基于载体辅助的一锅法小量人源细胞靶向蛋白质组学样品制备

摘要

一种基于蛋白质载体辅助的“一锅法”样品制备方法，结合液相色谱（LC）-选择反应监测（SRM），称为cLC-SRM，是用于少量细胞（包括单个细胞）多重靶向蛋白质组学分析的便捷方法。该方法利用过量外源蛋白质作为载体，并结合高特异性的LC-SRM实现靶向定量。

摘要

对少量人类细胞进行蛋白质分析主要依赖基于抗体的免疫测定法实现靶向蛋白质组学，但该方法存在固有局限性（例如多重检测能力低，且缺乏针对新蛋白质的可用抗体）。基于质谱（MS）的靶向蛋白质组学作为一种替代方法应运而生，因其无需抗体、具有高重数、高特异性和高定量准确性。近年来质谱仪器的进步使得基于质谱的靶向蛋白质组学能够实现对单个细胞中高丰度蛋白质的多重定量。然而，在进行质谱分析时，如何有效处理单细胞并最大限度减少样品损失仍存在技术挑战。为解决这一问题，我们近期开发了一种便捷的蛋白质载体辅助“一锅法”样品制备方法，并结合液相色谱（LC）-选择反应监测（SRM），称为cLC-SRM，用于少量人类细胞的靶向蛋白质组学分析。该方法利用过量外源蛋白质作为载体，结合低体积“一锅法”处理，显著减少表面吸附损失；同时采用高特异性LC-SRM，有效应对因添加外源载体蛋白而增大的动态浓度范围。该方法已成功实现对少量细胞（例如10–100个细胞）中中等丰度蛋白质以及单个细胞中高丰度蛋白质的准确定量。该方法易于实施，且无需专用设备，因此大多数蛋白质组学实验室均可快速采用。本文提供了cLC-SRM分析少量人类细胞的详细实验方案，包括细胞分选、细胞裂解与消化、LC-SRM分析及数据分析。未来仍需进一步提升检测灵敏度和样品通量，以推动靶向单细胞蛋白质组学的发展。我们预期cLC-SRM将在生物医学研究和系统生物学中得到广泛应用，并有望促进精准医学的发展。

引言

基因组学（转录组学）领域的近期技术进步使得能够在单细胞水平上对基因组（转录组）进行全面而精确的分析^1,2,3。然而，单细胞蛋白质组学技术的发展远远落后，但其重要性与基因组学（转录组学）技术相当^4,5,6,7,8。此外，蛋白质丰度并不一定能够从mRNA丰度推断得出⁹，且蛋白质组比转录组更为复杂和动态¹⁰。鉴于这些挑战，通常使用大量混合的细胞群体（即群体细胞）来生成全面的蛋白质组数据^11,12,13。然而，此类群体测量会平均化单个细胞之间的随机变异，从而掩盖了重要的细胞间差异性（即细胞异质性）^4,14。当所关注的细胞仅占细胞总体中很小一部分时（例如早期癌症肿瘤中的肿瘤干细胞），这类群体测量的局限性尤为突出。因此，单细胞蛋白质组学与基因组学（转录组学）之间存在巨大的知识鸿沟。

基于抗体的免疫测定法（例如流式或质谱流式细胞术）主要用于单细胞靶向蛋白质组学分析^{6,7,15,16,17,18}。然而，这类方法存在多重检测能力低、特异性有限，以及针对新关注蛋白的抗体难以获得等局限性。基于质谱（MS）的靶向蛋白质组学因其无需抗体、多重检测能力高（单次分析可检测≥150种蛋白¹⁹）、定量准确度高（可获得绝对量或浓度）、特异性强且重复性好（变异系数≤10% CV）^20,21,22,23，已成为实现精确蛋白定量的替代方案。近年来在样品制备方面的显著进展，使得基于质谱的单细胞蛋白质组学能够对单个人类细胞中高丰度蛋白进行定量分析。然而，基于质谱的单细胞蛋白质组学仍处于发展初期。例如，目前最先进的质谱平台结合超低流速反相液相色谱（RPLC），在单个HeLa细胞总共≥12,000种蛋白中，仅能实现无标记质谱检测和定量约670–870种蛋白^24,25。

