利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

摘要

本方案涵盖了利用液相色谱-质谱联用技术，并结合高级特征提取和生物信息学分析软件，对肽聚糖组成进行的详细分析。

摘要

肽聚糖是细菌细胞壁的重要组分，也是抗菌药物常见的细胞靶点。尽管所有细菌的肽聚糖结构在某些方面相对保守，但在革兰氏阳性菌与阴性菌之间以及不同物种之间仍存在显著差异。此外，已知在细菌物种内部，肽聚糖可因生长阶段和/或环境刺激而发生多种变异、修饰或适应性改变。这些变化形成了一种高度动态的结构，已知其参与多种细胞功能，包括生长/分裂、抗生素耐药以及逃避宿主免疫防御。为了理解肽聚糖内部的变异，必须将其整体结构分解为基本组成单元（称为肽聚糖单体，muropeptides），并评估其在细胞内的总体组成。肽聚糖组学（Peptidoglycomics）结合先进的质谱技术与高通量生物信息学数据分析，以精细解析肽聚糖的组成。以下实验方案描述了从细菌培养物中纯化肽聚糖、通过液相色谱—质谱联用仪获取肽聚糖单体的强度数据，以及利用生物信息学对肽聚糖组成进行差异分析的方法。

引言

肽聚糖（PG）是细菌的典型特征，具有维持细胞形态的作用，同时为蛋白质及其他细胞组分提供结构支撑^1,2聚糖骨架由交替的β-1,4-连接的 NN-乙酰胞壁酸（MurNAc）和 N乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）^1,2每个MurNAc在D-乳酸残基上连接有一个短肽，该短肽可与相邻双糖连接的肽链发生交联图1A，B）。这种交联形成一种网状结构，包裹整个细胞，通常被称为囊状体（sacculus）。图1C）。在肽聚糖合成过程中，前体物质在细胞质中生成，随后由翻转酶转运通过细胞膜。这些前体物质接着由转糖基酶和转肽酶分别催化整合到成熟的肽聚糖中，形成糖苷键和肽键³然而，一旦肽聚糖组装完成，细菌会产生多种酶对其进行修饰和/或降解，以执行包括生长和分裂在内的多种细胞过程。此外，肽聚糖的多种修饰已被证明可赋予细菌特定于菌株、生长条件和环境胁迫的适应性，这些修饰与细胞信号传导、抗菌药物耐药性以及宿主免疫逃逸密切相关。⁴例如，一种常见的修饰是在MurNAc上添加一个C6乙酰基，这种修饰可通过限制宿主产生的溶菌酶对肽聚糖β-1,4糖苷键的接触，从而赋予抗性^4,5,6。在 肠球菌，将肽侧链末端的ᴅ-Ala替换为ᴅ-Lac可增强对万古霉素这一抗菌药物的耐药性^7,8.

自20世纪60年代首次描述以来，肽聚糖（PG）的分离与纯化通用流程基本保持不变⁹。首先通过SDS加热处理溶解细菌膜，随后利用酶法去除结合的蛋白质、糖脂以及残留的DNA。纯化后可获得完整的细胞壁囊状结构，再通过水解N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）与N-乙酰胞壁酸（MurNAc）之间的β-1,4糖苷键，将其降解为单独的组分。该降解过程产生含有完整结构修饰和/或交联结构的GlcNAc-MurNAc二糖单元，称为胞壁肽（muropeptides）（图1B）。

