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方法文章

测定生物防治产品的挥发性和非挥发性抗真菌活性

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⸱

DOI：

10.3791/61798

⸱

2020年12月5日

 ,  ,  , 
1Food Engineering Laboratory, Sup’Biotech

本文内容

摘要

我们介绍一种改良的基于琼脂的方法，旨在定量评估植物源性产品的抗真菌作用。该方案可同时评估挥发性和非挥发性成分对抗真菌活性的贡献。此外，在单个实验体系中即可测定其对真菌在关键发育阶段的抑制效果。

摘要

本方案基于一种打孔转移技术，可准确定量微生物的数量及其发育阶段。将特定数量的孢子均匀涂布于琼脂平板上，随后将该平板在设定条件下孵育一定时间，使真菌达到预期的发育阶段（孢子本身无需孵育）。接着，取出被孢子、菌丝或菌丝体覆盖的琼脂小块，并将其转移至含有待测抗真菌化合物的琼脂培养基上，抗真菌物质可置于与真菌一定距离处或直接接触。该方法适用于测试液体提取物和固体样品（粉末）。尤其适用于量化生物活性混合物中挥发性与非挥发性成分的相对作用，并明确其对孢子、早期菌丝及菌丝体的具体影响。

该方法对于表征生物防治产品（尤其是植物来源产品）的抗真菌活性具有重要意义。实际上，在植物处理中，该结果可用于指导施用方式的选择，并确定触发阈值。

引言

全球水果和蔬菜的损失可高达总产量的50%1，其中大部分是由于田间或采后贮藏期间真菌腐败引起的食品腐烂所致2,3，尽管自20世纪中叶以来已广泛使用合成杀菌剂4。然而，由于这些物质对环境和健康构成严重危害，其使用正受到重新审视。随着其有害影响在各类生态系统中不断显现，并且潜在健康风险的证据日益积累5,6，人们正在开发新型替代方案，以取代传统的预防性策略，用于采前和采后处理7,8,9。因此，我们面临的挑战具有双重目标：新的杀菌策略不仅必须维持对植物病原菌防护的有效性水平，同时还必须显著降低农业实践对环境的影响。为实现这一雄心勃勃的目标，研究人员正提出借鉴植物在自然进化过程中形成的防御机制的新方法，因为已有超过1000种植物被证实具有抗菌特性8。例如，那些已进化出天然杀菌物质以对抗植物病原菌的植物，正成为开发新型生物防治产品的宝贵资源2。精油便是此类分子的代表性例子。例如，Origanum（牛至）精油可在温室条件下保护番茄植株免受灰霉病侵害10，而加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.）和桂皮精油已被证明可有效防止采后草莓遭受灰霉病的损害11,12。这些实例表明，生物防治——尤其是来源于植物的产品——代表了一种兼具生物学有效性和环境可持续性的解决方案。

因此，植物是作物保护产业潜在有益分子的重要资源。然而，尽管植物源产品通常被认为安全、无植物毒性且环境友好2，但仅有少数植物产品被提议用作生物防治产品。从实验室到田间的转化过程中已观察到一些困难，例如在活体应用后效果降低2,9。因此，提高实验室测试对田间效果的预测能力变得尤为重要。在此背景下，针对植物源产品的抗真菌测试方法十分必要，既可用于评估其抗真菌效果，也可用于确定其最佳使用条件。具体而言，生物防治产品通常比化学杀菌剂效率较低，因此深入了解其作用机制对于提出合适的制剂方案、确定田间施用方式以及明确病原菌的哪个发育阶段对候选生物产品敏感至关重要。