目前已有六种基于质谱（MS）的单细胞蛋白质组学方法可用于哺乳动物单细胞分析，其中四种用于全蛋白质组学分析（nanoPOTS：基于纳米孔的一锅法微量样本制备²⁶；iPAD-1：用于单细胞分析的集成式蛋白质组分析装置²⁷；OAD（油-气-液滴）芯片-based单细胞蛋白质组学分析²⁸；SCoPE-MS：基于质谱的单细胞蛋白质组学²⁹），另外两种用于靶向蛋白质组学分析（cLC-SRM：载体辅助液相色谱（LC）-选择反应监测（SRM）³⁰；cPRISM-SRM：载体辅助高压高分辨率分离结合智能选择与多重检测联用SRM³¹）。然而，这些方法均存在技术上的局限性。nanoPOTS、iPAD-1 和 OAD 将样品处理体积缩小至 2–200 nL，尚不具备广泛应用于常规实验操作的条件^26,27,28。对于 SCoPE-MS，TMT（串联质谱标签）载体是在单细胞样品处理后添加的，因此在使用单管进行单细胞处理时，无法有效防止样品处理过程中因表面吸附造成的损失²⁹，导致重复性较差，重复样本间的相关系数仅为 ~0.2–0.4³²。对于 cLC-SRM 和 cPRISM-SRM，使用外源蛋白作为载体更适合靶向蛋白质组学分析，因为过量外源蛋白产生的肽段在 MS/MS 中频繁被测序，显著降低了低丰度内源性肽段被测序的机会^30,31。与用于相对定量的全蛋白质组学不同，这两种靶向蛋白质组学方法可通过已知浓度的重同位素标记内标，实现对少量细胞中蛋白质的准确或绝对定量分析，且具有高重复性。与需要预先进行高分辨率 PRISM 分级、从而产生大量需逐一分析的组分样品的 cPRISM-SRM 相比，cLC-SRM 无需分级，在样品通量方面具有显著优势，可在单次分析中同时定量数百种蛋白质，但检测灵敏度相对较低³⁰。因此，cLC-SRM 更易于推广，应更广泛适用于少量细胞以及质量受限样本的准确多重蛋白质分析。

本文介绍了一种详细的cLC-SRM操作流程，可用于对少量人类细胞（包括单个细胞）进行便捷的靶向蛋白质组学分析。该流程主要包括以下步骤：通过FACS（荧光激活细胞分选）进行细胞分选，于低体积单管聚合酶链式反应（PCR）管中进行细胞裂解与消化，LC-SRM数据采集，以及利用公开可用的Skyline软件进行SRM数据分析（图1）。结合我们先前已建立完善的SRM检测方法，该技术的广泛适用性已得到验证，成功实现了对1–100个MCF7或MCF10A细胞中EGFR/MAPK信号通路蛋白的绝对定量，并在宽动态范围浓度下确定了每细胞中通路相关蛋白的拷贝数³⁰。我们预计，借助本详细操作方案，大多数蛋白质组学研究人员均可在其实验室中快速建立cLC-SRM技术，以满足其对超微量样本（例如稀有肿瘤细胞）进行精确蛋白质分析的研究需求。

图1：cLC-SRM（辅助式一体化样品制备联合液相色谱-选择反应监测）中所有步骤的概览。采用非人源细胞裂解物消化产物（例如Shewanella oneidensis）预处理PCR管，以包被管壁表面。通过FACS分选出的少量人源细胞或单个细胞被收集至预处理过的PCR管中。依次向样品管中加入BSA蛋白（或非人源细胞裂解物蛋白质组）载体、重同位素内标（IS）以及TFE（或DDM），以促进细胞裂解并减少表面吸附损失。从概念上讲，联合使用DDM和非人源细胞裂解物蛋白质组载体可在cLC-SRM中发挥良好作用。细胞裂解通过超声处理完成，蛋白质变性则通过高温加热实现。DTT和IAA试剂分别用于还原和烷基化（此步骤为可选）。加入胰蛋白酶进行消化，其胰蛋白酶与蛋白质的用量比例远高于标准胰蛋白酶消化所需比例。移除样品管盖后，直接将PCR管插入液相色谱小瓶中进行LC-SRM的直接分析。采集到的SRM数据使用公开可用的Skyline软件进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

注意：逐步的 cLC-SRM 分析见图1。

1. PCR 管的预处理

1. 向 PCR 管中加入 100 µL 非人类来源（例如 Shewanella oneidensis）的细胞裂解物消化液，浓度为 0.2 µg/µL。在室温下孵育过夜，以包被 PCR 管表面。
2. 用移液器吸除细胞裂解物消化液，用 HPLC 级水清洗 PCR 管 3 次，然后在通风橱中将 PCR 管自然晾干。
3. 将包被后的 PCR 管储存于 4 ˚C 冰箱中，待后续使用。