最初通过高效液相色谱分离（HPLC）对肽聚糖（PG）进行组分分析，以纯化各个肽聚糖单体，随后手动鉴定这些肽聚糖单体^10,11。此后，该方法已被液相色谱-串联质谱法（LC-MS）所取代，后者提高了检测灵敏度，并减少了对每个单独肽聚糖单体进行纯化的手工工作量。然而，肽聚糖单体的手动鉴定过程依然耗时且复杂，仍是限制相关研究数量的主要因素。近年来，随着“组学”技术的兴起，自动化的LC-MS特征提取已成为一种强大工具，能够从大规模数据集中快速检测并鉴定复杂样品中的各个化合物。在特征被识别后，生物信息学软件通过差异分析对样本间的差异进行统计比较，识别出复杂数据集中的细微差异，并以图形方式呈现给用户。将特征提取软件应用于肽聚糖组成分析的研究才刚刚起步^12,13,14，并开始与生物信息学分析相结合¹²。与蛋白质组学分析不同，后者可借助现成的蛋白质数据库预测肽段碎裂模式，从而实现完全自动化鉴定；目前尚无适用于肽聚糖组学的碎片化谱图数据库。然而，特征提取可结合已知和预测的结构数据库，用于预测肽聚糖单体的鉴定结果¹²。本文中，我们提供了一套详细的操作流程，介绍如何结合基于LC-MS的特征提取与肽聚糖单体数据库，实现肽聚糖组成的自动化鉴定及生物信息学差异分析（图2）。

