需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用EGFR和RAS抑制剂的鉴定 秀丽隐杆线虫

2.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61788

⸱

2020年10月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

本文内容

摘要

遗传学上易于操作的线虫Caenorhabditis elegans可作为药物发现的简单且低成本的模型。本文描述了一种用于鉴定抑制RAS和EGFR蛋白下游信号传导的抗癌治疗药物的实验方案。

摘要

表皮生长因子受体（EGFR）及其下游效应分子RAS在细胞质膜上的定位变化与多种疾病（包括癌症）相关。C. elegans作为一种自由生活的线虫，具有进化上保守且功能相似的EGFR-RAS-ERK MAPK信号级联通路，该通路在阴门发育过程中起核心作用。RAS同源基因LET-60和EGFR同源基因LET-23的功能获得性突变可诱导线虫腹侧体壁形成可见的、无功能的异位假阴门。此前研究表明，这些线虫中的多阴门（Muv）表型可被小分子化学物质所抑制。本文介绍了一种基于液体培养体系利用该线虫筛选能够抑制EGFR和RAS蛋白活性的抑制剂的实验方案。通过该检测方法，我们证明R-芬地林（R-fendiline）——一种K-RAS的间接抑制剂——可抑制let-60(n1046)和let-23(sa62)突变线虫所表现出的Muv表型。该检测方法操作简便、成本低廉、建模耗时短，可作为抗癌药物发现的初步筛选平台。

引言

调控生物体内发育事件的细胞通路在所有后生动物中高度保守。其中一个通路是表皮生长因子受体-鼠肉瘤病毒癌基因同源物-细胞外信号调节激酶（EGFR-RAS-ERK）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联，该通路在调控细胞增殖、分化、迁移和存活中起关键作用1,2。该信号通路的缺陷可导致病理状态或疾病，例如癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在人类肿瘤中表现出高表达，包括50%的口腔鳞状细胞癌，并促进恶性肿瘤的发展3,4,5。而H-RAS、K-RAS和N-RAS这三种RAS亚型的突变是多种人类癌症中恶性转化的主要驱动因素。在这三种RAS亚型中，K-RAS的致癌突变最为常见6,7,8。EGFR和RAS要发挥功能，必须定位于质膜（PM）。阻止这些分子向质膜的定位可完全抑制该信号通路的生物学活性9,10。因此，抑制这些蛋白向质膜的定位是一种阻断下游信号传导及其不良后果的治疗策略。通过高内涵筛选实验，发现芬地林（fendiline）——一种L型钙通道阻滞剂——可抑制K-RAS活性11。在芬地林存在下，K-RAS向质膜内小叶的纳米簇化显著减少。此外，K-RAS从质膜重新分布至内质网（ER）、高尔基体、内体和胞质溶胶。更重要的是，芬地林通过抑制下游信号传导，阻断了表达致癌性突变K-RAS的胰腺癌、结肠癌、肺癌和子宫内膜癌细胞系的增殖11。这些数据表明，芬地林作为一种特异性的K-RAS抗癌治疗剂，可导致RAS蛋白在质膜上的错误定位。

线虫 Caenorhabditis elegans 在发育研究领域已被广泛研究。许多调控该线虫发育的信号通路在进化上和功能上均具有保守性。例如，由EGFR介导的RAS激活以及随后ERK MAPK信号级联的激活在该线虫中是保守的12。该信号级联由以下蛋白组成：LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1。其中，LET-60 与 RAS 同源，而 LET-23 与 EGFR 同源。在该线虫中，这一通路调控外阴的发育13。外阴是位于线虫腹侧体壁上的一个上皮性开口，用于排出受精卵。线虫外阴的形成依赖于外阴前体细胞（VPC）暴露于EGFR-RAS-MAPK信号级联的激活梯度。在正常发育过程中，靠近的VPCs会从性腺锚定细胞接收到强烈的信号，从而分化为1°和2°细胞命运，进而形成有功能的外阴12。而远端的VPCs则分化为3°细胞命运，与表皮合胞体融合，由于信号不足而不形成外阴。在缺乏信号的情况下，所有VPCs均分化为3°细胞命运，导致无法形成外阴。然而，持续性信号激活会导致一个或多个无功能外阴的形成，原因是所有VPCs均被诱导进入 1°和2°细胞命运。