2. FACS 分选

1. 使用可被激光激发的荧光染料标记的荧光微球，将荧光激活细胞分选仪（FACS）（参见材料表）校准至96孔PCR板中，以提供可靠的参考信号。
2. 确认FACS仪器能够准确地将细胞分选至PCR板孔的底部。
   1. 将分选液流角度设置为尽可能小，以最大化细胞落入孔底的成功率，避免细胞撞击孔壁。
   2. 通过测试液流将PBS缓冲液液滴（例如100个液滴）“分选”到空板的孔中，以确认收集的液滴位于孔底。如果液滴未落在正确位置，需重新校准细胞分选仪，并重复操作，直至分选液流中的液滴被正确收集。
3. 将包被好的PCR管放入96孔PCR管架中。
4. 将所需数量的人乳腺细胞（MCF7或MCF10A）分选至预先包被的PCR管中。
5. 立即以100 x g 离心10分钟（4 °C），使分选后的乳腺细胞沉降至管底，避免潜在的细胞损失。
6. 将分选后的细胞储存于-80 °C超低温冰箱中，待后续分析使用。

3. 添加蛋白载体、重同位素内标和三氟乙醇

1. 向含有收集细胞的 PCR 管中加入 4 µL 的 25 mM NH₄HCO₃。
2. 向样品管中加入 1 µL 的 10 ng/µL 牛血清白蛋白（BSA）溶液（溶于 25 mM NH₄HCO₃）。
3. 向样品管中加入 0.3 µL 的 100 fmol/µL 粗提重肽标准品（总量为 30 fmol）。
   注意：EGFR/MAPK 信号通路蛋白的粗提重肽标准品分装浓度为 100 fmol/µL（溶于 25 mM NH₄HCO₃）。请将少量粗提重肽标准品以 100 fmol/µL 的浓度加至溶液中央，并确保移液枪头内无残留液体。
4. 向样品管中加入 9 µL 的 100% TFE，使终浓度约为 60% TFE。
5. 以 1500 × g 离心 5 分钟，随后以 100 × g 轻柔涡旋振荡 3 分钟。

4. 细胞裂解和蛋白质变性

1. 将FACS分选的乳腺细胞置于冰上进行超声处理，每次超声1分钟，间隔1分钟，共进行5个循环，超声参数为70%的振幅和0.5 Hz。
2. 使用带有加热盖的PCR仪，在90 °C下孵育样品1小时以实现蛋白质变性。
   注意：三氟乙醇（TFE）是一种挥发性溶剂，沸点为74 °C，因此选择加热盖以避免样品完全干燥导致大量损失。
3. 将样品冷却至室温，并在1500 x g 条件下离心3分钟。

5. 还原和烷基化（可选）

1. 加入 0.6 µL 的 50 mM DTT，使终浓度为 2 mM。
   注意：DTT 溶液需每次新鲜配制。称取 77.5 mg DTT，溶于 1 mL 25 mM NH₄HCO₃ 中，配制成 500 mM DTT 溶液。取 10 µL 500 mM DTT 加入 90 µL 25 mM NH₄HCO₃ 中，配制成 50 mM DTT 溶液。
2. 在 1500 x g 条件下离心 5 分钟，然后以 850 rpm 轻柔混匀 3 分钟。
3. 在 56°C 下孵育 1 小时，同时以 100 x g 轻微振荡。
4. 将样品冷却至室温，在 1500 x g 条件下离心 3 分钟。
5. 向 RT-PCR 管中加入 0.5 µL 的 60 mM IAA，终浓度约为 2 mM。
   注意：IAA 溶液需每次新鲜配制。称取 74.3 mg IAA，溶于 1 mL 25 mM NH₄HCO₃ 中，配制成 400 mM IAA 溶液。取 15 µL 400 mM IAA 加入 85 µL 25 mM NH₄HCO₃ 中，配制成 60 mM IAA 溶液。
6. 避光、室温孵育 30 分钟，同时以 100 x g 轻微振荡。
   ​注意：当目标蛋白未选择含半胱氨酸的肽段时，还原和烷基化步骤可省略。