方案

1. 肽聚糖样品制备

1. 细菌培养物的生长
   注意：细菌培养物的生长情况将根据所研究的细菌种类及培养条件的不同而有所差异。待检测的实验参数将决定具体的培养条件。
   1. 在适合菌株和实验设计所需的生长条件下培养细菌。每种菌株或生长条件应以三份独立的菌落进行培养，作为生物学重复（即三组独立的培养物）。
      注意：已知生长条件和生长阶段对肽聚糖（PG）组成具有显著影响^1,2,10必须高度重视不同培养体系及重复实验之间的一致性，以确保组分变化源于实验参数，而非实验误差。
   2. 迅速将培养物冷却至 4 °C，离心收集（11,000 x g，10 分钟，4 °C）后，将细胞沉淀于 -20 °C 冻存。在冻存前，用预冷的 4 °C、20 mM pH 6.5 磷酸钠缓冲液洗涤细胞沉淀。为尽量减少收集过程中可能修饰和/或降解肽聚糖的酶活性，应尽可能快速且一致地完成冷冻细胞沉淀的制备。样品可不经过冻存而直接进入提取步骤（第 1.2 节）；但需确保所有样品均以相似的方式进行处理。
      注意：为了确保后续步骤有足够的产物，需使用较大体积的湿菌体沉淀。这样可获得足够大的囊状胞壁沉淀，在重复洗涤步骤（1.2.5 和 1.2.14）中易于观察和保留，且不会造成明显的产物损失。根据细菌种类及培养条件的不同，产量可能会有所差异。对于革兰氏阴性菌 铜绿假单胞菌，PAO1，0.5 OD 的 4 L₆₀₀ 培养物产生了3–4 g的细胞沉淀，足以制备约10 mg纯化的细胞壁囊（见第1.2.17节）¹²这远超过LC-MS（第2节）所需的囊泡量；然而，这将有助于提高测量准确性（第1.2.17节）和归一化处理（第1.3节）。
2. 肽聚糖囊泡的提取
   注意：PG 提取方案改编自参考文献[ref]。^9,11,15本方案将从单个细菌细胞中完整提取肽聚糖（PG），获得不含其他细胞组分的完整囊状结构。该方案适用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。然而，对于革兰氏阳性菌细胞，可能需要进行调整，以分离较厚的肽聚糖结构，并去除细胞壁相关聚合物，如壁磷壁酸。
   1. 将冻存的细胞沉淀物重悬于约原培养体积1/10的20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中。该步骤在4 °C下进行（每毫升缓冲液可处理1–8 mg湿细胞沉淀重量）。^11,12).
      注意：为了维持聚半乳糖醛酸（PG）的乙酰化状态，需要将pH值控制在6.5或更低。^15,16.
   2. 将细胞悬液逐滴加入装有水冷凝器的圆底烧瓶中，滴入沸腾的8%十二烷基硫酸钠（SDS）20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5），终体积比为1:1（即终浓度为4% SDS），并轻轻搅拌。图2，步骤 2）
   3. 保持温和煮沸30分钟至3小时，并持续搅拌，以确保膜结构完全解离。最终混合物应完全澄清，无残留细胞团块或黏稠物。建议采用较长的煮沸时间，以确保解离完全。
   4. 静置至室温。样品可在室温下放置过夜。
      注意：当存在SDS时，需将样品保持在室温，以确保SDS保留在溶液中。
   5. 通过70,000 x g超速离心将囊斑收集为沉淀 g 25 °C下离心40分钟（或直至囊状结构完全沉淀所需的时间）。
