需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用全身体吸入系统使小鼠暴露于香烟烟雾

7.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61793

⸱

2020年10月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Immunology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Infectious Diseases, Baylor College of Medicine, 3Department of Medicine - Immunology Allergy and Rheumatology, Baylor College of Medicine, 4Department of Medicine, Pulmonary, Critical Care, Sleep Medicine, Baylor College of Medicine, 5Department of Pathology and Immunology, Baylor College of Medicine, 6Department of Pediatrics, Research and Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 7Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 8Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey VA Medical Center

本文内容

摘要

本方案展示了利用自行构建的全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）研究香烟烟雾（CS）病理生理效应的方法。该系统可在可控且可重复的条件下使动物暴露于香烟烟雾中，用于研究香烟烟雾对肺气肿和造血功能的影响。

摘要

据报道，2018年美国近14%的成年人吸烟。香烟烟雾（CS）对肺部和心血管疾病的影响已被广泛研究，但其对血液和骨髓等其他组织和器官的影响仍不完全明确。在啮齿类动物中研究香烟烟雾影响的合适系统可能价格昂贵，且需要购买商业化的设备。因此，我们着手构建一种经济、可靠且多功能的系统，用于研究香烟烟雾对小鼠的病理影响。该全身吸入暴露系统（WBIS）通过交替暴露于香烟烟雾和清洁空气，模拟吸烟时的呼吸和抽吸过程。本文显示，这种自制（DIY）系统在连续4个月香烟烟雾暴露后，可诱导小鼠气道炎症和肺气肿。同时，也展示了利用该装置研究香烟烟雾全身吸入（WBI）对骨髓中造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的影响。

引言

尽管过去50至60年来美国吸烟成年人数量持续下降，但吸烟仍是导致可预防疾病的主要原因之一1。众所周知，吸烟与多种肺部和血液疾病相关，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD），后者是一组包含肺气肿和慢性支气管炎的疾病2,3,4。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，2014年COPD是美国第三大死因，超过1500万美国人患有此病5。

最近，吸烟（CS）还被发现与克隆性造血（CH）风险升高相关6,7，克隆性造血是一种单一造血干细胞异常扩增并产生个体外周血中较大比例血细胞的病理状态。该发现提示吸烟与骨髓功能之间可能存在关联。鉴于吸烟对健康的广泛而重大的影响，以及小鼠疾病模型在生物医学研究进展中的核心地位，建立高效且经济的小鼠吸烟模型系统具有重要意义。

本文提供了一套逐步指南，用于构建一套经济实惠的系统，以处理并研究香烟烟雾（CS）对肺气肿及骨髓稳态的体内影响。该设备的组装无需使用者具备专业知识，因此可实现自行组装。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有参与本实验和技术开发的动物均遵循由机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案，并在获得实验动物管理和使用协会（AAALAC）认证的贝勒医学院和MD安德森癌症中心机构的监管下进行。