许多编码该通路中蛋白质的基因已被发现存在导致阴道诱导缺陷或过度的突变。阴道诱导缺陷会导致无阴道（Vul）表型，而过度的阴道诱导则导致多阴道（Muv）表型，后者表现为在腹侧体壁广泛形成多个无功能的异位假阴道结构。由let-60(n1046)品系表现出的Muv表型是由于RAS基因的功能获得性突变所致，而在let-23(sa62)品系中则是由于EGFR基因的激活突变所致14,15。研究表明，这些突变品系中强烈的Muv表型可被药理学干预所干扰，例如使用MEK-1抑制剂U0126处理let-60(n1046)线虫即可观察到该效应16,17。有趣的是，我们已发现R-芬地林以及影响鞘磷脂代谢的抑制剂能够抑制线虫中的Muv表型18。为了证明这些抑制剂在RAS水平上阻断let-60信号通路，研究中使用了lin-1缺失突变品系17。Lin-1是一种类似Ets的抑制性转录因子，在阴道发育过程中发挥阻遏作用19。在let-60(n1046)线虫中显著逆转Muv表型，而在lin-1缺失突变线虫中无任何效应，表明这些抑制作用发生在RAS水平。

在本方案中，我们展示了如何使用 秀丽隐杆线虫 作为识别RAS和EGFR蛋白抑制剂的模型。通过基于液体的检测方法，我们证明了R-fendiline通过抑制Muv表型所产生的抑制作用 let-60(n1046) 和 let-23(sa62) 突变菌株 秀丽隐杆线虫该检测验证了以下方法的使用 秀丽隐杆线虫 作为抗癌药物发现初期阶段的工具。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 线虫生长培养基（NGM）平板的制备

  1. 在2 L锥形瓶中加入2.5 g蛋白胨和3 g NaCl至970 mL去离子水中，使用磁力搅拌子搅拌内容物。随后向瓶中加入20 g琼脂。将瓶内物质在121 °C、15 lb/in2压力下高压灭菌30分钟。灭菌后，将锥形瓶置于搅拌台上，使培养基冷却至温度达到50 °C。
  2. 制备NGM平板时，向已冷却的培养基中加入以下试剂：25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH = 6.0）、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 1 M CaCl2、1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）胆固醇溶液、1 mL（10% v/w溶于乙醇）制霉菌素溶液以及1 mL 25 mg/mL链霉素溶液。
  3. 在超净工作台内，将冷却后的培养基倒入60 mm × 15 mm无菌培养皿中。让平板静置凝固2小时。这些平板可在4 °C保存1个月。

2. C. elegans 的培养

  1. 在每个NGM平板的中心位置点加100 μL过夜培养的E. coli OP50，置于超净台中干燥24小时。随后可将平板储存于聚苯乙烯容器中。
    注意：E. coli OP50菌种在接种平板前需在37 °C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。该菌液可在4 °C保存1–2个月，用于定期接种平板。
  2. 使用无菌线虫挑针，在解剖显微镜下从先前培养的平板上挑取10–12条产卵期成虫线虫，转移至已接种E. coli OP50的新鲜NGM平板上，并于20 °C培养24小时。
  3. 24小时后，使用无菌挑针移除平板上的成虫线虫，将平板在20 °C继续培养约3天，胚胎将发育为产卵期成虫线虫。

3. 制备同步化的 C. elegans 培养物

  1. 用 M9W 缓冲液冲洗 2–4 块培养板，将怀卵成虫收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
    1. M9W 缓冲液的配制：将 5 g NaCl、6 g Na2HPO4 和 3 g KH2PO4 溶于去离子水中，定容至 1 L。在 121 °C、15 lb/in2 压力下高压灭菌 30 分钟。待溶液冷却后，加入 1 mL 1 M MgSO4。
  2. 将离心管以 450 x g 离心 1 分钟，使线虫沉淀。倾去上清液，注意不要扰动管底的线虫沉淀。
  3. 配制线虫裂解液：将 400 μL 8.25% 次氯酸钠（家用漂白剂）与 100 μL 5 N NaOH 混合。将此溶液加入线虫沉淀中，并轻弹离心管以混匀内容物。在解剖显微镜下观察线虫裂解情况，以防止胚胎过度漂白。
  4. 当约 70% 的成虫已裂解时，向离心管中加入 10 mL M9W 缓冲液以稀释裂解混合液。
  5. 将离心管以 450 x g 离心 1 分钟，弃去上清液，并用 10 mL M9W 缓冲液重悬沉淀。
  6. 重复步骤 3.5 两次。
  7. 完成洗涤步骤后，加入 3–5 mL M9W 缓冲液以重悬卵沉淀。将离心管置于室温（RT）下，以 18 rpm 的速度在旋转仪上旋转过夜。
  8. 过夜孵育后，从旋转仪上取下离心管，以 450 x g 离心 1 分钟使 L1 幼虫沉淀。用移液器吸除上清液，保留 250 μL M9W 缓冲液。
  9. 振荡离心管以重悬幼虫。取三滴各 5 μL 的幼虫悬液滴加至培养皿盖上。使用解剖显微镜计数每滴中的线虫数量，并计算每 1 μL 中的线虫数目。