6. 胰蛋白酶消化

1. 使用 SpeedVac 浓缩仪将样品体积减少至约 4 µL。
   注意：三氟乙醇（TFE）是一种沸点为 74°C 的挥发性溶剂。高浓度 TFE 会抑制胰蛋白酶消化。
2. 加入 9 µL 的 25 mM NH₄HCO₃ 和 1–3 µL 的 15 ng/µL 胰蛋白酶，使最终胰蛋白酶浓度为 1–3 ng/µL，用于消化。
   ​注意：对于 10 个经 FACS 分选的人乳腺细胞（约 1 ng），胰蛋白酶与蛋白质的酶量比 ≥15:1，比标准胰蛋白酶消化中的比例（1:50）高出 750 倍。
3. 在 100 x g 条件下轻轻混匀 3 分钟，并在 37 °C 下孵育过夜（约 16 小时）。
4. 加入 0.5 µL 的 5% 甲酸以终止酶促反应。
5. 在 1500 x g 条件下离心 1 小时。
6. 若需进行后续 LC-SRM 分析，则储存于 -80 °C 冰箱；若需立即分析，则储存于 4 °C 冰箱。

7. 直接进行液相色谱-选择反应监测分析的准备

1. 取下用于收集（步骤 2）和处理（步骤 6）FACS 分选乳腺细胞的 PCR 管管盖。
2. 将 PCR 管插入 LC 小瓶中。
3. 关闭 LC 小瓶，用于 LC-SRM 分析。
   ​注意：对于在 96 孔 PCR 板中处理的少量细胞，将添加封板膜以密封板子，直接用于 LC-SRM 分析。

8. 液相色谱-选择反应监测分析

1. 使用超高效液相色谱（UPLC）联用三重四极杆质谱仪分析样品。
2. 通过不锈钢金属接头将毛细管C18色谱柱（标准梯度：内径75 µm × 长度20 cm；短梯度：内径100 µm × 长度10 cm）连接至化学蚀刻的20 µm内径熔融石英电喷雾发射器。
3. 使用20 µL的进样环，将全部样品（约15 µL）直接加载至液相色谱柱中，以最大化检测灵敏度。
4. 采用含0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的90%乙腈溶液分别作为毛细管反相液相色谱（RPLC）分离的流动相A和流动相B。
5. 当检测大量目标蛋白（>10种）时，采用流速为300 nL/min的标准二元梯度。标准梯度程序：5–20% B在26分钟内，20–25% B在10分钟内，25–40% B在8分钟内，40–95% B在1分钟内，95% B保持7分钟，总运行时间为52分钟；随后分析柱在99.5% A条件下重新平衡8分钟。
6. 当检测少量目标蛋白（≤10种）时，采用流速为400 nL/min的短梯度程序以实现快速分离。短梯度程序：5–95% B在5分钟内完成，随后分析柱在99.5% A条件下重新平衡5分钟，总液相运行时间为10分钟。
7. 操作三重四极杆质谱仪时，离子喷雾电压设为2,400 ± 100 V，毛细管偏置电压为35 V，锥孔偏置电压为-5 V，毛细管入口温度为220° C。
8. 其他三重四极杆质谱参数通过自动调谐和校准获得，无需进一步优化。
9. 在进行样品的液相色谱-选择反应监测（LC-SRM）分析前，将不同浓度的粗制重标肽标准品加入20–50 ng/µL的非人源细胞裂解物酶解产物中，以确定肽段的液相保留时间（RT），用于建立定时SRM方法，并识别可能干扰的过渡离子通道，以实现准确定量。
10. 采用基于保留时间（RT）的定时SRM模式进行多重定量，扫描窗口≥6分钟。
    ​注：扫描窗口将根据特定时间段内包含的离子过渡数量相应调整。
11. 设定总循环时间为1秒，每个离子通道的驻留时间根据在不同保留时间窗口内扫描的离子通道数量自动调整。每个SRM离子通道所需的最短驻留时间为10毫秒。所有目标蛋白可在一次LC-SRM分析中同时被监测。