目前用于评估抗菌和抗真菌活性的方法包括扩散法，如琼脂-纸片扩散法、稀释法、生物自显影法和流式细胞术13。这些技术中的大多数，特别是标准的抗真菌敏感性检测方法——琼脂-纸片扩散法和稀释法——非常适合评估可溶性化合物对液体悬浮状态下的细菌和真菌孢子的抗菌活性14。然而，这些方法通常不适用于测试固体化合物（如干燥的植物粉末），也不适用于在菌丝生长过程中定量评估抗真菌活性，因为这些方法需要对孢子进行稀释或在琼脂平板上铺展孢子，和/或对抗真菌化合物进行稀释13。在食物中毒法（food-poisoned method）中，将含有抗真菌剂的琼脂平板接种来自7天龄真菌培养物的5–7 mm直径菌块，但未考虑起始菌丝量的精确数量。培养后，抗真菌活性以菌落径向生长抑制率的百分比来确定17,18,19。通过该方法，我们可以评估抗真菌物质对菌丝生长的影响。相比之下，琼脂稀释法则是将孢子直接接种于含有抗真菌化合物的琼脂平板表面，以测定其对孢子的抗真菌活性13,20,21。这两种方法在抗真菌活性评估方面提供互补的结果。然而，它们是两种并行使用的独立技术，由于在两种方法中所使用的起始真菌材料量不同，因此无法对同一抗真菌化合物在孢子和菌丝上的相对效力进行准确的平行比较17,20,22。此外，植物来源产品的抗真菌活性通常源于植物为抵御病原体而合成的多种抗真菌分子的协同作用。这些分子包括蛋白质、多肽23,24，以及化学结构多样、属于不同类别（如多酚类、萜类、生物碱25、葡萄糖硫苷8和有机硫化合物26）的代谢产物。其中一些分子具有挥发性，或在病原体侵袭过程中转化为挥发性物质27。这些物质大多是水溶性差且蒸气压较高的化合物，需通过水蒸馏方式回收为精油，其中部分精油的抗菌活性已有充分研究证实28。为测量挥发性化合物经蒸发并通过气相迁移后的抗菌活性，已开发出气相介导的敏感性检测方法29。这些方法基于将抗真菌化合物置于与微生物培养物相隔一定距离的位置29,30,31,32,33。在常用的气相琼脂检测法中，将精油滴加到滤纸片上，然后将纸片置于培养皿盖中央，远离接种于琼脂培养基表面的细菌或真菌孢子悬液。随后以与琼脂-纸片扩散法相同的方式测量生长抑制圈的直径20,24。其他方法也被开发用于对源自精油的气相抗真菌敏感性进行定量测定，例如基于肉汤稀释法推导出气相介导的抑制活性32，或基于琼脂-纸片扩散法进行改进的方法31。这些方法通常仅适用于气相活性研究，而不适用于接触抑制实验。因此，无法确定挥发性与非挥发性成分在复杂生物活性混合物抗真菌活性中的相对贡献。

我们开发的定量方法旨在测量干燥植物粉末对琼脂培养基表面接种的定量孢子和菌丝的抗真菌作用，以模拟植物病原菌在侵染植物过程中产生的气生菌丝生长以及相互连接的菌丝网络1516。该方法是在琼脂稀释法和食物中毒法基础上改进的实验体系，能够在同一实验设置中并行量化挥发性和非挥发性抗真菌代谢物的贡献。本研究中，该方法已通过三种特征明确的抗真菌制剂的活性进行了验证。

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方案

1. 接种物制备

  1. 实验前，取4 °C保存的Trichoderma spp. SBT10-2018孢子5 µL接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，于30 °C、常规光照条件下培养4天，以促进分生孢子的形成42（图1，A图）。
    注：Trichoderma spp. SBT10-2018菌株分离自木材，因其生长迅速且孢子易于回收，本研究将其作为模式菌株使用。该菌株由本实验室保藏。
  2. 收集分生孢子（图1，A图）
    1. 向Trichoderma菌丝体上加入3 mL 0.05% Tween-20溶液。
    2. 使用接种耙轻轻刮取，使分生孢子从分生孢子梗上释放；注意避免用力按压菌丝体，以防菌丝断裂脱落。
    3. 用移液器迅速吸取液体，防止其被琼脂培养基吸收，并转移至15 mL离心管中。
    4. 使用血细胞计数板统计总孢子数量，并配制浓度为3 × 106 个孢子/mL的孢子悬液。
      注：此步骤需谨慎操作，避免带入菌丝。孢子悬液制备完成后应在显微镜下检查。对于菌丝体高度气生且蓬松的菌株，可增加一步过滤操作，使用40 µm孔径滤网过滤，以去除残留的菌丝碎片。

