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利用HiBiT CRISPR细胞系进行靶向蛋白降解化合物的高通量细胞谱型分析

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DOI：

10.3791/61787

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2020年11月9日

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1Promega Corporation

本文内容

摘要

本方案描述了利用CRISPR/Cas9技术改造的活细胞中目标蛋白降解动力学的定量发光检测方法，这些细胞表达经基因编辑后融合于目标蛋白的无抗体依赖性内源蛋白检测标签。文中包含计算和获取定量降解参数的详细步骤，包括降解速率、Dmax、DC50 和 Dmax50。

摘要

靶向蛋白质降解化合物，包括分子胶或蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），是小分子药物发现中一种令人振奋的新型治疗模式。这类化合物通过将靶蛋白与E3连接酶机器蛋白拉近至邻近位置，从而诱导靶蛋白降解，进而通过泛素-蛋白酶体途径（UPP）实现靶蛋白的泛素化并最终降解。然而，鉴于实现蛋白质降解所涉及的细胞通路复杂性，以高通量方式对靶蛋白降解进行分析仍然极具挑战性。本文介绍了一种基于CRISPR/Cas9技术对靶蛋白进行内源性标记的实验方案和筛选策略，该方法使用11个氨基酸组成的HiBiT标签，其可与LgBiT蛋白高亲和力互补，形成具有发光活性的蛋白。这些经CRISPR编辑、带有内源性标签的细胞系可用于实时、动力学活细胞或终点裂解模式下，通过基于微孔板的发光检测仪监测发光信号，来测定化合物诱导的蛋白质降解。本文概述了不同检测模式下的推荐筛选流程， 并描述了关键降解参数的计算方法，包括降解速率、Dmax、DC50、Dmax50，以及与细胞活力检测的多重联用。这些方法能够在保持靶蛋白在相关细胞背景下内源性表达和调控的同时，快速发现和筛选早期化合物，从而高效优化先导治疗化合物。

引言

靶向蛋白降解已成为小分子药物发现中发展最快的领域之一，这很大程度上得益于免疫调节类分子胶化合物（如IMiD）在癌症治疗中的临床成功，以及蛋白水解靶向嵌合体化合物在早期临床试验中展现出的积极数据1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。靶向蛋白降解化合物通过将目标蛋白与E3连接酶机器蛋白拉近而发挥作用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。这种化合物诱导的目标蛋白向E3连接酶的募集，导致目标蛋白通过泛素-蛋白酶体途径（UPP）发生泛素化并被降解1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。传统上，小分子药物发现的筛选项目依赖于初始的生化检测来评估活性并对化合物进行排序。然而，这对靶向蛋白降解剂而言构成了重大挑战，因为其最终活性——通过蛋白酶体实现的降解——依赖于一系列细胞内级联事件1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17,18。成功实现目标蛋白降解所涉及的多条通路及蛋白复合物的复杂性，要求在早期筛选和化合物初筛阶段采用基于细胞的检测方法。目前，在细胞环境中以高通量方式监测目标蛋白降解的技术仍严重缺乏14。本文将介绍利用CRISPR/Cas9技术在内源位点标记HiBiT的靶细胞系，通过实时动力学活细胞检测或终点裂解细胞检测，以发光信号测定降解剂处理后目标蛋白水平变化的实验方案18,19,20，从而监测目标蛋白的减少情况10,11,18,19。

