测定生物防治产品的挥发性和非挥发性抗真菌活性

摘要

我们介绍一种改良的基于琼脂的方法，旨在定量评估植物源性产品的抗真菌作用。该方案可同时评估挥发性和非挥发性成分对抗真菌活性的贡献。此外，在单个实验体系中即可测定其对真菌在关键发育阶段的抑制效果。

摘要

本方案基于一种打孔转移技术，可准确定量微生物的数量及其发育阶段。将特定数量的孢子均匀涂布于琼脂平板上，随后将该平板在设定条件下孵育一定时间，使真菌达到预期的发育阶段（孢子本身无需孵育）。接着，取出被孢子、菌丝或菌丝体覆盖的琼脂小块，并将其转移至含有待测抗真菌化合物的琼脂培养基上，抗真菌物质可置于与真菌一定距离处或直接接触。该方法适用于测试液体提取物和固体样品（粉末）。尤其适用于量化生物活性混合物中挥发性与非挥发性成分的相对作用，并明确其对孢子、早期菌丝及菌丝体的具体影响。

该方法对于表征生物防治产品（尤其是植物来源产品）的抗真菌活性具有重要意义。实际上，在植物处理中，该结果可用于指导施用方式的选择，并确定触发阈值。

引言

全球水果和蔬菜的损失可高达总产量的50%¹，其中大部分是由于田间或采后贮藏期间真菌腐败引起的食品腐烂所致^2,3，尽管自20世纪中叶以来已广泛使用合成杀菌剂⁴。然而，由于这些物质对环境和健康构成严重危害，其使用正受到重新审视。随着其有害影响在各类生态系统中不断显现，并且潜在健康风险的证据日益积累^5,6，人们正在开发新型替代方案，以取代传统的预防性策略，用于采前和采后处理^7,8,9。因此，我们面临的挑战具有双重目标：新的杀菌策略不仅必须维持对植物病原菌防护的有效性水平，同时还必须显著降低农业实践对环境的影响。为实现这一雄心勃勃的目标，研究人员正提出借鉴植物在自然进化过程中形成的防御机制的新方法，因为已有超过1000种植物被证实具有抗菌特性⁸。例如，那些已进化出天然杀菌物质以对抗植物病原菌的植物，正成为开发新型生物防治产品的宝贵资源²

方案

1. 接种物制备

1. 实验前，取4 °C保存的Trichoderma spp. SBT10-2018孢子5 µL接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，于30 °C、常规光照条件下培养4天，以促进分生孢子的形成⁴²（图1，A图）。
   注：Trichoderma spp. SBT10-2018菌株分离自木材，因其生长迅速且孢子易于回收，本研究将其作为模式菌株使用。该菌株由本实验室保藏。
2. 收集分生孢子（图1，A图）
   1. 向Trichoderma菌丝体上加入3 mL 0.05% Tween-20溶液。
   2. 使用接种耙轻轻刮取，使分生孢子从分生孢子梗上释放；注意避免用力按压菌丝体，以防菌丝断裂脱落。
   3. 用移液器迅速吸取液体，防止其被琼脂培养基吸收，并转移至15 mL离心管中。
   4. 使用血细胞计数板统计总孢子数量，并配制浓度为3 × 10⁶ 个孢子/mL的孢子悬液。
      注：此步骤需谨慎操作，避免带入菌丝。孢子悬液制备完成后应在显微镜下检查。对于菌丝体高度气生且蓬松的菌株，可增加一步过滤操作，使用40 µm孔径滤网过滤，以去除残留的菌丝碎片。

结果

为了评估定量方法区分不同类型抗真菌化合物作用模式的能力，我们比较了三种已知抗真菌剂的效果。多菌灵是一种非挥发性合成杀菌剂，已广泛用于防治植物的多种真菌病害^39,40。Thymus vulgaris 精油因其抗菌和抗真菌活性而被广泛报道，并被用作天然食品防腐剂⁴¹。大蒜粉被选为一种植物源生物制品的模型，传统上被用作具有抗菌活性的天然药物，其活性主要归因于挥发性有机硫化合物的存在，但也与非挥发性皂苷和酚类化合物的存在有关²⁶，这使得该模型在本研究中具有相关的复杂性。

该定量方法依赖于从孢子到菌丝体的不同发育阶段，将含有定量真菌的琼脂块进行转移；而在食物中毒法中，则是将5至7天龄的菌丝体从纤维素圆盘上转移。¹³在该实验中，孢子、早期菌丝（培养17小时）和菌丝体（培养24小时）被用作起始真菌材料。采用打孔转移法可能.......

讨论

本文介绍的方法可用于评估经最少加工处理的植物源性产品的抗真菌特性。在本实验方案中，通过使用直径为2 mm的玻璃珠，可实现孢子在琼脂表面的均匀分布。该步骤需要一定的操作技巧，以确保玻璃珠分布得当，从而获得可重复的实验结果，最终实现在真菌生长不同阶段对其抗真菌效应进行比较。我们发现，使用直径5 mm的玻璃珠或在涂布过程中过度旋转会导致菌落生长直径不一致。因此，建议在正式实验前进行充分训练，以熟练掌握孢子分布技术。此外，当需要测试植物粉末时，必须注意将其均匀分散于琼脂培养基中。为防止粉末沉降至培养皿底部，应在熔融培养基温度降至45 °C时（当室温为24 °C时）将样品混入琼脂培养基。该温度需根据当地室温进行相应调整，以避免发生沉淀。

尽管本文所述方法可提供有价值的见解，但也必须考虑一些局限性。该方法能够在单次实验设置中实现准确且并行的比较，但代价是需要大量的准备时间，因为所需制备的琼脂平板数量可能相当多，具体取决于待回答的科学问题。此外，本实验是一种为5 cm培养皿设计的中等规模检测方法，因此要测试所有方面所需的活性物质用量可能较大。这意味着稀有物质可能不适用于本方案。可以考虑使用更小的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
多菌灵	Sigma	378674-100G
蒸馏水
Eppendorf 管	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons 管	Sarstedt	547254	50 mL
直径 5 毫米的不锈钢管	零售商店		/
食品脱水机	Sancusto		六层托盘
大蒜粉	Organic shop
玻璃珠	CLOUP	65020	2 mm
血细胞计数板	Jeulin	713442	/
培养箱	Memmert	UM400	30 °C
刀式研磨机	Bosch	TSM6A013B
手动细胞计数器	Labbox	HCNT-001-001	/
测量尺	零售商店
微生物安全柜	FASTER		FASTER BHA36, II 型, Cat 2
微量移液器	Mettler-Toledo	17014407	100 - 1000 µL
微量移液器	Mettler-Toledo	17014411	20 - 200 µL
微量移液器	Mettler-Toledo	17014412	2 - 20 µL
培养皿	Sarstedt	82-1194500	55 mm
培养皿	Sarstedt	82-1473	90 mm
移液控制器-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
马铃薯葡萄糖琼脂	Sigma	70139-500G
精密天平-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
接种耙	Sarstedt	86-1569001	/
倒置三目显微镜 AE31E	Grosseron	M097917	/
无菌刻度移液管	Sarstedt	1254001	10 mL
百里香精油	药店		100% 精油
1000 µL 吸头	Sarstedt	70.762010
20 µL 吸头	Sarstedt	70.760012
200 µL 吸头	Sarstedt	70.760002
牙签	零售商店
木霉属菌株			LRPIA 实验室菌株
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
镊子	Labbox	FORS-001-002	/