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方法文章

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

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DOI：

10.3791/61786

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2021年11月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。

摘要

质谱技术的最新进展已实现了深度蛋白质组学 分析，并生成了 稳健且 可重复的数据集。然而，尽管技术上取得了显著进步，从患者血液、脑脊液（CSF）和组织等生物样本中进行样品制备仍然面临诸多挑战。在生物标志物的鉴定中，组织蛋白质组学通常提供了一种极具吸引力的样本来源，有助于将基础研究成果转化为临床应用。该方法可揭示用于癌症以及阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病早期诊断的潜在候选生物标志物。此外，组织蛋白质组学还能基于蛋白质丰度提供丰富的系统性信息，有助于解答重要的生物学问题。

定量蛋白质组学分析可分为两大类：基于标记的方法和非标记方法。在基于标记的方法中，蛋白质或肽段通过稳定同位素（如SILAC，即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）或化学标签（如ICAT，即同位素编码亲和标签；TMT，即串联质谱标签；或iTRAQ，即用于相对和绝对定量的同量异位标签）进行标记。基于标记的方法具有蛋白质定量更准确的优势，并且使用同量异位标签时，可在单次实验中同时分析多个样本。非标记方法则为基于标记的方法提供了一种成本效益更高的替代方案。可对属于特定队列的数百个患者样本进行分析，并根据临床特征与其他队列进行比较。本文描述了一种针对组织样本优化的定量蛋白质组学工作流程，结合了非标记和基于标记的蛋白质组分析方法，这对于生命科学领域的应用，尤其是基于生物标志物发现的研究项目至关重要。

引言

蛋白质组学技术有望实现对潜在候选标志物的鉴定与定量，从而有助于疾病的检测与预后评估1。质谱技术领域的最新进展已 加速了蛋白质水平的临床研究。研究人员正尝试利用基于质谱的蛋白质组学方法应对多种疾病复杂病理生物学的挑战，该技术目前在蛋白质鉴定与定量方面具有更高的灵敏度2。准确的蛋白质定量对于理解健康个体与患病个体中蛋白质之间动态且空间特异性的协同作用至关重要3；然而，在全蛋白质组范围内开展此类分析并非易事。

临床样本蛋白质组学分析的一个主要局限在于生物样本的复杂性。已有多种不同类型的样本被用于疾病蛋白质组学的研究，例如细胞系、血浆和组织4,5细胞系被广泛用作研究模型 体外 模拟疾病进展的不同阶段的实验。然而，细胞系的一个主要局限性在于，其在细胞培养过程中容易获得基因型和表型的改变6体液（如血浆）可能是生物标志物发现的有吸引力来源；然而，由于血浆中蛋白质丰度高且蛋白浓度动态范围大，血浆蛋白质组学研究具有一定的挑战性7在此情况下，即使质荷比相同，来自丰度较高蛋白质的肽段也可能抑制来自丰度较低蛋白质的肽段信号6尽管近年来在耗竭和分级技术方面取得了一些进展，但实现良好的覆盖度仍然是血浆蛋白质组学的主要局限性8,9. 对疾病生物学进行蛋白质组学研究时，优先使用组织样本，因为组织样本最接近疾病发生部位 并提供丰富的生理和病理信息，以更深入地揭示疾病生物学机制10,11.

在本论文中，我们提供了一种用于组织样本定量蛋白质组学的简化实验方案。我们采用含有8 M尿素的缓冲液制备组织裂解液，因为该缓冲液适用于基于质谱的分析。然而，在将肽段注入质谱仪之前，必须对其进行纯化以去除盐分。需要特别注意的一点是，在加入胰蛋白酶进行蛋白质消化之前，必须将尿素浓度降低至1 M以下，因为在8 M尿素浓度下胰蛋白酶的活性较低。我们介绍了两种定量全局蛋白质组学的方法：基于标签的定量（使用iTRAQ，即相对与绝对定量同重标记技术）和非标记定量（LFQ）。基于iTRAQ的定量蛋白质组学主要用于比较不同生物学状态下的多个样本（例如正常与疾病样本，或处理前后样本）。该方法利用同重试剂对肽段的N端伯胺进行标记12。iTRAQ试剂包含一个N-甲基哌嗪报告基团、一个平衡基团，以及一个可与肽段N端伯胺发生反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团13。来自每种实验条件的消化后肽段分别用特定的iTRAQ试剂进行标记。标记完成后终止反应，并将来自不同条件的标记肽段混合至同一管中。该合并后的样品混合物通过质谱仪进行分析，以实现蛋白质的鉴定与定量。在MS/MS分析后，会产生低分子质量的报告离子片段，这些报告离子的信号强度被用于蛋白质的定量分析。