为了实现对治疗靶点的有效降解并扩展可成药蛋白质组，已涌现出多种降解策略和类型的降解剂，这些降解剂能够靶向广泛的蛋白质进行破坏，包括定位于细胞膜、溶酶体、线粒体膜、细胞质以及细胞核中的蛋白质21–57。目前研究最为广泛的两类化合物是分子胶（molecular glues）和蛋白靶向嵌合体（PROTACs）2,4,5,6,7,12,26。分子胶为单价分子，通常体积较小，在结合E3泛素连接酶组分后可促进靶蛋白形成新的蛋白-蛋白相互作用界面2,12,26。最常见的分子胶可结合Cereblon（CRBN）E3泛素连接酶组分2,12,26,55,56,57。然而，近年来也出现了令人振奋的新实例，利用其他E3泛素连接酶系统，如DCAF1558,59,60，以及通过CDK/Cyclin招募至DDB145，展示了此类化合物进一步拓展的潜力。相比之下，PROTACs是较大的双价分子，由一个靶蛋白结合配体（通常为抑制剂）通过化学连接子与E3泛素连接酶配体相连构成1,3,4,5,7,13。因此，这类化合物能够同时直接结合E3泛素连接酶和靶蛋白1,3,4,5,7,13。已有大量蛋白质被证明可通过这些双价分子实现降解，其中最常用的E3泛素连接酶配体主要招募CRBN或Von Hippel-Lindau（VHL）1,3,4,5,7,13。然而，用于蛋白水解靶向嵌合体设计中E3泛素连接酶招募的可用配体数量正在迅速增加，这不仅扩展了此类化合物的功能，还具备降解多种靶蛋白类别以及增强细胞或组织类型特异性的潜力24,48,61,62。加之降解化合物仅需最低限度地结合靶蛋白（即使亲和力较弱），在拓展可成药蛋白质组方面展现出广阔前景。

表征蛋白质降解过程中的细胞动态变化，以及治疗后潜在的蛋白质恢复情况，对于理解降解化合物的功能与功效至关重要。尽管可以通过蛋白质印迹抗体检测或质谱法在相关细胞体系中研究内源性蛋白质水平的变化，但这些方法难以适应高通量筛选模式，且定量能力有限，或无法在多个时间点测量动力学变化14。为应对这些挑战，我们开发了一种基于微孔板的细胞发光系统，用于监测内源性蛋白质水平的变化，该系统利用CRISPR/Cas9技术将11个氨基酸组成的HiBiT标签插入任意关键降解靶点的基因组位点18,19,20。该短肽可与其结合伴侣LgBiT高亲和力互补，在底物存在下产生强烈的发光信号18,19,20,63，从而使标记的内源性蛋白质在细胞或裂解液中具有发光特性18,19,20,63。使用发光仪测得的相对光单位（RLUs）与标记靶蛋白的水平成正比18,19,20,63。随着稳定型荧光素酶底物的开发，现已可在24至48小时的时间范围内实现蛋白质水平的实时动力学测量18,53,64。这使得能够针对任何给定靶点在任意化合物浓度下确定完整的降解谱，包括对初始降解速率、最大降解程度（Dmax）以及化合物处理后的恢复情况进行定量分析18,53。然而，若需对大量降解化合物文库进行筛选，也可在384孔板体系中于不同药物浓度和指定时间点便捷地进行终点分析。

本文所述的实验方案代表了靶向蛋白质降解化合物的细胞筛选策略，适用于所有类型的降解剂。然而，HiBiT CRISPR细胞系与这些方案的结合使用并不仅限于蛋白质降解研究，它们实际上是通用工具，可用于监测任何内源性靶蛋白水平的变化，从而在处理后研究化合物的影响，甚至探究耐药机制20,65,66。这些基于发光检测的方法的前提是使用CRISPR技术在基因组中内源性标记HiBiT的靶细胞系，这一点至关重要，因为它能够在维持内源性靶蛋白表达及天然启动子调控的同时，实现高灵敏度的发光检测18,19,20。近年来，在利用CRISPR/Cas9技术插入基因组标签方面已取得显著进展，尤其是在可扩展性20以及高灵敏度检测方面，应用形式多样，包括含有杂合或纯合等位基因插入的CRISPR文库或单克隆细胞系18,19,20。尽管可以使用在细胞中外源表达HiBiT或其他报告蛋白融合体的方法替代内源性标记，但在使用蛋白过表达系统时必须格外谨慎14,18。此类系统可能导致对化合物真实活性和蛋白恢复动力学的误解14,18，包括靶蛋白降解后可能激活的转录反馈环路。此外，低活性的早期化合物可能被遗漏，导致在筛选中出现假阴性结果。由于蛋白水平的降低可能源于化合物诱导的细胞毒性或细胞死亡，因此本文所述方案中包含了强烈推荐但非强制性的细胞活力发光或荧光检测，与降解实验并行进行。本方案分为两个主要部分：裂解终点检测和活细胞动力学筛选。在每一部分中，均提供了可在终点或动力学模式下进行多重细胞活力检测的选项。监测标记的内源性蛋白变化需要在细胞中引入LgBiT以实现互补。因此，动力学筛选部分引用了关于LgBiT引入的关键实验步骤，该步骤可通过瞬时或稳定表达实现，对于完成活细胞发光检测至关重要。本文介绍的所有方法均可实现对化合物的快速排序和活性评估，有助于早期化合物筛选工作，并加速先导降解剂的识别。