9. 数据分析

1. 将原始数据文件导入公开可用的 Skyline 软件³³，以可视化每种目标肽段的数据，评估其可检测性。
2. 采用两个标准判断 SRM 峰的检出与积分：1）相同的液相色谱保留时间；2）内源性（轻）肽段与其相应的同位素标记（重）肽段内标在多个跃迁之间的 SRM 峰相对强度比值大致相同。
3. 手动检查所有 SRM 数据，依据上述两个标准确保 SRM 峰的正确归属及峰边界划分，以实现可靠的定量分析。
4. 选择 SRM 信号强且无基质干扰的最佳跃迁用于蛋白质定量，其余跃迁作为参考。
5. 使用多个重复样本来计算标准差（SD）和变异系数（CV）。
6. 通过在标准梯度±15 s、短梯度±6 s的保留时间范围内，以峰顶点强度除以平均背景噪声来计算信噪比（S/N）。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别定义为 S/N 比值至少达到 3 和 7 时的最低浓度点。
7. 除 S/N ≥7 外，确定 LOQ 值时还需满足另一保守性标准：替代肽段在不同细胞数量下的响应必须处于线性动态范围之内。
8. 使用 Excel 软件绘制所有校准曲线。将 QQQ 质谱的 RAW 数据导入公开可用的 Skyline 软件，以显示所监测目标蛋白多个跃迁的提取离子色谱图（XICs）。

结果

首先使用少量 MCF7 细胞裂解液（0.5–20 ng，相当于 5–200 个细胞）评估 cLC-SRM 在 EGFR/MAPK 信号通路蛋白靶向定量中的性能，因为与通过 FACS 分选的少量细胞相比，这些样品更均匀且变异较小。如图 2A所示，XIC 图谱清晰显示了来源于每个 MCF7 细胞约含 220,000 个拷贝的 GRB2 蛋白的肽段 ATADDELSFK 的 SRM 转化信号³⁴。cLC-SRM 能够对低至相当于 5 个 MCF7 细胞的内源性 ATADDELSFK 进行可重复定量，信噪比（S/N）为 14，定量灵敏度约为 1,800 zmol。所得校准曲线表现出优异的线性关系，高丰度 GRB2 蛋白的定量下限（LOQ）为 5 个细胞，中等丰度 PTPN11 蛋白的定量下限为 20 个细胞（图 2B）。所有数据点中各目标肽段的 SRM 技术变异系数（CV）中位数约为 9%，与标准 LC-SRM 的...

讨论

cLC-SRM 是一种便捷的靶向蛋白质组学方法，可实现对少量细胞（包括单个细胞）的准确多重蛋白质分析。该方法利用蛋白质载体辅助的“一步式”样品制备流程，其中细胞收集、多步细胞裂解与消化以及肽段消化产物转移至毛细管液相色谱柱进行质谱分析等所有步骤均在一个容器（例如单个管或单个孔）中完成（图1）。这种“一体化”的低体积单管处理方式通过显著减少可能的表面吸附损失，有效提高了少量细胞在靶向蛋白质组学分析中的回收率。

cLC-SRM 分析有两个关键步骤：1）在 FACS 分选后，必须立即进行离心，以确保收集的细胞位于管底或孔板底部，因为处理少量细胞时所用体积较小（约 15 µL）；2）在加入胰蛋白酶进行消化前，需将 TFE 浓度降低至 ≤10%，以实现有效的消化。为避免样品干燥导致不可逆的损失，建议在 SpeedVac 浓缩过程中频繁检查样品体积（剩余体积约 4 µL）。通过省略还原和烷基化步骤，可进一步简化“一步法”样品制备流程，且对消化效率的影响可忽略不计。但其缺点是无法选择含半胱氨酸的肽段作为目标蛋白的替代肽段。为避免使用 S...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL 玻璃液相色谱小瓶	Microsolv	9502S-WCV	用于盛装 PCR 管以进行自动进样
BSA	Sigma-Aldrich	P0834-10×1mL	载体蛋白，可显著减少表面吸附损失
DTT	Thermo Scientific	A39255	还原反应试剂
甲酸	Thermo Scientific	28905	用于终止酶反应的试剂
IAA	Thermo Scientific	A39271	烷基化试剂
肽段内标物	New England Peptide		用于 EGFR/MAPK 通路蛋白的靶向定量
RT-PCR 管	GeneMate Bioexpress	T-3035-1	0.2 mL PCR 管，用于单管样品制备
Skyline 软件	华盛顿大学		公开可用的 SRM 数据分析软件
超声破碎仪	Hielscher 超声技术公司	UTR200	冰上超声处理以实现细胞裂解
真空离心浓缩仪	Thermo Scientific		降低 TFE 比例以实现有效的胰蛋白酶消化
TFE	Sigma-Aldrich	18370-10×1mL	60% TFE 用于细胞裂解
带加热盖的热循环仪	Peltier Thermal Cycler	PTC-200	用于蛋白质变性的加热装置
Trypsin Gold	Promega	V528A	用于蛋白质消化的酶
Waters BEH C18 色谱柱	Waters		用于肽段分离的 C18 色谱柱