   6. 通过连续的超速离心（第1.2.5节）和在约50 mL室温下20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中重悬，反复洗涤囊斑，直至洗涤缓冲液中的SDS浓度降至约0.001%。通常进行5至7次洗涤即可。
      注意：为了检测洗涤缓冲液中残留的十二烷基硫酸钠（SDS）浓度，可使用比色染料Stains-all¹⁷.
   7. 将囊泡重悬于5–10 mL室温的20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中。
   8. 在室温下对样品进行短暂超声处理（约40%，50 W，20 kHz，20 s），以分散团块。
      注意：长时间超声处理会因机械作用导致肽聚糖结构断裂¹⁸.
   9. 加入淀粉酶、DNase 和 RNase 至终浓度各为 50 μg/mL，以及 10 mM 硫酸镁，37 °C 下振荡或旋转孵育 1 小时进行消化。
      注意：淀粉酶消化可去除囊泡内残留的任何糖原¹¹.
   10. 加入终浓度为 100 μg/mL 的蛋白酶，在 37 °C 下振荡或旋转孵育过夜，并添加约 0.02% 叠氮化钠。
       注意：蛋白酶消化可去除已添加的酶（来自第1.2.9节），并去除与肽聚糖共价连接的脂蛋白。
       警告：叠氮化钠具有高毒性，需采用适当的使用和处置方法。
   11. 70,000 × g 超速离心 g 25 °C下离心40分钟（或直至囊状结构完全沉淀）以去除叠氮化钠。
   12. 将沉淀重悬于25 mL的2% SDS 20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中。
   13. 在蒸锅或带水冷凝器的圆底烧瓶中煮沸1小时（第1.2.2节）。
       注意：第二次SDS煮沸步骤可去除囊状物中所有残留的蛋白质和污染物。
   14. 重复囊泡清洗步骤（第1.2.6节），使用约50 mL室温的双蒸水（ddH₂O）。₂O）直至 SDS 浓度约为 0.001%。
   15. 将沉淀重悬于足量的ddH₂O中₂O 悬浮耳石囊，并清洗容器（如 25 mL），于 -80 °C 冻存过夜。体积可有所变化，因为样品将在下一步进行冻干；不过，较小体积的样品冻干所需时间更短。
   16. 第二天，将悬浮液冻干并在室温下保存。
   17. 使用分析天平称量所得冻干囊的数量。
   18. 稀释囊泡于ddH₂O中₂0 至 10 mg/mL，并在进一步分析前短暂超声处理以分散团块。
3. 纯化肽聚糖的定量分析
   1. 定量测定第1.2.18节中纯化的囊状物含量，以确保在差异分析（第3.2节）过程中质谱数据的均一化。遵循参考文献中详述的方法学¹⁵.
      注意：通过酸水解将纯化的囊状物（第1.2.18节）分解为单个的糖和氨基酸组分。利用脉冲安培检测法，通过阴离子交换色谱分离并定量各组分。鉴于肽聚糖（PG）的结构，图1），单个肽聚糖单体由一个MurNAc和一个GlcNAc残基组成。因此，定量任一残基的浓度均可一对一地反映样品中肽聚糖单体的含量。在色谱分析中，MurNAc与其他肽聚糖组分的峰分离效果更佳，故优先选用MurNAc进行定量¹⁶.