1. 构建装置

  1. 组装带有阀门系统的空气压缩机。
    1. 使用1/8英寸螺纹公接头将流量计（两个15 L/min，带Y型管和2个动力输出口）连接到微型压力调节器上。所有螺纹接口均需使用螺纹密封胶带。
    2. 通过以下部件将已组装的压力调节器与医用空气压缩机仪器连接：压缩机出气口上的1/8英寸六角接头、1/8英寸螺纹耦合接头，以及连接至压力调节器的1/8英寸螺纹公接头。
    3. 在每个（共4个）流量计上安装氧气旋转卡套接头。
    4. 在空气压缩机顶部的出气口安装一个公接头适配器（该部件随医用空气压缩机仪器提供）。
  2. 组装暴露室（制作4个单元）
    1. 将一段3/4英寸氯化聚氯乙烯（CPVC）管切割成八个4英寸长的段。
    2. 将每一段插入一个3/4英寸90°弯头CPVC接头中，并将弯头的另一侧连接至一个3/4英寸直径的CPVC公接头。最终应得到八个CPVC段，每个段分别连接一个CPVC弯头接头和一个CPVC公接头。
    3. 在一个8.5 L带盖密闭容器（11.25 × 7.75 × 6英寸）上，于距离最远的相对两侧各钻一个直径为1¼英寸的孔（参见图1暴露室示意图）。孔的位置应在上下和左右方向居中。
    4. 将之前组装好的CPVC公接头的螺纹端插入容器上的各个孔中。
    5. 从容器内部，在一侧（暴露室烟气输入口）安装一个3/4英寸CPVC封帽，在另一侧（暴露室烟气输出口）安装一个3/4英寸CPVC滴灌母接头。
    6. 在暴露室烟气输出口的CPVC封帽顶部钻五个直径为3 mm的孔，呈梅花状（淋浴喷头式）排列。这将使香烟烟雾以较高流速进入暴露室，并确保其在室内各个方向均匀扩散。
  3. 组装香烟燃烧室（可制成最多4个啮齿类动物暴露单元）
    1. 取一个单孔橡胶塞（厂家规格8.5），在其较宽的一侧插入一个1/4英寸带卡套的Y型接头，在较窄的一侧插入一个直型卡套接头（8 mm开口）。香烟将在吸烟过程中放置于此处（香烟支架）。
    2. 将一段长12英寸的医用级乙烯基管的一端连接至橡胶塞上的Y型接头的一个卡套接口，另一端连接至一个1/4英寸接头，并将该接头的另一端插入另一个单孔橡胶塞（厂家规格1）中。
    3. 在另一个橡胶塞（厂家规格8.5）的较宽侧插入一个1/4英寸直型管接头，并将其外端连接至一段7英尺长的医用级乙烯基管。
    4. 将步骤1.3.1–1.3.3中组装的两个橡胶塞结构连接至一段8英寸×1.75英寸的实验室玻璃排水管玻璃圆筒上。
  4. 阀门控制系统
    1. 该系统通过电磁阀的节律性开关来控制，模拟吸入（抽吸）香烟烟雾和清洁空气的过程。控制电磁阀的系统为商业设计产品（参见材料表）。
  5. 将所有组件组装在一起（参见图1）
    1. 使用1英寸紧固件将四个电磁阀安装在阀门控制系统的侧面。
    2. 根据制造商说明，将电磁阀连接至阀门控制系统。
    3. 在电磁阀的排气口（“EXH”）连接一个10–32（M）螺纹直通接头，并在同一个电磁阀的“IN”和“OUT”接口上安装螺纹端口适配器。
    4. 使用一段7英尺长的医用级乙烯基管，将连接在压缩机上的流量计通过“OUT”接口连接至电磁阀。
    5. 将步骤1.3.3中已与橡胶塞组装好的7英尺乙烯基管连接至电磁阀的“IN”接口。
    6. 将香烟燃烧室的小橡胶塞插入暴露室的烟气输入口。
    7. 将电磁阀连接至步骤1.3.1中组装的香烟支架上的Y型卡套接头的第二个接口。

香烟暴露系统示意图，显示了腔室、电磁阀、空气压缩机和流量计。
图1：我们用于香烟烟雾（CS）暴露的WBIS系统连接示意图。 该图展示了所有组件如何组装成一个可运行的装置。图中仅显示了该设备可同时运行的四个吸烟腔室中的一个。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 香烟烟雾暴露