4. 药物检测的制备

注意：本实验的步骤如图1所示。

  1. 在50 mL锥形管中，将30 mL E. coli OP50于37 °C、150 rpm的摇床中过夜培养。
  2. 将过夜培养的E. coli OP50菌液在4,000 × g离心10分钟，使细胞沉淀；弃去上清液，并将沉淀重悬于3 mL M9W培养基中以浓缩菌液。
  3. 在配制药物实验工作液之前，向100 mL含胆固醇的M9W培养基中加入0.1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）的胆固醇溶液。
  4. 通过将每种实验药物及其溶剂（二甲基亚砜；DMSO）稀释于4.8 mL含胆固醇的M9W培养基中，配制各药物的工作溶液，以获得所需浓度。将DMSO溶于4.8 mL含胆固醇的M9W培养基中，用于制备溶剂对照组。
  5. 向含有溶剂对照或药物的各试管中加入200 μL浓缩的E. coli OP50菌液，并涡旋混匀，确保充分混合。
  6. 实验时，将每种药物工作溶液或溶剂对照各2 mL加入12孔细胞培养板的每个孔中。每种药物浓度及溶剂对照均设复孔。
  7. 使用无菌微量移液器向每孔加入约100条L1期幼虫（参见同步化C. elegans培养步骤），虫液体积控制在10 μL以内。
  8. 将培养板置于20 °C恒温培养。
  9. 若需要，在实验第3天向各孔补充50 μL 10倍浓缩的E. coli OP50菌液。

5. 显微镜观察用琼脂糖垫的制备

  1. 通过将0.1 g琼脂糖溶解于5 mL去离子水中，配制2% w/v的琼脂糖溶液。将溶液放入微波炉中加热以溶解琼脂糖。5 mL琼脂糖溶液可制备20张载玻片。
  2. 在两张玻璃载玻片上贴上实验室胶带条。胶带将作为间隔物，限制琼脂糖垫的厚度。然后，将第三张洁净的玻璃载玻片置于带胶带的载玻片之间。
  3. 制备琼脂糖垫时，取100 μL熔融琼脂糖滴加到洁净载玻片的中央。将另一张洁净的玻璃载玻片覆盖在琼脂糖上，并轻轻按压以形成垫状。待琼脂糖垫凝固后，移除上层载玻片。

6. Muv表型的观察 let-60、let-23 和 lin-1 菌株

注意：只有在 let-23 和 let-60 菌株中能够抑制多阴道（Muv）表型的候选药物，才会进一步使用 lin-1 菌株进行检测，以确定其抑制作用发生在 RAS 还是 EGFR 水平。

  1. 当达到生命周期的适当阶段时（let-60 和 let-23 品系为3天，lin-1 品系为5天），从培养箱中取出培养板，用移液器将线虫收集至15 mL 圆底离心管中。
  2. 以450 × g 离心1分钟。去除M9W缓冲液时注意不要扰动线虫沉淀，然后加入5 mL 新鲜M9W缓冲液。
  3. 重复步骤6.2两次。
  4. 在不扰动线虫沉淀的前提下，用抽吸法除去所有残留的M9W缓冲液。随后加入500 μL 2 mM 叠氮化钠或2 mM 盐酸四咪唑。将离心管在室温下孵育15分钟。2 mM 叠氮化钠或2 mM 盐酸四咪唑可使线虫麻醉，以便成像。
    注意：操作叠氮化钠时务必佩戴个人防护装备（PPE），溶液必须在化学通风橱中配制。
  5. 取10 μL 麻醉后的线虫悬液，滴加到琼脂糖垫片的中央。轻轻盖上一张#1.5 盖玻片。如有需要，可用少量指甲油固定盖玻片，防止干燥。
  6. 使用微分干涉差显微镜（DIC显微镜）观察 let-60(n1046)、let-23(sa62) 和 lin-1(sy254) 品系。在10倍和20倍放大倍数下对线虫进行成像。
  7. 对于 let-60(n1046) 和 let-23(sa62) 品系，根据成虫是否存在多阴道（Muv）表型进行评分；而对于 lin-1 品系，则使用高分辨率DIC显微镜计数L4幼虫腹侧采用1°或2°细胞命运的VPC数量。
  8. 完成各品系及药物处理组显微图像的评分后，进行学生t检验（Student’s t-test），以确定不同处理组之间的统计学差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们首先证明，与DMSO处理的线虫相比，R-fendiline能够抑制let-60(n1046)突变株的多阴门（Muv）表型。实验数据显示，R-fendiline能够以剂量依赖的方式阻断let-60(n1046)突变株的Muv表型（图2A,B）。然而，在lin-1功能缺失突变株中，随着R-fendiline浓度的增加，并未观察到Muv表型的逆转（图2B）。该结果表明，R-fendiline在C. elegans中于RAS水平上阻断了活化的let-60信号通路。类似地，我们观察到，在let-23(sa62)突变株中，经3、10和30 µM R-fendiline处理后，Muv表型相较于DMSO处理组显著减少（图2C,D）。所有实验均采用Student t-检验来确定统计学...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们所描述的利用线虫筛选EGFR和RAS功能抑制剂的检测方法简单且成本低廉。C. elegans 是一种具有吸引力的药物发现模型，因其生命周期短（在20 °C下为3天）且能够产生大量幼虫，易于在实验室中培养。更重要的是，EGFR-RAS-ERK MAPK信号通路在进化和功能上与哺乳动物高度保守，提供了一个遗传上易于操作的系统，用于分析EGFR和RAS抑制剂的作用效果。此外，线虫透明的身体结构使研究者能够通过微分干涉差（DIC）显微镜和荧光显微镜观察到特定结构以及绿色荧光蛋白（GFP）或其他荧光染料与目标蛋白融合后的定位情况。