2. 质谱数据采集

1. 用于质谱分析的胞壁肽制备
   1. 在100 μL反应体系中，向800 μg纯化囊泡中添加100 μg/mL溶菌酶（mutanolysin）、100 mM乙酸铵（pH 5.5）和50 mM氯化镁。
   2. 37 °C 下消化过夜。
   3. 加入等体积的 0.5 M 硼酸盐缓冲液（pH 9.0），并补充约 10 mg/mL 硼氢化钠（NaBH₄）₄).
      注意：环状糖在α和β异头体形式之间的变旋作用会导致在肽聚糖的液相色谱分离过程中出现多个峰。使用NaBH₄处理可将还原端糖基还原，从而稳定其结构并减少峰的分裂。₄ 通过将MurNAc还原为muramitol，消除两种形式之间的相互转化¹¹该处理不能减少1,6-脱水MurNAc或1,4-连接的糖残基。
      警告：NaBH₄的反应₄ 产生少量氢气。NaBH₄ 反应会产生气泡，因此应保持微量离心管开口，以便气体逸出。
   4. 在室温下孵育样品约20–30分钟。
   5. 短暂离心以使微量离心管中的样品沉降至管底并去除气泡。
   6. 调节 pH 至 <4.0，使用1:5的磷酸溶液，每次添加5 μL。使用石蕊pH试纸检测pH值。
   7. 在约 17,000 x 离心 g 离心1分钟，以沉淀任何残留的不溶物。
   8. 使用 0.2 µm 微孔离心滤器过滤。
   9. 样品在30,000 x g下离心10分钟 g 在注入液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）之前，确保任何颗粒物均不被注入质谱仪中。
2. 液相色谱-质谱联用仪的设置
   1. 连接一个C18表面多孔颗粒柱（100 mm × 2.1 mm，孔径 <3 µm）连接至四极杆-飞行时间（QTOF）质谱仪，保留至少四位小数 m/z 检测准确率
   2. 进行胞壁肽的液相色谱分离
      注意：每个生物学重复（第1.1.1节）应通过液相色谱-质谱联用仪（第2.2.2至2.2.3节）运行三次（技术重复）。因此，每个测试条件将共有九个液相色谱-质谱数据文件。数据采集使用市售软件进行（参见 材料表）。然而，采集软件的选择应基于质谱仪的型号。以下内容提供了针对本实验方案所需参数设置质谱仪的操作指南。详细说明请参阅仪器制造商的操作手册。
      1. 为实现色谱分离，配制以下溶剂：含0.1%甲酸的水相（A）和含0.1%甲酸的乙腈相（B）。
      2. 使用以下参数建立色谱分离方法。
      3. 将流速设置为 0.4 mL/min。
      4. 以2% B条件化柱子10分钟（约24个柱体积）。
      5. 使用自动进样器，从第 2.1.9 节中的样品中注入 10 µL。
         注意：在开始数据采集之前，先运行一个初始样品的LC-MS流程。该次运行不用于实际数据分析，目的是提高后续所有样品运行的保留时间重现性。在质谱数据处理（第3.1节）过程中，需要保留时间具有良好的重现性，以准确识别和归组质荷比（m/z 峰
      6. 使用2% B分离肽聚糖片段5分钟（约12个柱体积），然后在13分钟内将B相升至15%（约30个柱体积），再在10分钟内升至50% B（约24个柱体积），最后在2分钟内升至98% B（约5个柱体积）。
         注意：弃去（排入废液）梯度洗脱的前 2 分钟和后 5 分钟的组分。
      7. 以98% B的条件进行6分钟（约14个柱体积）的柱洗涤，随后进行20分钟（约47个柱体积）的重新平衡。
   3. 进行肽聚糖片段的质谱检测
      1. 使用乙腈中的调谐混合物（含有LC-MS参考质量标准品），按照质谱仪制造商的说明，在正离子模式下校准质量轴。
         注意：质谱仪在色谱运行开始之前已进行调谐（第 2.2.2.1 节）。
      2. 使用以下参数设置质谱数据采集方法。
         注意：质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）数据的采集（2.2.3.2 至 2.2.3.6 节）与胞壁肽的色谱分离（2.2.2.4 和 2.2.2.5 节）同时进行。色谱和质谱参数（2.2.2.2 和 2.2.3.2 节）共同构成一个完整的方法，该方法在建立用于连续运行多个样品的工作列表时一并添加。
      3. 将电喷雾毛细管电压设为4.0 kV，干燥气体温度设为350°C，气体流速为13 L/min。
         注意：氮气（纯度 >99%）应在所有质谱数据采集过程中用作雾化气、干燥气和碰撞气。
      4. 将雾化器压力设为40 psi，碎裂电压设为150 V。
      5. 将喷嘴、分流器和八极杆射频电压分别设置为 1000 V、65 V 和 750 V。
      6. 将扫描范围设置为 300–2,000 m/z 在4 GHz（扩展动态范围）正离子模式下。
      7. 使用数据依赖的串联质谱（MS/MS）采集模式进行数据收集，质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）扫描速率为每秒1个谱图。每个循环选择五个前体离子质量，按单电荷、双电荷和三电荷顺序依次选取。
      8. 将MS/MS碎裂碰撞能量设置为15、20和30 eV。