2. 真菌平板制备（图1，面板B）

  1. 用移液器将 100 µL 浓度为 3 × 106 个孢子/mL 的孢子悬液滴加到直径为 9 cm、含有 PDA 培养基的培养皿中，使孢子密度达到 4,800 个孢子/cm2，相当于每 5 mm 直径的琼脂块中含有 925 个孢子。
  2. 用无菌刮铲加入 10 g 直径为 2 mm 的玻璃珠，并沿操作者手臂方向及其垂直方向进行前后移动，使孢子在琼脂表面均匀分布。
  3. 将培养皿旋转 90°，重复上述旋转操作（如步骤 2.2 所述）；重复此过程，直至培养皿完成整圈旋转。
  4. 立即使用该培养皿开展需要孢子的实验；若需早期菌丝或菌丝体，则将培养皿在 30 °C 下分别培养 17 h 或 24 h。
    注意：为比较菌丝块转移法与菌丝圆盘转移法测定的抗真菌活性，可在孢子涂布后，用无菌镊子将无菌的 5 mm 纤维素圆盘随机放置于琼脂平板表面。

3. 抗真菌化合物的制备

  1. 植物源性产品制备：大蒜粉的制备
    1. 剥去新鲜大蒜的蒜瓣外皮，使用手术刀片将蒜瓣切成 2–3 mm 宽的薄片。
    2. 在 40 °C 下将切片风干 2 天。
    3. 使用刀式研磨机研磨切片，每次 15 秒，共研磨 3 次，以获得细粉。
    4. 将大蒜粉在使用前储存于 4 °C 的 50 mL 离心管中。
      注意：由于大蒜不进行高压灭菌（以防止热敏性抗真菌化合物降解），使用前需用 70% 乙醇清洁研磨机、手术刀和干燥设备。
  2. 精油的制备
    1. 用 0.5% Tween-80 配制 0.5%、1%、2.5%、5% 和 20% 的 Thymus vulgaris 精油溶液。
    2. 充分混匀形成乳剂，然后加入 PDA 培养基中（见第 4.2 节）。
  3. 多菌灵的制备
    1. 称取多菌灵，用乙醇配制成 200 mg/L 的溶液（多菌灵在水中溶解度差）。
    2. 将溶液在室温下储存，待加入 PDA 培养基前使用（见第 4.2 节）。
      警告：多菌灵对健康和环境具有危害。操作时应佩戴手套和口罩，并将其储存在通风良好的场所。

