基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

摘要

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。

摘要

质谱技术的最新进展已实现了深度蛋白质组学 分析，并生成了 稳健且 可重复的数据集。然而，尽管技术上取得了显著进步，从患者血液、脑脊液（CSF）和组织等生物样本中进行样品制备仍然面临诸多挑战。在生物标志物的鉴定中，组织蛋白质组学通常提供了一种极具吸引力的样本来源，有助于将基础研究成果转化为临床应用。该方法可揭示用于癌症以及阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病早期诊断的潜在候选生物标志物。此外，组织蛋白质组学还能基于蛋白质丰度提供丰富的系统性信息，有助于解答重要的生物学问题。

定量蛋白质组学分析可分为两大类：基于标记的方法和非标记方法。在基于标记的方法中，蛋白质或肽段通过稳定同位素（如SILAC，即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）或化学标签（如ICAT，即同位素编码亲和标签；TMT，即串联质谱标签；或iTRAQ，即用于相对和绝对定量的同量异位标签）进行标记。基于标记的方法具有蛋白质定量更准确的优势，并且使用同量异位标签时，可在单次实验中同时分析多个样本。非标记方法则为基于标记的方法提供了一种成本效益更高的替代方案。可对属于特定队列的数百个患者样本进行分析，并根据临床特征与其他队列进行比较。本文描述了一种针对组织样本优化的定量蛋白质组学工作流程，结合了非标记和基于标记的蛋白质组分析方法，这对于生命科学领域的应用，尤其是基于生物标志物发现的研究项目至关重要。

引言

蛋白质组学技术有望实现对潜在候选标志物的鉴定与定量，从而有助于疾病的检测与预后评估¹。质谱技术领域的最新进展已 加速了蛋白质水平的临床研究。研究人员正尝试利用基于质谱的蛋白质组学方法应对多种疾病复杂病理生物学的挑战，该技术目前在蛋白质鉴定与定量方面具有更高的灵敏度²。准确的蛋白质定量对于理解健康个体与患病个体中蛋白质之间动态且空间特异性的协同作用至关重要³；然而，在全蛋白质组范围内开展此类分析并非易事。

临床样本蛋白质组学分析的一个主要局限在于生物样本的复杂性。已有多种不同类型的样本被用于疾病蛋白质组学的研究，例如细胞系、血浆和组织^4,5细胞系被广泛用作研究模型 体外 模拟疾病进展的不同阶段的实验。然而，细胞系的一个主要局限性在于，其在细胞培养过程中容易获得基因型和表型的改变⁶体液（如血浆）可能是生物标志物发现的有吸引力来源；然而，由于血浆中蛋白质丰度高且蛋白浓度动态范围大，血浆蛋白质组学研究具有一定的挑战性⁷在此情况下，即使质荷比相同，来自丰度较高蛋白质的肽段也可能抑制来自丰度较低蛋白质的肽段信....

方案

本研究已通过印度孟买印度理工学院机构审查委员会和伦理委员会（IITB-IEC/2016/026）的审查和批准。患者/参与者已签署书面知情同意书，同意参加本研究。

1. 组织裂解液的制备

注意：为保持蛋白酶失活，所有以下步骤均需在冰上操作。确保手术刀及所用离心管均为无菌状态，以避免任何交叉污染。

1. 取约 30 mg 组织放入珠磨管中，加入 200 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋混匀。
   注意：本研究中采用新鲜冷冻的人脑肿瘤组织进行裂解液制备。该方案可用于任何新鲜冷冻组织，但需根据组织类型（软组织或硬组织）及细胞复杂性进行适当调整。
2. 随后，短暂离心使组织沉淀，用移液器小心吸除 PBS。若组织中仍有血液残留，可再进行一次 PBS 洗涤。
3. 加入 300 µL 尿素裂解缓冲液（8 M 尿素，50 mM Tris pH 8.0，75 mM NaCl，1 mM MgCl₂），并根据制造商说明书添加蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。
   注意：裂解缓冲液的体积应足以在超声处理过程中充分研磨组织并悬浮提取物。裂解缓冲液过少可能导致组织裂解不充分，而过多则会稀释蛋白裂解液。
4. 将管子置于冰上，以 40% 振幅超声处理 2.5 分钟，脉冲循环为 5 秒（开启/关闭）。
....