另一种方法是无标记定量，用于在不使用稳定同位素标记肽段的情况下，确定复杂样品中蛋白质的相对数量。

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方案

本研究已通过印度孟买印度理工学院机构审查委员会和伦理委员会（IITB-IEC/2016/026）的审查和批准。患者/参与者已签署书面知情同意书，同意参加本研究。

1. 组织裂解液的制备

注意：为保持蛋白酶失活，所有以下步骤均需在冰上操作。确保手术刀及所用离心管均为无菌状态，以避免任何交叉污染。

  1. 取约 30 mg 组织放入珠磨管中，加入 200 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋混匀。
    注意：本研究中采用新鲜冷冻的人脑肿瘤组织进行裂解液制备。该方案可用于任何新鲜冷冻组织，但需根据组织类型（软组织或硬组织）及细胞复杂性进行适当调整。
  2. 随后，短暂离心使组织沉淀，用移液器小心吸除 PBS。若组织中仍有血液残留，可再进行一次 PBS 洗涤。
  3. 加入 300 µL 尿素裂解缓冲液（8 M 尿素，50 mM Tris pH 8.0，75 mM NaCl，1 mM MgCl2），并根据制造商说明书添加蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。
    注意：裂解缓冲液的体积应足以在超声处理过程中充分研磨组织并悬浮提取物。裂解缓冲液过少可能导致组织裂解不充分，而过多则会稀释蛋白裂解液。
  4. 将管子置于冰上，以 40% 振幅超声处理 2.5 分钟，脉冲循环为 5 秒（开启/关闭）。
  5. 向管中加入氧化锆珠，使用珠磨仪在冰上均质化组织，运行 90 秒，随后冰上孵育 5 分钟。重复此步骤两次。
  6. 组织充分均质化后，将管子置于冰上孵育 10 分钟。
  7. 孵育结束后，在 4 °C 条件下以 6,018 × g 离心 15 分钟，以分离细胞碎片与上清液。
  8. 收集上清液至新的标记管中，分装后于 -80 °C 保存，以备后续使用。

2. 组织裂解液的蛋白质定量与质量检测

  1. 使用 Bradford 试剂定量组织裂解液中的蛋白质浓度，具体操作见补充文件 1。
  2. 完成蛋白质定量后，取 10 µg 组织裂解液在 12% SDS-PAGE 凝胶上电泳，以检测裂解液质量。
    ​注意：只有通过质量检测的裂解液方可进行后续实验步骤。

3. 蛋白质的酶解消化

注意：酶消化的步骤如图1a所示。

  1. 消化时，取 50 µg 蛋白质，加入 ddH2O 将体积补至 20 µL。
  2. 使用储存液（0.5 M TCEP）配制 20 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP），取 0.8 µL 储存液加入蛋白裂解液中，以还原蛋白质中的二硫键，并将样品在 37 °C 下孵育 60 分钟。
  3. 用 ddH2O 配制 40 mM 碘乙酰胺（IAA），加入 1.6 µL 以烷基化还原后的半胱氨酸残基。室温下避光孵育 10 分钟。
  4. 加入稀释缓冲液（含 25 mM Tris pH 8.0 和 1 mM CaCl2），按 1:8 的比例稀释，使样品中尿素浓度低于 1 M。此时应检测 pH 值。
    注意：若使用胰蛋白酶作为消化酶，务必确保尿素浓度低于 1 M。
  5. 进行消化时，按酶/底物比例 1:50 加入胰蛋白酶。将反应管置于 37 °C 摇动干浴器中孵育 16 小时，以完成过夜消化。
    注意：胰蛋白酶是一种高活性的蛋白酶，易发生自消化。操作时需格外小心，并在冰上迅速完成加样。
  6. 孵育 16 小时后，使用真空浓缩仪将消化后的肽段干燥。