本方案旨在结合HiBiT CRISPR细胞系研究降解化合物。针对多个靶点的HiBiT CRISPR插入构建方案已在近期多项研究中详细描述18,19,20。

方案

1. 以裂解方式对HiBiT CRISPR靶蛋白进行终点降解研究，并可选进行细胞活力荧光分析

  1. 哺乳动物贴壁或悬浮细胞系的制备与接种
    1. 用适合传代和细胞生长的适当细胞培养基稀释，将细胞密度调整至 2.22 × 105/mL。
    2. 将细胞接种至培养板中，每种实验组和对照组至少设置3个复孔。在96孔白色培养板中，每孔加入90 µL细胞悬液（含20,000个细胞）。对于384孔板体系，向384孔白色培养板每孔加入36 µL细胞悬液（含8,000个细胞）。
  2. 化合物的制备与添加
    1. 在100% DMSO中配制系列稀释的PROTAC或降解剂测试化合物溶液，使其浓度为最终浓度的1,000倍。然后用细胞培养基将其稀释至最终浓度的10倍。向培养基中加入等体积的DMSO，作为无化合物DMSO对照。
    2. 对于96孔板体系，向90 µL细胞中加入10 µL的10倍浓度化合物或对照溶液。对于384孔板体系，向36 µL细胞中加入4 µL的10倍浓度化合物或对照溶液。
    3. 将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育所需时间，或在最适合细胞生长的条件下进行孵育。
      注：由于本实验为终点法检测，若需检测多个时间点，则需为每个时间点单独准备降解实验板，具体操作如上文步骤1.1.2所述。检测化合物介导的蛋白降解所需的孵育时间差异较大，且可能依赖于化合物浓度。建议初始检测时间点为6小时和24小时。
    4. 若仅进行终点化学发光检测而不进行可选的细胞活力检测，则直接进入下文步骤1.3。若需同时进行细胞活力检测的多重检测，则进入下一部分1.4。
  3. 细胞裂解检测
    1. 在进行HiBiT裂解检测前，立即通过向每1 mL裂解缓冲液中加入20 µL裂解底物和10 µL LgBiT蛋白，配制2倍浓度的裂解检测试剂。根据待检测的孔数配制足量的2倍检测试剂，并额外增加体积以补偿移液误差（例如，孔数 + 10%）。
    2. 将配制好的裂解检测试剂加入细胞中。对于96孔板体系，向每孔含100 µL细胞的孔中加入100 µL 2倍裂解检测试剂。对于384孔板体系，向每孔含40 µL细胞的孔中加入40 µL 2倍裂解检测试剂。将培养板置于微孔板涡旋混合器上，以350 rpm振荡混合10–20分钟。
    3. 使用能够读取96孔或384孔板化学发光信号的发光仪检测发光值。
  4. 可选：细胞活力多重检测
    注：本步骤使用市售的CellTiter-Fluor（CTF）试剂盒进行（参见材料表）。
    1. 在预定终点检测前30–40分钟，通过向2 mL检测缓冲液中加入10 µL底物，配制6倍浓度的细胞活力检测试剂溶液。根据待检测的孔数配制足量的6倍试剂，并额外增加体积以补偿移液误差（例如，孔数 + 10%）。
    2. 将配制好的试剂加入各孔中。对于96孔板体系，向已含有100 µL液体的每孔中加入20 µL 6倍试剂。对于384孔板体系，向每孔含40 µL细胞的孔中加入8 µL 6倍试剂。短暂涡旋混匀后，将培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟。
    3. 在预定的检测终点（即处理后6或24小时，参见步骤1.2.3），使用能够读取荧光信号（激发波长380–400 nmEx/发射波长505 nmEm）的仪器，在96孔或384孔板模式下检测荧光信号。
    4. 通过向每1 mL裂解缓冲液中加入20 µL裂解底物和10 µL LgBiT蛋白，配制2倍浓度的裂解检测试剂。根据待检测的孔数配制足量的2倍检测试剂，并额外增加体积以补偿移液误差（例如，孔数 + 10%）。
    5. 将配制好的裂解检测试剂加入各孔中。对于96孔板体系，向已含有120 µL液体的每孔中加入120 µL 2倍裂解检测试剂。对于384孔板体系，向已含有48 µL液体的每孔中加入48 µL 2倍裂解检测试剂。将培养板置于微孔板涡旋混合器上振荡混合10–20分钟。
    6. 使用能够读取96孔或384孔板化学发光信号的发光仪检测发光值。
  5. 降解率与细胞活力的定量分析
    1. 取在特定时间点测得的DMSO对照组相对光单位（RLU）的平均值，作为目标蛋白的基础水平，用于计算其他所有处理组在该时间点的相对降解比例。例如，若6小时时DMSO对照孔的平均RLU为10,000，而某一化合物处理组在6小时的RLU为5,000，则其降解比例计算为5,000 ÷ 10,000 = 0.5（公式1）。
      公式1：显示PROTAC实验中相对RLU计算的公式；即发光信号的比值。
    2. 根据相对RLU值计算降解百分比：
      公式2：静态平衡公式，(1 - 相对RLU)*100 = % 降解率，用于降解分析。
    3. 绘制特定时间点的相对RLU或降解百分比图，以比较不同化合物的活性排序。
    4. 可选地，通过将所有处理组的相对荧光单位（RFU）与DMSO对照组进行比较，分析细胞活力检测的数据。若发现任何处理组相对于DMSO对照组出现显著的RFU下降，则可进一步将蛋白降解数据归一化至细胞活力检测结果，以评估蛋白水平变化与细胞活力损失之间的关系。