3. 胞壁肽丰度的差异分析

1. LC-MS 色谱图谱数据处理
   注意：递归特征提取使用商业软件完成（见材料表）。也可使用其他特征提取软件，但可能需要额外的手动数据处理以实现高度稳健的递归提取。不同软件通常将“特征（feature）”、“实体（entity）”和“化合物（compound）”这几个术语几乎可互换使用。对于肽聚糖（PG）分析，这些术语均指识别代表单个肽聚糖单体（muropeptide）的 LC-MS 离子色谱图（例如，图3）。在谱图处理过程中（第 3.1 节），一个“特征”代表多个 m/z 峰，这些峰涵盖单个 muropeptide 可能产生的多种离子种类，并被归入同一个化合物标签下。
   1. 在文件菜单下，新建一个项目。
   2. 添加 LC-MS QTOF 数据文件，并将各个数据文件分配至实验条件/组别，例如两种不同的生长条件。
   3. 运行数据处理向导“批量递归特征提取”（小分子/肽类），并设置数据处理滤波器，使其与 LC-MS 条件和仪器参数相匹配，以准确识别、分组和验证代表单个 muropeptide 的 m/z 峰。根据色谱图中已知相似峰的保留时间漂移和 m/z 变化情况，设定初始滤波参数。
      注意：递归特征提取首先使用非靶向分子特征提取算法，在所有数据文件中识别并对齐色谱图特征（m/z 峰）。创建这些特征后，再利用靶向分子特征提取算法对原始数据文件进行递归式重新评估，以提高所识别特征的可靠性和准确性。建议在初始非靶向提取阶段设置较窄的检测窗口，并在递归提取阶段使用更宽泛的检测参数，以识别在初始提取中可能遗漏的所有数据文件中的峰。递归特征提取的运行时间可能长达数小时，具体取决于样本数量、数据复杂程度以及计算机硬件性能。
   4. 审查特征提取结果。若大量特征在某一组中未能成功对齐，应调整递归滤波参数，按需拓宽或收紧检测窗口。为此，需检查每个提取特征的色谱图和同位素分布，确保在所有数据文件中特征检测方式一致。此外，针对每个数据文件中识别出的特征，应检查其评分、任何警告信息以及是否通过所选滤波参数。
      注意：必须谨慎设置检测窗口，避免过宽导致不同特征被错误合并。这通常表现为不同数据文件间同位素分布差异明显，或 m/z / 保留时间变化显著。相反，若存在多个 m/z 和保留时间相近的特征，则可能是滤波参数过于严格，导致一个 MS 峰被拆分为两个特征。因此，应调整保留时间滤波参数后重新运行特征提取（第 3.1.3 节），以实现更好的特征归并。通过可视化最低丰度峰可判断所用滤波器（第 3.1.3 节）是否能准确识别高于背景噪声的峰。若最低丰度峰与背景相似，则应使用新的背景滤波参数重新运行特征提取。
   5. 将数据导出为化合物交换文件（.cef）（该格式兼容统计分析软件），或导出为列分隔文件（.csv），其中包含每个样本中各特征的质量、保留时间和丰度信息。
2. 谱图特征的差异分析
   注意：差异分析使用商业软件完成（见材料表）。也可使用其他生物信息学软件。
   1. 打开程序，并按提示新建一个项目。
   2. 按照指示进行数据导入与数据分析。在数据导入阶段，上传已提取特征的文件（第 3.1 节）。在数据分析阶段，选择显著性水平和倍数变化作为差异分析标准，并将数据标准化为所有数据文件中强度的中位数。不要设置任何数据滤波器（如果此前在谱图处理步骤（第 3.1 节）中已设置 ），因为重复滤波会 削弱稳健的递归特征提取效果。然而，与特征提取类似，由于 LC-MS 数据采集过程中存在漂移，差异分析也必须基于质量（m/z）和保留时间进行对齐。请使用特征提取阶段（第 3.1 节）确定的参数。
      注意：使用肽聚糖定量结果（第 1.3 节）对数据文件之间进行归一化处理，以确保观察到的差异源于实验参数而非囊泡（sacculi）纯化过程中的变异（第 1.2 节）。使用外部标度选项（external scaler option）根据各样本中 MurNAc 浓度的差异调整每个数据文件。
   3. 分析完成后，查看生成的图形和统计结果，识别在不同实验条件下丰度发生显著变化的 muropeptide。
   4. 在项目导航器中，右键点击各项分析，选择导出选项，将特征详细信息保存为列分隔（.csv）数据文件，其中包含每个特征的 m/z、保留时间、原始和归一化强度值、p 值、FDR 及倍数变化。需保存多个分析结果以获取全部相关数据。
   5. 导出第二个仅包含通过统计分析的 muropeptide 的 .csv 文件，即 p 值 <0.05 且倍数变化 >2 的特征。
3. 将 muropeptide 身份注释至谱图特征