4. 接触抑制实验

  1. 含大蒜粉琼脂平板的制备
    1. 制备并高压灭菌PDA培养基。
    2. 使用无菌刮勺将所需量的大蒜粉称取至50 mL离心管中，以获得通常在0.25 mg/mL至16 mg/mL范围内的浓度。
    3. 在用手腕内侧测试培养基温度后，加入10 mL PDA。温度应尽可能低，以防止敏感分子降解。理想温度应为45 °C。
    4. 通过反复倒置离心管轻轻混匀，使粉末在PDA培养基中均匀分散。迅速将10 mL混合液倒入直径为5 cm的培养皿中（图1，面板C）。
    5. 将培养皿置于室温下，等待琼脂凝固。
  2. 含精油或多菌灵琼脂平板的制备
    1. 将10 mL PDA加入50 mL离心管中。参照第4.1.3节方法检测温度。
    2. 加入100 µL不同浓度的百里香（Thymus vulgaris）精油PDA溶液，以获得0.005%、0.01%、0.025%、0.05%和0.2%的终浓度（见第3.2.1节）。
    3. 从200 mg/L的多菌灵母液中加入所需体积，以获得0.0625–2 mg/L范围内的终浓度（见第3.3.1节）。
    4. 通过反复倒置离心管轻轻混匀，迅速将10 mL混合液倒入直径为5 cm的培养皿中（图1，面板C）。
    5. 将培养皿置于室温下，等待琼脂凝固。
  3. 接触抑制实验（图1）
    1. 使用直径为5 mm的无菌不锈钢管，在含有PDA或含抗真菌化合物PDA的培养皿中央画一个圆。用无菌牙签移除该位置的琼脂柱（面板C）。
    2. 使用直径为5 mm的无菌不锈钢管，在第2节制备的真菌培养平板上随机打孔，每块平板打15–20个孔（面板B）。
    3. 用无菌牙签小心取出覆盖有孢子、早期菌丝或菌丝体的琼脂柱，并将其植入含有PDA或含抗真菌化合物PDA的培养皿的空位中（面板C）。
    4. 将含有孢子的培养皿在30 °C下孵育48 h，含早期菌丝的培养皿孵育31 h，含菌丝体的培养皿孵育24 h（面板C） 。
    5. 测量菌丝径向生长直径，并使用以下公式计算相对于对照组的真菌生长抑制率（面板D）
      ​% 真菌生长抑制率 = (C - A/C) × 100
      其中C为PDA培养基中菌丝径向生长直径，A为含抗真菌化合物PDA培养基中菌丝径向生长直径。
      注：为比较菌丝块转移与菌丝圆盘转移后的抗真菌活性，可用无菌镊子将先前置于真菌平板表面（见第2节注释）的直径5 mm菌丝圆盘转移至含有PDA或含抗真菌化合物PDA的培养皿中央，并按照琼脂块转移的相同步骤进行操作

5. 气相抑制试验

  1. 含大蒜粉琼脂平板的制备
    1. 按照第3.1节进行。
  2. 含精油或多菌灵的琼脂平板制备
    1. 按照第3.2节和第3.3节的步骤进行。
  3. 真菌平板的制备
    1. 按照第2节的步骤进行。
  4. 气相抗真菌抑制试验图1)
    1. 将10 mL PDA培养基倒入直径为5 cm的培养皿盖中，培养皿底部含有10 mL PDA培养基或含抗真菌化合物的10 mL PDA培养基。室温下静置，直至琼脂完全凝固（图C）。
    2. 使用50 mL离心管作为校准工具，在盖子中央获得一个PDA圆片；用无菌刮铲去除圆圈外的PDA（图C）。
    3. 用直径为5 mm的无菌不锈钢管在置于培养皿盖内的PDA培养基中央画一个圆，然后用无菌牙签弃去该琼脂圆柱（图C）。
    4. 使用无菌的直径为5 mm的不锈钢管，在真菌平板上随机打孔，方法同4.3.2节 （图B）。
    5. 使用无菌牙签，小心地将真菌平板上带有孢子、早期菌丝或菌丝体的菌块转移至检测平板的盖内（图C）。
    6. 在30 °C下孵育，步骤同4.3.4节（图C）。
    7. 测量菌落径向生长的直径，并使用第4.3.5节中的公式计算真菌生长抑制率百分比。 （图 D）。

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结果

为了评估定量方法区分不同类型抗真菌化合物作用模式的能力，我们比较了三种已知抗真菌剂的效果。多菌灵是一种非挥发性合成杀菌剂，已广泛用于防治植物的多种真菌病害39,40。Thymus vulgaris 精油因其抗菌和抗真菌活性而被广泛报道，并被用作天然食品防腐剂41。大蒜粉被选为一种植物源生物制品的模型，传统上被用作具有抗菌活性的天然药物，其活性主要归因于挥发性有机硫化合物的存在，但也与非挥发性皂苷和酚类化合物的存在有关26，这使得该模型在本研究中具有相关的复杂性。