2. HiBiT CRISPR 目标蛋白的实时动力学降解及可选的细胞活力发光检测

注意：进行动力学筛选和降解分析需要在细胞内共表达 LgBiT 蛋白，该方法此前已有描述18,19,63。可通过瞬时转染 LgBiT 载体、使用 BacMam LgBiT，或在 LgBiT 稳定细胞系中进行 HiBiT CRISPR 插入来实现。

  1. 贴壁细胞系的接种。
    1. 通过抽吸去除细胞培养瓶中的培养基，用DPBS洗涤细胞，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA解离细胞，并使细胞从培养瓶底部脱落。对于悬浮细胞系，请进入第2.2节。
    2. 使用含血清的细胞培养基中和胰蛋白酶，混匀以收集并重悬细胞，然后将细胞悬液转移至锥形管中。
    3. 在125 x g 条件下离心5分钟。弃去细胞培养基，并用等体积的新鲜细胞培养基重悬细胞。
    4. 将细胞接种至检测板中，每个实验组和对照组条件至少设置三个重复孔。对于96孔板，计数以估算细胞密度，调整密度至2 × 105 个细胞/mL的检测培养基中，每孔加入100 µL（即20,000个细胞）。对于384孔板，计数以估算细胞密度，调整密度至4.44 × 105 个细胞/mL的检测培养基中，每孔加入18 µL（即8,000个细胞）。
    5. 将检测板置于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜，或在适合细胞生长的最佳条件下孵育。
  2. 悬浮细胞的接种
    1. 将细胞密度调整为2.22 × 105 个细胞/mL，使用补充了10% FBS和1× Endurazine（母液试剂1:100稀释）的无CO2培养基。
    2. 将细胞接种至检测板中，每个实验组和对照组条件至少设置3个孔。对于96孔板，每孔加入90 µL（即20,000个细胞）。对于384孔板，每孔加入36 µL（即8,000个细胞）。
      注：对于信噪比（S:B）发光信号较低的悬浮细胞系，例如使用CRISPR文库而非单克隆时，可通过增加接种细胞数量来增强发光信号，最多可增至96孔板每孔100,000个细胞，或384孔板每孔40,000个细胞。
  3. 利用表达LgBiT的HiBiT CRISPR细胞进行动力学降解检测
    1. 对于已在接种步骤（2.2节）中加入Endurazine的悬浮细胞，可直接进入步骤2.3.3。对于贴壁细胞系，需配制Nano-Glo Endurazine溶液。对于96孔板，将母液试剂按1:100稀释于补充了10% FBS的无CO2培养基中，配制成1× Endurazine溶液。对于384孔板，将母液试剂按1:50稀释于补充了10% FBS的无CO2培养基中，配制成2× Endurazine溶液。
    2. 将Endurazine溶液加入贴壁细胞的各孔中。对于96孔板，吸除培养基后加入90 µL的1× Endurazine溶液。对于384孔板，向18 µL细胞悬液中加入18 µL的2× Endurazine溶液。不要吸除培养基，因为在384孔板中，降解检测是在培养基与无CO2培养基以50:50比例混合的条件下进行的。
    3. 将含有Endurazine的悬浮细胞或贴壁细胞板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育2.5小时，使发光信号达到平衡。