   注意：每个已识别的特征必须基于其 m/z 值分配一个预测的 muropeptide 结构，并通过检查 MS/MS 碎裂图谱来确认该注释。在完成注释确认后，可能需要重新执行并优化差异分析（第 3.2 节）。
   1. 在差异分析软件中，进入结果解读界面，选择“ID 浏览器”。添加预期 muropeptide 结构的数据库，并选择与之前相同（第 3.1.3 节）的参数。这将为每个已识别特征生成预测的 muropeptide 注释。可使用预测 muropeptide 结构的 m/z 值结合 MS 数据库软件（见材料表）构建 muropeptide 结构库。此外，参考文献¹²中提供了包含超过>6,000 种可能 muropeptide 的 m/z 值数据库。
   2. 根据匹配得分和预测 muropeptide 的生物学相关性选择最合适的注释，即选择最有可能存在于生物样本中的 muropeptide。
   3. 通过将 MS/MS 色谱图中的 m/z 峰与已知 muropeptide 结构所有可能碎裂产物的预测 m/z 进行比较，手动确认预测的 muropeptide 注释（例如，图4）。
      1. 使用色谱图查看程序查看 MS 和 MS/MS 数据（见材料表，图4）。
      2. 使用分子编辑器（化学结构绘图程序）绘制预测的 muropeptide 结构（见材料表，图4，灰色插图）。使用质量碎裂工具显示当每个化学键单独或组合断裂时产生的 MS 碎片的 m/z 值。
         注意：根据 MS/MS 所用碎裂能量的不同，muropeptide 结构中的任意化学键均可能发生断裂。然而，某些键在较低能量下更容易或更频繁地断裂。例如，肽侧链中最常见的断裂发生在氨基酸之间的酰胺键处。在评估碎裂模式时需注意，GlcNAc 残基极易从 muropeptide 上脱落。因此，在评估已知 muropeptide 结构的碎裂时，应分别考虑包含和不包含 GlcNAc 的情况。由于 GlcNAc 在源内即可能发生碎裂，谱图处理（第 3.1 节）中提取的多个特征可能实际上代表同一个 muropeptide 结构。若发现此类情况，应将这些特征合并，并重新评估差异分析。
      3. 将所确定的 muropeptide 结构（第 3.3.3.2 节）所有可能的碎裂产物与 MS/MS 色谱图（第 3.3.3.1 节）进行比较。为确认 muropeptide 注释，应在 MS/MS 色谱图中找到多个碎片的 m/z 峰，且 m/z 对齐窗口应尽可能小（图4）。
      4. 当 MS/MS 碎裂图谱难以明确判断 muropeptide 身份时，应使用样本（第 2.1.9 节）重复第 2.2.2 至 2.2.3 节操作，获取额外的 MS/MS 数据，包括优先前体离子列表（指定 m/z 和保留时间）以及不同 MS/MS 碎裂碰撞能量条件下的数据。
   4. 对于被注释为相同 muropeptide 的共洗脱实体，应重新运行差异分析（第 3.2.2 节），并将提取的特征合并。
4. 评估 muropeptide 修饰的全局变化
   1. 编辑具有统计显著性和高倍数变化的 muropeptide 的 .csv 文件（第 3.2.4 节），为每种 muropeptide 修饰添加单独的一列。根据已注释的 muropeptide（第 3.3 节）在该列中填写修饰类型（例如，乙酰化 vs. 去-N-乙酰化 GlcNAc 或 MurNAc）。
   2. 将修改后的 .csv 文件上传至 Perseus^22,23。将归一化强度值导入主导入框（Main import box），将修饰类型导入分类导入框（Categorical import box）。
   3. 在注释行下，点击分类注释行，并将数据文件添加至各实验参数。
   4. 在“检验”选项下，点击“双样本检验”以执行学生 t-检验（p 值 < 0.05，FDR < 0.05，s0 = 1）。
   5. 点击“1D”以执行 1D 注释^22,23。1D 注释 FDR < 0.05 表示在测试的实验参数之间，该 muropeptide 修饰的丰度变化具有统计学意义。将阈值（s0）设为 1 可显示所有 muropeptide 的 1D 注释 FDR 分数。
   6. 在图形绘制软件中（见材料表），生成每种 muropeptide 修饰的丰度倍数变化热图，并展示 1D 注释分数以体现其显著性（图5B）。每种 muropeptide 修饰的倍数变化可通过 Microsoft Excel 计算得出，方法为使用所有包含该修饰的单个 muropeptide 的原始强度值进行计算。