警告：避免接触二手和三手香烟烟雾。香烟和暴露室应在II级B2型层流生物安全柜内使用。进行烟雾暴露实验时应穿戴适当的个人防护装备（例如口罩、手套、发网、防护服）。

  1. 设置压力和气流
    1. 按照图1所示将所有组件组装完毕后，打开空气压缩机，并等待安全警报自动关闭。
    2. 通过旋转压力调节器上的旋钮，将空气压缩机的压力调节至40–50 psi。
    3. 使用流量计将空气压缩机的气流调节至5 L。
    4. 打开阀门控制器。
    5. 按住UP键的同时按下SET/LOCK键，进入数字计时器的第一位数字设置，将阀门控制器上的数字计时器调整为PULSE-C模式（显示屏显示为“Pu-c”）。然后按UP键，直至显示Pu-c模式。按下RESET键，将当前显示的操作模式（即Pu-C）设为工作模式。
    6. 按下SET/LOCK键以修改计时器1（显示屏显示为“T1”）。
    7. 按UP或DOWN键将T1设置为20秒。
    8. 按下SET/LOCK键以修改计时器2（显示屏显示为“T2”）。
    9. 按UP或DOWN键将T2设置为3秒。
      注意：步骤2.1.5至2.1.9是针对特定计时器（见材料表）进行的设置。如需了解该产品的其他用途，请参阅相应用户手册。
  2. 香烟烟雾处理
    注意：本系统可同时使用1–4个小鼠暴露室。
    1. 打开空气压缩机，并等待安全警报自动关闭。
    2. 打开阀门控制器。
    3. 将5只小鼠转移至四个体积为8.5 L、带有气密可拆卸盖的暴露室中。将装有小鼠的四个暴露室置于II级B2型层流生物安全柜内。
    4. 在层流生物安全柜内，点燃一支香烟并将其插入香烟燃烧室中。使用市售香烟，其焦油含量为15 mg/支，尼古丁含量为1.1 mg/支8，与肯塔基3RF4研究用香烟（焦油9.5 mg/支，尼古丁0.73 mg/支）9进行比较。
    5. 打开阀门控制器上对应正在使用的暴露室的阀门。暴露过程分为两个阶段：（T1）清洁空气被泵入暴露室持续20秒；（T2）气流使香烟燃烧，并将香烟燃烧室中的烟雾泵入暴露室持续3秒。让香烟完全燃烧至滤嘴处。
      1. 调整计时器设置，使每支香烟在约4分钟内平均产生约10次抽吸。请注意，该计时器和系统可根据研究人员的实验需求灵活调整香烟烟雾的暴露剂量方案。
    6. 取出香烟滤嘴，并将烟头放入盛有水的玻璃烧杯中以熄灭火焰并减少气味，随后妥善处理。
    7. 确保香烟燃烧室再次关闭且无香烟残留。让设备持续泵入清洁空气10分钟。在香烟烟雾暴露过程中，必须对脊椎动物进行持续监测。该暴露方案优化适用于每个暴露室中5只9周龄以上的雌性小鼠。
    8. 每天对每个暴露室重复步骤2.3.4至2.3.7共三次，总计每个暴露室每天使用4支香烟。该程序每周重复5天，持续时间根据研究人员实验需要而定。
    9. 将小鼠从暴露室中取出并放回相应的饲养笼中。
    10. 关闭阀门控制器和空气压缩机。
    11. 取下暴露室和香烟燃烧室，用清水和肥皂清洗以去除焦油残留物。
    12. 在再次使用前确保各腔室完全干燥。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

CS 暴露的主要特征之一是肺气肿，其特征是肺部气囊（肺泡）的损伤和破坏。因此，最初的实验重点在于验证 DIY 系统在对雌性小鼠进行反复全身性 CS 暴露后，能否诱导其肺部发生肺气肿样改变。CS 给药方案的选择基于我们此前的发表文献，在这些研究中我们使用了此处描述的 DIY 系统对小鼠进行 CS 处理，并研究肺气肿的分子病理生理学机制10,11,12,13,14,15,16。具体而言，小鼠每周 5 天、每天全身暴露于 4 支带滤嘴的市售香烟烟雾中，每支香烟之间设有 10 分钟无烟间隔，持续 4 个月10,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文提供了构建用于小鼠慢性烟雾暴露（CS）的WBIS装置所需的信息。系统安装完成后，研究人员必须根据动物体内尼古丁或可替宁的实际递送剂量对系统进行校准，这是至关重要的。该装置包含定时器和压力表，可用于调节每口烟的体积、抽吸频率、合并的烟雾暴露时间以及每支香烟之间动物的休息间隔。此外，每天实际给予的香烟数量可能因焦油和尼古丁含量的不同而有所变化。最后，必须定期清洁所有接触香烟烟雾的组件，以确保烟雾循环正常，并使动物接受一致的烟雾暴露。

目前已有至少六种商用系统和方案可用于对小鼠进行香烟烟雾（CS）和空气有毒物质的处理。然而，大多数用于此目的的设备需要依赖商业供应商，或需要具备电子学和/或电气工程方面的专业知识才能组装。部分系统采用全身暴露（WBI）方案，而另一些则采用仅鼻部暴露的处理方式，但这些系统的成本可能高达10万美元，对于大多数实验室而言过于昂贵而难以承受。