    4. 在无CO2培养基中配制10×浓度的待测PROTAC梯度稀释液，并向96孔板每孔加入10 µL，或向384孔板每孔加入4 µL。对于功效未知的化合物，建议以最高浓度点为1–10 µM作为起始浓度。
    5. 使用已预平衡至37 °C的发光仪，采集0–48小时内的动力学发光数据。测量的时间间隔可根据实验需求自定义，但建议初始实验设置为每5–15分钟测量一次，持续24小时或所需时长。
  4. 最终动力学检测后可选的同孔细胞活力多重分析
    注：本检测使用市售的CellTiter-Glo（CTG）试剂盒进行（见材料表）。
    1. 将CTG试剂平衡至室温。
    2. 在动力学分析最后一个时间点完成降解检测后，向每孔加入100 µL（96孔板）或40 µL（384孔板）试剂，并在板式振荡器上以500–700 rpm（96孔板）或微量板涡旋混合器（384孔板）振荡5分钟。
    3. 将检测板在室温下孵育30分钟，以实现细胞裂解并淬灭HiBiT信号。
    4. 按照制造商推荐方法，在发光仪上测定总发光值。
  5. 动力学降解曲线的定量分析
    1. 根据采集的动力学发光数据，将每个PROTAC浓度下的原始RLU值在每个时间点归一化至DMSO对照组的重复平均值，以校正随时间变化的游离furimazine浓度差异。使用公式1计算相对RLU值。
      公式1：显示PROTAC实验中相对RLU计算的公式；发光信号的比值。
    2. 从降解曲线中，使用公式2对每条曲线初始降解阶段至平台期的数据拟合单组分指数衰减模型。
      注：为提高拟合效果，可排除前几个数据点，因为在观察到降解前可能存在短暂延迟。
      公式2：指数衰减公式，y=(y0-Plateau)e^(-λt)+Plateau，用于数据分析和拟合。
    3. 根据公式2确定参数ƛ，其代表降解速率常数，以及Plateau，其代表剩余蛋白的最低水平。
    4. 计算Dmax，即被降解蛋白的最大相对比例，计算公式为1 - Plateau。
    5. 绘制每个PROTAC浓度下的Dmax值，以获得与时间无关的降解效力曲线。
    6. 根据2.3.5中的曲线确定Dmax50值，用于分析化合物的效力。
      注：若要确定特定时间点的DC50值，可绘制在选定时间点计算出的各浓度降解百分比曲线。该值可标注为DC50 t=4 h 或 DC50 t=12 h。

结果

为了展示单浓度终点裂解降解分析，将多种CDK靶蛋白（CDK2、CDK4、CDK7和CDK10）在HEK293细胞中通过C端内源性标记HiBiT，并用1 µM浓度的广谱激酶Cereblon依赖性PROTAC化合物TL12-18654（图1A）处理。在不同时间点检测CDK蛋白水平，并测定相对于DMSO对照组的相对荧光素酶单位（fractional RLU）（图1A）。每种CDK蛋白在化合物处理后的不同时间点均表现出不同程度的降解（图1A）。为了直接比较不同CDK蛋白在蛋白损失方面的差异，将图1A中的相对RLU值换算为总降解百分比，并在图1B中绘制各时间点的降解曲线。结果显示，即使在早期时间点（2或4小时），部分CDK家族成员已表现出高水平的降解，且随时间推移持续上升（图1B）。