该定量方法依赖于从孢子到菌丝体的不同发育阶段，将含有定量真菌的琼脂块进行转移；而在食物中毒法中，则是将5至7天龄的菌丝体从纤维素圆盘上转移。13在该实验中，孢子、早期菌丝（培养17小时）和菌丝体（培养24小时）被用作起始真菌材料。采用打孔转移法可能...

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讨论

本文介绍的方法可用于评估经最少加工处理的植物源性产品的抗真菌特性。在本实验方案中，通过使用直径为2 mm的玻璃珠，可实现孢子在琼脂表面的均匀分布。该步骤需要一定的操作技巧，以确保玻璃珠分布得当，从而获得可重复的实验结果，最终实现在真菌生长不同阶段对其抗真菌效应进行比较。我们发现，使用直径5 mm的玻璃珠或在涂布过程中过度旋转会导致菌落生长直径不一致。因此，建议在正式实验前进行充分训练，以熟练掌握孢子分布技术。此外，当需要测试植物粉末时，必须注意将其均匀分散于琼脂培养基中。为防止粉末沉降至培养皿底部，应在熔融培养基温度降至45 °C时（当室温为24 °C时）将样品混入琼脂培养基。该温度需根据当地室温进行相应调整，以避免发生沉淀。

尽管本文所述方法可提供有价值的见解，但也必须考虑一些局限性。该方法能够在单次实验设置中实现准确且并行的比较，但代价是需要大量的准备时间，因为所需制备的琼脂平板数量可能相当多，具体取决于待回答的科学问题。此外，本实验是一种为5 cm培养皿设计的中等规模检测方法，因此要测试所有方面所需的活性物质用量可能较大。这意味着稀有物质可能不适用于本方案。可以考虑使用更小的...

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致谢

我们非常感谢 Frank Yates 提供的宝贵建议。本工作由 Sup'Biotech 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Autoclave-vacuclav 24B+Melag
多菌灵Sigma 378674-100G
蒸馏水
Eppendorf 管Sarstedt72.7061.5 mL
Falcons 管Sarstedt54725450 mL
直径 5 毫米的不锈钢管零售商店/
食品脱水机Sancusto六层托盘
大蒜粉Organic shop
玻璃珠CLOUP65020figure-materials-1 2 mm
血细胞计数板Jeulin713442/
培养箱Memmert UM40030 °C
刀式研磨机BoschTSM6A013B
手动细胞计数器LabboxHCNT-001-001/
测量尺零售商店
微生物安全柜FASTERFASTER BHA36, II 型, Cat 2
微量移液器Mettler-Toledo17014407100 - 1000 µL
微量移液器Mettler-Toledo1701441120 - 200 µL
微量移液器Mettler-Toledo170144122 - 20 µL
培养皿Sarstedt82-1194500figure-materials-2 55 mm
培养皿Sarstedt82-1473 figure-materials-3 90 mm
移液控制器-EASY 60LabboxEASY-P60-001/
马铃薯葡萄糖琼脂Sigma 70139-500G
精密天平-RADWAGGrosseronB126698AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
接种耙Sarstedt86-1569001/
倒置三目显微镜 AE31EGrosseronM097917/
无菌刻度移液管Sarstedt125400110 mL
百里香精油药店100% 精油
1000 µL 吸头 Sarstedt70.762010
20 µL 吸头 Sarstedt70.760012
200 µL 吸头Sarstedt70.760002
牙签零售商店
木霉属菌株LRPIA 实验室菌株
Tween-20 Sigma P1379-250ML
Tween-80Sigma P1754-1L
镊子LabboxFORS-001-002/

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