结果

我们采用了两种不同的方法进行发现型蛋白质组学研究：非标记和基于标记的蛋白质组学方法。组织样本在SDS-PAGE上的蛋白质谱显示了完整的蛋白质，可用于蛋白质组学分析。图 2A）。仪器的质量控制检查已进行监测 通过 系统适用性软件，显示了仪器性能的每日变化情况（图2B）。在30分钟的液相色谱梯度中，我们观察到BSA样品的序列覆盖率达91%（图 2C）。LC梯度使用500 ng商业HeLa细胞消化液进行优化，在2小时梯度中检测到2425种蛋白质，而1小时梯度中检测到1488种蛋白质（图2D). 在一个组织样本池的三次技术重复中，我们平均能够鉴定出 2428 种蛋白质（图 2E).

将优化后的液相色谱和质谱参数应用于三种不同的生物组织样本（

讨论

生物样本的组织蛋白质组学使我们能够探索与疾病进展不同阶段相关的新潜在生物标志物，同时揭示与疾病进展相关的信号传导机制和通路。本文所述的组织定量蛋白质组学分析方案可提供可重复且覆盖度良好的数据。大部分步骤已根据制造商说明书进行优化。为了获得高质量的数据，以下步骤尤为关键，因此在执行这些步骤时应格外谨慎。

蛋白质消化不完全以及角蛋白污染可能导致蛋白质覆盖度降低（n < 1000），从而影响整体实验结果。样品的 pH 值（pH 8）以及样品中尿素的浓度（低于 1 M）将确保蛋白质高效消化。使用新鲜缓冲液并小心处理样品可减少角蛋白污染的可能性。iTRAQ 试剂成本极高，且需要复杂的质谱平台进行 MS/MS 分析以及相应的软件进行数据解析。蛋白质组学实验对盐类污染、肽段定量以及 iTRAQ/TMT 试剂的标记效率非常敏感。在进行 MS/MS 分析前，应确保消化后的肽段经过充分脱盐，以降低数据中的背景噪音。在 iTRAQ 技术中，连接标签的断裂会产生低分子质量的报告离子，可用于对肽段及其来源蛋白质进行相对定量；而在无标记方法中，则采用色谱峰面积（曲线下的面积）进行定量。为了提高蛋白质定.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
乙腈（质谱级）	Fisher Scientific	A/0620/21
牛血清白蛋白	HiMedia	TC194-25G
氯化钙	Fischer Scienific	BP510-500
甲酸（质谱级）	Fisher Scientific	147930250
碘乙酰胺	Sigma	1149-25G
异丙醇（质谱级）	Fisher Scientific	Q13827
氯化镁	Fischer Scienific	BP214-500
甲醇（质谱级）	Fisher Scientific	A456-4
质谱级水	Pierce	51140
磷酸盐缓冲液	HiMedia	TL1006-500ML
蛋白酶抑制剂混合物	Roche Diagnostics	11873580001
氯化钠	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris碱	Merck	648310
胰蛋白酶（质谱级）	Pierce	90058
Bradford试剂	Bio-Rad	5000205
尿素	Merck	MB1D691237
耗材
Hypersil Gold C18色谱柱	Thermo	25002-102130
微量移液器	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
氧化锆/二氧化硅珠	BioSpec products	11079110z
设备
珠磨仪（匀浆器）	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
微孔板读数仪（分光光度计）	Thermo	MultiSkan Go
pH计	Eutech	CyberScan pH 510
探头式超声破碎仪	Sonics Materials, Inc	VCX 130
振荡干浴器	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion质谱仪	Thermo	FSN 10452
纳米液相色谱系统	Thermo	EASY-nLC1200
真空浓缩仪	Thermo	Savant ISS 110
软件
Proteome Discoverer	Thermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388