结果

质谱仪检测灵敏度的提升，结合高性能的峰识别软件，显著增强了对复杂样品中物质组成进行极其精细的分离、监测和分析能力。利用这些技术进步，近期关于肽聚糖组成的研究所采用的自动化液相色谱-质谱（LC-MS）特征提取技术^12,13,14,24，已逐步取代早期基于高效液相色谱（HPLC）的方法^{11,25,26,27,28,29,30}

讨论

本方案描述了一种从细菌培养物中纯化肽聚糖、进行液相色谱-质谱（LC-MS）检测前处理，并利用生物信息学技术分析其组成的实验方法。本文重点针对革兰氏阴性菌，若需分析革兰氏阳性菌，需进行一些轻微的修改。

自20世纪60年代首次制备以来，肽聚糖片段的制备方法几乎未发生变化^9,11,15。一旦获得纯化的囊状物（第1.2.18节），便使用来自Streptomyces globisporus的溶菌酶——溶壁酶（mutanolysin），将囊状物消化为单个的肽聚糖片段。溶壁酶通过断裂β-1,4-糖苷键，释放出由N-乙酰葡萄糖胺- N-乙酰胞壁酸二糖以及连接的肽侧链组成的单个肽聚糖片段，其中包含任何修饰或交联结构（图1）。

以往研究肽聚糖（PG）组成的方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
C18反相色谱柱 - AdvanceBio Peptide色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 µm）	Agilent		LC-MS数据采集
加热套控制器，Optichem	Fisher	50-401-788	用于4% SDS煮沸
加热套，1000 mL半球形	Fisher	CG1000008	用于4% SDS煮沸
37°C培养箱			用于囊泡纯化和质谱样品制备
李比希冷凝管，300 mm，24/40	Fisher	CG121805	用于4% SDS煮沸
冷冻干燥机	Labconco		用于囊泡的冷冻干燥
磁力搅拌器	Fisher	90-691-18	用于4% SDS煮沸
质谱仪 Q-Tof 型号 UHD 6530	Agilent		LC-MS数据采集
微量离心过滤器，Nanosep MF 0.2 µm	Fisher	50-197-9573	质谱进样前样品净化
铁架台	Fisher	12-000-102	用于4% SDS煮沸
铁夹	Fisher	S02629	用于4% SDS煮沸
圆底烧瓶 - 1升Pyrex	Fisher	07-250-084	用于4% SDS煮沸
超声破碎仪型号120	Fisher	FB120	用于囊泡纯化
超声破碎仪 - 微量探头	Fisher	FB4422	用于囊泡纯化
超速离心机	Beckman		囊泡洗涤步骤
超速离心瓶，Ti45	Fisher	NC9691797	囊泡洗涤步骤
供水系统	城市供水		用于水冷式冷凝器
软件
ChemDraw	Cambridgesoft		用于肽聚糖片段断裂预测的分子编辑器
Excel	Microsoft		查看注释后的肽聚糖列表、丰度、同位素模式等
MassHunter Acquisition	Agilent		运行QTOF仪器
MassHunter Mass Profiler Professional	Agilent		生物信息学差异分析
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager	Agilent		肽聚糖m/z质谱数据库
MassHunter Profinder	Agilent		递归特征提取
MassHunter Qualitative Analysis	Agilent		查看MS和MS/MS色谱图
Prism	GraphPad		绘图软件
Perseus	马克斯·普朗克生物化学研究所		一维注释
材料
乙腈	Fisher	A998-4
乙酸铵	Fisher	A637
淀粉酶	Sigma-Aldrich	A6380
硼酸	Fisher	BP168-1
DNase	Fisher	EN0521
甲酸	Sigma-Aldrich	27001-500ML-R
LC-MS调谐混合液 - HP0321	Agilent	G1969-85000
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
来自链球菌Streptomyces globisporus ATCC 21553的溶菌酶	Sigma-Aldrich	M9901
氮气（>99%纯度）	Praxair	NI 5.0UH-T
磷酸	Fisher	A242
来自灰色链霉菌Streptomyces griseus的蛋白酶E	Sigma-Aldrich	P5147
RNase	Fisher	EN0531
叠氮化钠	Fisher	S0489
硼氢化钠	Sigma-Aldrich	452890
十二烷基硫酸钠（SDS）	Fisher	BP166
氢氧化钠	Fisher	S318
磷酸氢二钠	Fisher	S373
磷酸二氢钠	Fisher	S369
Stains-all	Sigma-Aldrich	E9379