本研究中用于繁殖和维持各种C. elegans的实验方案此前已有 established20,21。然而，在制备NG平板时，我们加入了链霉素和制霉菌素，以防止细菌和真菌污染。添加这些抗菌剂并未影响线虫的发育及多阴门表型的诱导。

通过线虫同步化方案获得L1...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢斯瓦西·阿鲁尔博士（MD Anderson 癌症中心）提供 let-60(n1046)我们还要感谢德克萨斯农工大学大卫·赖纳博士（Dr. David Reiner）&M 健康科学中心生物科学研究所 & Technology 位于休斯顿）的 lin-1 菌株。最后，我们感谢 Danielle Garsin 博士及其团队（德克萨斯大学麦戈文医学院）提供了部分试剂。部分线虫菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。本研究由德克萨斯州癌症预防与研究研究所（CPRIT）资助，项目编号RP200047，授予JF Hancock。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>培养基与化学试剂
琼脂糖 Millipore Sigma A9539-50G
Bacto蛋白胨 Fisher ScientificDF0118-17-0
BD Difco 琼脂 Fisher ScientificDF0145-17-0
BD Difco LB 肉汤Fisher ScientificDF0446-17-3
氯化钙Fisher ScientificBP510-500
胆固醇Fisher ScientificICN10138201
硫酸镁Fisher ScientificBP213-1
制霉菌素Acros OrganicsAC455500050
磷酸氢二钾Fisher ScientificBP363-500
磷酸二氢钾Fisher ScientificBP362-500
R-芬地林商业合成（药品级）
叠氮化钠Millipore Sigma S2002-25G
氯化钠 Fisher ScientificBP358-1
氢氧化钠Fisher ScientificSS266-1
8.25% 次氯酸钠 漂白剂
磷酸氢二钠 Fisher ScientificBP332-500
硫酸链霉素 Fisher ScientificBP910-50
(−盐酸左旋咪唑Millipore Sigma L9756
UO126（MEK抑制剂）默克生命科学 19-147
<强>耗材 
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 Fisher Scientific12-565-269
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Fisher Scientific12-565-271
一次性聚苯乙烯刻度吸管 10 mLFisher Scientific07-200-574
一次性聚苯乙烯血清移液管 25mLFisher Scientific07-200-575
1.5号  18 mm × 18 mm 盖玻片Fisher Scientific12-541A
带透明盖的培养皿（60 × 15 mm）Fisher ScientificFB0875713A
带透明盖的培养皿（100×15 mm）Fisher ScientificFB0875712
普通载玻片（75 × 25 mm）Fisher Scientific12-544-4
12 孔组织培养板Fisher Scientific50-197-4804
<强>软件 
PrismGraphpad
<强>细菌菌株
E. coli OP50
<强>线虫品系
<强>菌株<强>基因型<强>转基因<强>源
MT2124  let-60(n1046) IVCGC
MT7567lin-1(sy254) IV.CGC
PS1839let-23(sa62) II.CGC

参考文献

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

秀丽隐杆线虫EGFR抑制剂多阴道表型药物检测线虫裂解L1幼虫琼脂糖垫微分干涉差显微镜R-芬得利
使用EGFR和RAS抑制剂的鉴定 秀丽隐杆线虫
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。