorlabs | CTA10 | 用于镜头清洁的棉质光学棉签 |
| 盖玻片 24×24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| 盖玻片 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP 数据处理软件 | |
| 镊子 | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | 软头镊子，用于操作盖玻片 |
| 人α-凝血酶 | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| 浸油 | Thorlabs | MOIL-30 | |
| 异丙醇 | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| OneMP | Refeyn | 质谱光度计仪器 | |
| Origin | OriginLab | 科学绘图软件 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10 倍浓缩液 |
| 注射器滤器 | Millipore | SLGSR33SS | 用于缓冲液和样品过滤 |
参考文献
- Francis, R. J., et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours. British Journal of Cancer. 87 (6), 600-607 (2002).
- van Dyck, C. H. Anti-Amyloid-beta Monoclonal Antibodies for Alzheimer's Disease: Pitfalls and Promise. Biological Psychiatry. 83 (4), 311-319 (2018).
- Vennepureddy, A., Singh, P., Rastogi, R., Atallah, J. P., Terjanian, T. Evolution of ramucirumab in the treatment of cancer - A review of literature. Journal of Oncology Pharmacy Practice. 23 (7), 525-539 (2017).
- Waldmann, T. A. Immunotherapy: past, present and future. Nature Medicine. 9 (3), 269-277 (2003).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Rosenberg, M. I. Protein Analysis and Purification. , Birkhauser. Basel. (2005).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van Kim, C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: Retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Khan, S. H., Farkas, K., Kumar, R., Ling, J. A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance. Analytical Biochemistry. 421 (2), 385-390 (2012).
- Lofgren, J. A., et al. Comparing ELISA and surface plasmon resonance for assessing clinical immunogenicity of panitumumab. The Journal of Immunology. 178 (11), 7467-7472 (2007).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575(2020).
- Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