为了展示动力学降解分析，将HEK293细胞中稳定表达LgBiT蛋白的内源性BET家族成员蛋白BRD2、BRD3和BRD4在其N端均标记上HiBiT18。随后，使用三种不同浓度的广谱BET靶向PROTAC化合物进行处理，分别为基于Cereblon的dBET650（图2A）和基于VHL的ARV-77141（图2B）。在24小时的时间范围内采集动力学数据，从各浓度下的降解曲线可明显看出BET家族成员之间的响应差异。BRD2在降解化合物处理后启动更快速恢复反应的能力（图2A,B）此前已在其他广谱BET PROTAC化合物中被观察到，这可能归因于与降解过程相竞争的转录反馈机制18。

可对完整化合物剂量反应处理进行终点分析和动力学分析。图3展示了四种不同分子胶化合物处理稳定表达LgBiT蛋白的Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat细胞后的动力学剂量反应降解曲线2,26,55,57；分别为来那度胺（图3A）、iberdomide（CC-220）（图3B）、沙利度胺（图3C）和泊马度胺（图3D）。这些降解剂在不同化合物之间以及不同浓度梯度下均表现出显著的降解反应差异（图3）。

为了定量评估降解效果并对图3中的化合物进行排序，利用剂量反应曲线计算了关键的降解参数，包括降解速率（图4A）、Dmax（图4B）和Dmax50值（图4B）。这些分析显示，iberdomide（CC-220）和泊马度胺具有非常相似的快速初始降解速率（图4A），但iberdomide（CC-220）表现出最高的效力，这与先前正交研究中观察到的结果一致55,57（图4B）。由于iberdomide表现出极高的效力，且所有测试浓度下均实现了超过50%的降解，因此所获得的iberdomide的Dmax50值是基于数据拟合准确性的限制而得出的估计值。从图3C、D和图4B中的曲线可见，来那度胺和沙利度胺在测试的最高浓度下均未能将Ikaros/IKZF1靶蛋白完全降解。由于沙利度胺引起的降解程度极低，其降解曲线无法被准确拟合为指数衰减模型，因此未对该处理条件下的降解速率进行量化。对于效力最强的降解剂iberdomide（CC-220）55,57（图4B），细胞活力多重检测结果显示，在测试浓度范围内未见细胞活力下降（图4C）。

随时间变化的CDK降解；折线图与柱状图；CDK2/4/7/10-HiBiT降解动力学分析；蛋白水解研究。
图1：广谱激酶靶向PROTAC分子TL12-186对CDK蛋白的终点降解效果及其细胞毒性54。（A）利用CRISPR/Cas9技术将内源性CDK靶蛋白C末端与HiBiT标签融合，使用1 µM TL12-186 PROTAC54处理2 h、4 h、8 h和24 h后检测其降解情况。各数据点表示相对于DMSO对照组在对应时间点测得的相对荧光素酶单位（Fractional RLU）。误差线表示3次技术重复的均值标准差（SD）。（B）根据（A）图计算得到的一组CDK靶蛋白的降解百分比，反映各家族成员在2、4、8和24 h时间点所观察到的降解程度。误差线表示3次技术重复的均值标准差（SD）。请点击此处查看该图的高清版本。

BET家族蛋白动力学降解谱图；dBET6和ARV-771处理的RLU比值随时间变化曲线
图2：使用BET降解剂dBET650和ARV-77141对BET家族成员进行动力学降解选择性分析。通过CRISPR/Cas9技术在N端标记HiBiT的内源性BET家族成员BRD2、BRD3和BRD4，在分别加入单一浓度为1 nM（左）、10 nM（中）或100 nM（右）的dBET650（A）或ARV-77141（B）PROTAC分子处理后的动力学降解谱图。数据以各时间点DMSO对照组计算得到的相对RLU比值表示。误差线表示4次技术重复的均值标准差（SD）。请点击此处查看该图的高清版本。

Ikaros IKZF1 的四种药物剂量反应曲线；动力学分析，相对发光单位（RLU）随时间变化。
图 3：使用分子胶面板对 Ikaros/IKZF1-HiBiT 进行的活细胞动力学降解剂量反应分析2,26,55,57。 稳定表达 LgBiT 蛋白的 Jurkat 细胞通过 CRISPR/Cas9 技术对 Ikaros/IKZF1 的 C 末端进行 HiBiT 肽段标记。细胞分别用四种不同的分子胶化合物2,26,55,57进行处理，每种化合物设置包含 DMSO 对照的 8 个浓度梯度：（A）来那度胺（lenalidomide），（B）iberdomide（CC-220），（C）沙利度胺（thalidomide），或（D）泊马度胺（pomalidomide）。发光信号每 5 分钟检测一次，持续共 19.5 小时。来自（A–D）的相对发光单位（RLU）数据按照步骤 2.4.1 所述方法转换为归一化 RLU，并以时间为横坐标作图。误差线表示三次技术重复的 SD。 请点击此处查看该图的高清版本。