4. 消化后肽段的脱盐

注意：进行肽段除盐时，使用 C18 阶段尖端小柱。

  1. 加入 50 µL 甲醇以活化 C18 Stage Tip。在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。弃去收集在管底的滤液。重复此步骤两次。
  2. 加入 50 µL 含 0.1% 甲酸的乙腈以洗涤 Stage Tip。在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。弃去收集在管底的滤液。重复此步骤两次。
  3. 加入 50 µL 0.1% (v/v) 甲酸以平衡色谱柱。再次在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟，并弃去滤液。
  4. 将干燥的消化后肽段重新溶解于 50 µL 0.1% 甲酸中。
    注意：样品通过 Stage Tip 时应避免产生气泡。离心过程中 Stage Tip 不应完全干燥，因为干燥可能导致肽段损失。
  5. 将重新溶解的肽段加入已活化的 Stage Tip 中，并在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟使样品通过。至少重复此步骤四次。将穿流液储存在 4 °C。
  6. 为洗涤样品，加入 50 µL 0.1% (v/v) 甲酸。重复离心步骤，并弃去滤液。
  7. 为洗脱肽段，加入 50 µL 含 0.1% 甲酸的 40% (v/v) 乙腈，通过离心使其流经 Stage Tip。将滤液收集至新的离心管中。依次使用含 0.1% 甲酸的 50% 和 60% 乙腈重复该步骤，并将滤液收集至同一新管中。
  8. 使用真空浓缩仪将新管中收集的脱盐肽段干燥。
    ​注意：干燥后的脱盐肽段可直接用于进样，或可在 -20 °C 下保存 6 个月。对于长期保存（>6 个月），应将肽段储存在 -80 °C。

5. 脱盐肽段的定量

  1. 用 0.1% 甲酸（FA）重新溶解干燥的脱盐肽。
  2. 使用 70% 乙醇和无尘纸擦拭光度测量板。
  3. 使用 2 µL 的 0.1% FA 设置空白对照。
  4. 将 2 µL 重悬后的样品以重复方式点加到测量板上。
  5. 将测量板放入分光光度计中，在 205 nm 和 280 nm 处测定吸光度。
  6. 使用以下公式计算摩尔吸光系数（ε）：
    ε = 27 / [1 - 3.85 × A280 / A205]
    注：摩尔吸光系数（ε）是衡量电子跃迁概率或物质对入射辐射特定波长吸收能力的指标。ε 值应在 31 mL mg-1cm-1 至 33 mL mg-1cm-1 范围内。若该值不在该范围内，表明样品未被充分消化。
  7. 使用以下公式计算肽的浓度（单位为 µg/µL）：
    肽浓度 = 净吸光度（205）/ 0.051 × ε