该DIY系统的优点在于其制造过程固有的简便性、低成本（约6000美元）以及多功能性。此外，构建该DIY装置所需的组件均可从商业零售商和供应链中轻松获得。我们承认，该暴...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

AR、XH 和 PE 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01HL140398 以及 Gilson Longenbaugh 基金会资助的支持。DEMM 和 KK 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01HL136333 和 R01HL134880（KYK）以及 Helis 医学研究基金会资助的支持。DEMM 还获得了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）高级研究 Gilliam 奖学金的支持。PE 还获得了国家环境卫生科学研究所（NIEHS）精准环境健康科学培训 T32 ES027801 奖学金项目的支持。JC 和 MF 获得了 MD 安德森癌症中心表观遗传学与分子致癌学系烟草研究基金以及表观遗传学中心（授予 MF 的学者奖）的支持。FK 和 YZ 获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01 ES029442-01 和 R01 AI135803-01 以及美国退伍军人事务部杰出研究资助 CX000104 的支持。本项目得到了贝勒医学院细胞计数与细胞分选核心设施的支持，资助来自德克萨斯州癌症预防研究所核心设施支持奖（CPRIT-RP180672）、美国国立卫生研究院（CA125123 和 RR024574），并得到 Joel M. Sederstrom 的协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 英寸紧固件Lowes756990
1/4 英寸带倒钩 Y 型接头VWR89093-282
1/4 英寸直通管接头VWR62866-378
1/8 英寸六角管嘴Lowes877221
1/8 英寸螺纹耦合接头Lowes877208
1/8 英寸螺纹公端适配管嘴接头Lowes877243
10/32 (M) 螺纹直通接头BimbaEB60
3/4 英寸 90 度弯头 CPVC 接头Lowes22643
3/4 英寸氯化聚氯乙烯 (CPVC) 管Lowes23814
3/4 英寸 CPVC 封帽Lowes23773
3/4 英寸 CPVC 滴灌母端适配器Lowes194629
3/4 英寸直径 CPVC 公端适配器Lowes23766
8.5 升带盖密封容器（11.25 英寸 × 7.75 英寸 × 6 英寸）KomaxN/A列为 "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
玻璃排水管（直径 1.75 英寸 × 长度 8 英寸）KIMAX6500
Isonic 电磁阀BimbaV2A02-AW1
万宝路红盒 100'sMarlboroN/A
氧气旋转带倒钩接头Global Medical SolutionsRES002
松下定时器 LT4H-WPanasonicLT4HW该部件由 Shepherd Controls & Associates 内置于阀门控制器中
压力调节器Allied Electronics and Automation70600552另列为 "Norgren R07-100-RGKA"
橡胶塞 #1（单孔）VWR59581-163
橡胶塞 #8.5（单孔）VWR59581-389
Scireq inExpose 系统Scireq 和 Emka TechnologiesN/A用于与我们自制的 WBIS 系统进行对比的商用系统
直通带倒钩接头（8 mm 开口）VWR10028-872
螺纹密封胶带Lowes1184243
螺纹端口适配器BimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 医用空气压缩机MFI MedicalAHC-TE20
Timeter 流量计Allied Healthcare Products15006-03YP2另列为 "Puritan Air Meter"
阀门控制系统Shepherd Controls and AssociatesN/A该公司为此型号定制设计了阀门控制系统。
乙烯基管Vitality MedicalRES3007

参考文献

  1. Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018).
  2. Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
  3. Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
  4. Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
  5. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019).
  6. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
  7. Steensma, D. P. Clinical implications of clonal hematopoiesis. Mayo Clinic Proceedings. 93, 1122-1130 (2018).
  8. Tobacco. Federal Trade Comission. , Available at: . Accessed: 4th (2020).
  9. 3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment. , Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference Cigarettes/detail/936 (2020).
  10. Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
  11. Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
  12. Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
  13. Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
  14. Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
  15. Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
  16. Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
  17. Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, Elsevier Inc. (2017).
  18. Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
  19. Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
  20. Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
  21. Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

使用全身体吸入系统使小鼠暴露于香烟烟雾
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。