药效学曲线：来那度胺的降解速率、最大值及CellTiter Glo检测结果。
图4：Ikaros/IKZF1-HiBiT蛋白降解速率与Dmax50的计算，以及细胞健康多联检测。 使用图3中的动力学降解数据，计算定量降解参数。(A) 在所示分子胶化合物的各个药物浓度下，绘制了降解速率；(B) 绘制了降解最大值（Dmax）2,26,55,57。(B) 使用Hill斜率固定为1的剂量-反应模型计算每种化合物的Dmax50值，可用于对靶标蛋白的降解化合物进行排序。(C) 在完成动力学降解检测后，以终点检测方式对图3B中iberdomide（CC-220）55,57的降解剂量反应曲线进行了细胞活力检测。误差条表示3次技术重复的SD。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

本文介绍了两种筛选降解化合物活性的方法，分别为终点裂解法和活细胞动力学模式。这两种方法基于相同的发光检测原理，但可提供不同层次的细节和理解深度。选择哪种方法可能取决于筛选目标和化合物库的规模。对于大规模化合物筛选或旨在检测任何可观察到的降解作用的初筛，终点裂解法具有高灵敏度和高效性，适用于高通量筛选；而其他终点检测方法（如蛋白质印迹或质谱分析）则可能难以实施或适应高通量需求14。此类筛选的起始实验可采用有限的浓度梯度和时间点进行。建议初始测试浓度范围为100 nM–10 µM，以涵盖初始降解剂可能存在的低效价、通透性差，或在某些高效化合物中出现的“钩状效应”（hook effect）。此外，建议至少测试两个不同的时间点，以评估早期降解（4–6小时）以及延迟或持续性降解（18–24小时）。具有高效价和靶向机制的化合物通常在4–6小时内即可明显观察到蛋白降解，而仅在较晚时间点观察到的降解或表观蛋白水平下降可能由多种机制引起。强烈建议在早期和晚期时间点均监测细胞活力，以便将蛋白减少与细胞死亡导致的损失区分开来。与所有类型的发光或荧光检测类似，化合物库中的某些化合物可能干扰或抑制信号，因此，对先导化合物采用无关融合蛋白或其它蛋白水平检测方法进行正交验证实验，对于确认本检测中相对发光单位（RLU）的减少确实与靶蛋白降解直接相关至关重要。

长时间以活细胞动力学模式进行检测的能力在很大程度上依赖于检测信号与背景的比值（S:B）。影响 S:B 的因素包括靶蛋白本身的表达水平（其范围可跨越多个数量级）、在选定用于肽段插入的细胞系中 LgBiT 的表达效率，以及在各种天然复合物中靶蛋白对互补反应的可及性。我们已确立了一般性阈值标准，即 S:B 需达到 15，才能使用 Endurazine 或 Vivazine 成功进行动力学模式下的降解检测。S:B 的测定方法是：在存在 Endurazine 或 Vivazine 活细胞底物的条件下，检测共表达 LgBiT 的 HiBiT 编辑细胞的基础信号强度，并相对于仅表达 LgBiT 的未编辑亲本细胞进行比较。Vivazine 可产生更强的发光信号，但其衰减速率快于 Endurazine，可能将信号采集时间限制在 24 小时或更短。此外，S:B 还可能显著依赖于使用的是 CRISPR 混合群体还是单克隆。对于那些更易于操作且 CRISPR/Cas9 编辑效率较高的细胞系中的靶点，异质性的 CRISPR 混合编辑细胞群体可能已具备足够的 S:B 用于动力学分析。而对于在较难转染的细胞系中的靶点，由于 CRISPR 介导的基因组整合效率较低，导致混合群体的 S:B 偏低，此时可能需要分离 CRISPR 单克隆，以富集编辑细胞群体并获得足够高的 S:B 用于动力学分析。在上述任何情况下，若使用 Endurazine 或 Vivazine 底物时 S:B 低于 15，则建议采用终点裂解法进行筛选。