6. 消化肽段的无标记定量（LFQ）

注意：对于无标记定量，使用液相色谱和质谱参数中提到的参数 补充文件 2当同一样品类型的三个生物学重复在质谱仪中进行检测时，获得了高覆盖度的数据。

  1. 液相色谱装置
    1. 在去盐肽段定量后，取2 µg肽段置于离心管中，用0.1%甲酸（FA）定容至10 µL，所得去盐肽段浓度为200 ng/µL。
    2. 打开液相色谱系统的自动进样器（参见 材料表）并将小瓶放入自动进样器中。
    3. 使用0.1%（v/v）FA平衡预柱和分析柱。
    4. 从离心管中取1 µg脱盐后的消化肽段，上样至色谱柱中。
    5. 根据样本复杂性设置液相色谱梯度。本实验中，组织样本的非标记定量采用了120分钟的液相色谱梯度。
  2. 质谱仪设置：在优化任何蛋白质组学检测之前，使用适用于系统适用性分析的软件，通过监测牛血清白蛋白（BSA）的若干肽段并分析BSA的覆盖度，对仪器进行质量控制检查（图2A，B）。使用质谱数据采集软件在仪器中设置采集参数（参见 材料清单).
    1. 打开软件，双击 仪器设置 并从“肽段鉴定”模板中选择默认参数。
    2. 使用以下参数设置质谱仪 补充文件 2 和 保存 作为一种新方法
    3. 现在，打开软件以填写样品信息；双击 序列设置，填写样品类型、样品名称、文件保存位置、仪器方法文件、进样体积以及样品位置等详细信息。
    4. 所有信息填写完毕后，选中该行并开始 运行.

7. 消化肽段的基于标签的定量（iTRAQ）

注意：可使用不同的同重标签（如 iTRAQ 或 TMT 试剂等）进行基于标签的定量分析。此处使用 iTRAQ 4-plex 对三个组织样本的消化肽段进行标记。以下介绍了 iTRAQ 4-plex 标记的操作步骤。

  1. 使用 iTRAQ 试剂标记消化后的肽段。
    注意：本实验中使用了三个组织样本的肽段。从每个组织样本中取 80 µg 消化后的肽段，分装至四个管中，分别用 iTRAQ 试剂（114、115、116 和 117）进行标记（详细实验参数见补充文件 3）。
    1. 使用 iTRAQ 试剂前，将每支试剂小瓶恢复至室温（约 5 分钟），短暂离心约 30 秒，使溶液沉降至各小瓶底部。
      注意：确保每支小瓶中含有 10–15 µL 溶液。
    2. 进行 iTRAQ 标记时，将干燥的肽段用 iTRAQ 标记试剂盒中提供的溶解缓冲液重新溶解于 20 µL 中。
    3. 向试剂盒提供的小瓶中加入 70 µL 乙醇，溶解标签试剂，混匀 30 秒，然后离心 10 秒。
      注意：建议所有步骤均按照制造商的说明进行操作。
    4. 将均匀混合的 iTRAQ 标签试剂（114、115、116 和 117）分别加入含有对应肽段样品的管中，进行标记反应。
    5. 通过涡旋振荡 30 秒混合各管内容物，然后离心 10 秒，使混合液重新沉降至管底。
      注意：使用 pH 试纸检测溶液 pH 值，pH 应大于 8；若不足，可加入最多 10 µL 溶解缓冲液调节 pH。
    6. 将各管在室温下孵育 90 分钟。反应结束后，加入质谱级水以淬灭管中未反应的过量标签试剂。
    7. 将各管在室温下继续孵育 30 分钟至 1 小时。
    8. 孵育结束后，将所有标记完成的样品转移至同一管中，并在真空浓缩仪中干燥标记后的肽段。
      注意：TMT 标记可采用类似的标记流程。
  2. 液相色谱设置
    1. 将样品用 0.1% 甲酸重新溶解，打开纳米液相自动进样器，将样品放入自动进样器中。液相色谱设置参数详见补充文件 2。
    2. 根据样品复杂程度设置液相梯度。本实验中，对组织样本进行基于标签的定量（iTRAQ）时采用了 180 分钟的液相梯度。
      注意：对于复杂度较低的样品，较短梯度即可有效分离大多数肽段；若样品非常复杂，则应使用更长梯度以实现更好的肽段分离效果。
  3. iTRAQ 技术的质谱设置
    1. 除碰撞能量设置为 35% 用于基于标签定量的 MS/MS 碎裂外，其余所有质谱参数均与非标记定量所用参数相同。

8. 数据分析

  1. 使用商业化的分析软件（参见材料表）分析从液相色谱-质谱仪获得的原始（MS/MS谱图）文件。
    注意：采用Uniprot提供的包含71,785条蛋白质序列的人类参考蛋白质组数据库（UP000005640），通过Sequest HT和Mascot（v2.6.0）搜索引擎鉴定蛋白质。无标记定量和基于标记的定量参数详见补充文件4。