为了更好地理解与表征化合物，包括确定具有定量参数的降解谱，推荐采用在活细胞中进行实时动力学分析作为筛选方法14,18。与上述终点分析类似，初步的动力学筛选可在高通量模式下以有限浓度（100 nM–10 µM 范围内）进行。在 384 孔板格式中，单块板上即可对超过 100 种化合物在单一浓度下进行三复孔筛选。所得的降解谱不仅可提供有关目标蛋白降解程度的信息，还可揭示其降解速率、持续时间以及蛋白可能的恢复情况14,18（图 2 和 图 3）。降解曲线的形态也包含重要信息。特异且高效的降解剂通常在数小时内即引起目标蛋白快速减少并达到平台期18,53，而其他机制（如转录反馈或化合物毒性）则通常表现为蛋白随时间呈更线性的下降。这些细节和细微差异在终点裂解分析中容易被忽略；而通过 24–48 小时的实时分析，无需预先推测即可准确捕获新化合物或未知化合物集合中的真实 Dmax。

实时动力学还能够 为了高效进行剂量反应筛选，以更好地理解化合物的效力、化合物浓度对初始降解速率的影响，并提供基于多个参数对化合物进行排序的可能性。传统的降解效力测量涉及DC50 基于表观降解最大值在特定时间点进行计算。相比之下，我们用于评估效力的动力学方法则纳入了每个浓度下真实的降解最大值，而不论其发生的时间。18我们将这种对动力学降解效力的测量称为Dmax5018以这种方式进行分析，可涵盖那些在较低浓度下可能降解启动较慢、因而需要更长时间才能达到其最大降解程度（Dmax）的化合物。同时根据降解速率和Dmax对化合物进行排序，可提供尤为有价值的信息。对于最具效力的降解剂而言，该方法能够进一步区分出虽降解速度较慢但效力强的化合物与那些既快速又高效的降解剂。综上所述，利用HiBiT CRISPR细胞系开展的裂解法和活细胞动力学筛选是强大的研究手段，可更全面地揭示靶向蛋白降解过程、化合物功能特性，并推动从初始活性评估到通过优化关键降解参数实现后续化合物化学结构优化的完整筛选流程。

披露

Promega Corporation 通过转让拥有 HiBiT 和 NanoLuc 技术及其应用的专利商业所有权。

致谢

K.M.R、S.D.M、M.U. 和 D.L.D 均为 Promega Corporation 的员工

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CellTiter-Glo 2.0 试剂PromegaG9241细胞活力化学发光检测
CellTiter-Fluor 细胞活力检测试剂盒PromegaG6080细胞活力荧光检测
CO2-非依赖性培养基ThermoFisher18045-088细胞培养
DMSOSigma AldrichD2650用于化合物稀释和对照
DPBSGibco14190细胞培养
胎牛血清Seradigm89510-194细胞培养
HEK293 LgBiT 稳定细胞系PromegaN2672与 HiBiT 互补以产生发光信号
HiBiT CRISPR 哺乳动物细胞系Promegahttps://www.promega.com/crispr-tpd
潮霉素B溶液Gibco10-687-010细胞培养
LgBiT BacMamPromegaCS1956C01与 HiBiT 互补以产生发光信号
LgBiT 表达载体PromegaN2681与 HiBiT 互补以产生发光信号
发光仪微孔板读数仪可检测化学发光和荧光的发光仪（例如 GloMax Discover 系统，Promega GM3000）
NanoGlo Endurazine 活细胞底物PromegaN2570动力学 HiBiT 试剂
NanoGlo Vivazine 活细胞底物PromegaN2580动力学 HiBiT 试剂
NanoGlo HiBiT 裂解检测系统PromegaN3030终点裂解型 HiBiT 试剂
Opti-MEM 减血清培养基，无酚红（ThermoFisher）ThermoFisher11058-021细胞培养
组织培养板，白色，96 孔板Costar3917细胞培养
组织培养板，白色，384 孔板Corning3570细胞培养
胰蛋白酶/EDTAGibco25300细胞培养

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PROTAC NanoBRET

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