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结果

我们采用了两种不同的方法进行发现型蛋白质组学研究：非标记和基于标记的蛋白质组学方法。组织样本在SDS-PAGE上的蛋白质谱显示了完整的蛋白质，可用于蛋白质组学分析。图 2A）。仪器的质量控制检查已进行监测 通过 系统适用性软件，显示了仪器性能的每日变化情况（图2B）。在30分钟的液相色谱梯度中，我们观察到BSA样品的序列覆盖率达91%（图 2C）。LC梯度使用500 ng商业HeLa细胞消化液进行优化，在2小时梯度中检测到2425种蛋白质，而1小时梯度中检测到1488种蛋白质（图2D). 在一个组织样本池的三次技术重复中，我们平均能够鉴定出 2428 种蛋白质（图 2E).

将优化后的液相色谱和质谱参数应用于三种不同的生物组织样本（

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讨论

生物样本的组织蛋白质组学使我们能够探索与疾病进展不同阶段相关的新潜在生物标志物，同时揭示与疾病进展相关的信号传导机制和通路。本文所述的组织定量蛋白质组学分析方案可提供可重复且覆盖度良好的数据。大部分步骤已根据制造商说明书进行优化。为了获得高质量的数据，以下步骤尤为关键，因此在执行这些步骤时应格外谨慎。

蛋白质消化不完全以及角蛋白污染可能导致蛋白质覆盖度降低（n < 1000），从而影响整体实验结果。样品的 pH 值（pH 8）以及样品中尿素的浓度（低于 1 M）将确保蛋白质高效消化。使用新鲜缓冲液并小心处理样品可减少角蛋白污染的可能性。iTRAQ 试剂成本极高，且需要复杂的质谱平台进行 MS/MS 分析以及相应的软件进行数据解析。蛋白质组学实验对盐类污染、肽段定量以及 iTRAQ/TMT 试剂的标记效率非常敏感。在进行 MS/MS 分析前，应确保消化后的肽段经过充分脱盐，以降低数据中的背景噪音。在 iTRAQ 技术中，连接标签的断裂会产生低分子质量的报告离子，可用于对肽段及其来源蛋白质进行相对定量；而在无标记方法中，则采用色谱峰面积（曲线下的面积）进行定量。为了提高蛋白质定...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），项目编号#34_IITB，对SS的资助，以及印度理工学院孟买分校MASSFIITB设施在生物技术部（BT/PR13114/INF/22/206/2015）支持下开展所有质谱相关实验所提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
乙腈（质谱级）Fisher ScientificA/0620/21
牛血清白蛋白HiMediaTC194-25G
氯化钙Fischer ScienificBP510-500
甲酸（质谱级）Fisher Scientific147930250
碘乙酰胺Sigma1149-25G
异丙醇（质谱级）Fisher ScientificQ13827
氯化镁Fischer ScienificBP214-500
甲醇（质谱级）Fisher ScientificA456-4
质谱级水Pierce51140
磷酸盐缓冲液HiMediaTL1006-500ML
蛋白酶抑制剂混合物Roche Diagnostics11873580001
氯化钠MerckDF6D661300
TCEPSigma646547
Tris碱Merck648310
胰蛋白酶（质谱级）Pierce90058
Bradford试剂Bio-Rad5000205
尿素MerckMB1D691237
耗材
Hypersil Gold C18色谱柱Thermo25002-102130
微量移液器GilsonF167380
Stage tipsMilliPoreZTC18M008
氧化锆/二氧化硅珠BioSpec products11079110z
设备
珠磨仪（匀浆器）Bertin MinilysP000673-MLYS0-A
微孔板读数仪（分光光度计）ThermoMultiSkan Go
pH计EutechCyberScan pH 510
探头式超声破碎仪Sonics Materials, IncVCX 130
振荡干浴器Thermo88880028
Orbitrap Fusion质谱仪ThermoFSN 10452
纳米液相色谱系统ThermoEASY-nLC1200
真空浓缩仪ThermoSavant ISS 110
软件
Proteome DiscovererThermoProteome Discoverer 2.2.0.388

参考文献

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