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两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

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DOI：

10.3791/61803

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2021年2月21日

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1Department of Biomedicine, University Hospital Basel and University of Basel, 2Division for Hematology, University Hospital Basel and University of Basel, 3Department of Internal Medicine, Hematology and Oncology, University Hospital Tübingen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。

摘要

在同一患者体内，NKG2D配体（NKG2DL）表面表达的缺失可用来区分具有干细胞特性的白血病亚群（即所谓的白血病干细胞，LSCs）与分化程度较高的白血病细胞亚群；后者虽携带相似的白血病特异性基因突变，但缺乏引发疾病的能力。NKG2DL是一类生物化学上高度多样化的MHC I类分子样自身分子。在稳态条件下，健康细胞通常不在细胞表面表达NKG2DL。相反，当细胞受到应激刺激（如癌基因转化或感染性刺激）时，会诱导这些配体的表达，从而通过表达NKG2D受体的免疫细胞（如自然杀伤细胞，NK细胞）介导的裂解作用，清除受损细胞。有趣的是，在LSC亚群中，NKG2DL的表面表达被选择性抑制，使这些细胞能够逃避免疫系统通过NKG2D途径的监视。本文展示了两种不同流式细胞术方法的并列分析，可用于检测肿瘤细胞表面NKG2DL的表达情况：一种是基于广谱配体识别的方法，另一种是使用多种针对单一配体的抗体进行染色的方法。这些方法可用于从NKG2DL阳性的非LSC群体中分离出存活的、NKG2DL阴性且可能具有癌症干细胞特性的细胞亚群。

引言

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统的重要效应细胞，能够在无需预先抗原刺激的情况下识别并清除恶性细胞或处于应激状态的健康细胞（例如因病毒感染所致）1。该过程通过一系列复杂的活化受体——如自然细胞毒性受体（NCRs）、NKG2D和CD16——以及主要由杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）构成的抑制性受体进行严格调控2。KIRs与体细胞表面的人类白细胞抗原（HLA）I类分子结合，可实现自我识别并维持NK细胞的耐受性；相反，当自我识别缺失，且活化受体与其靶细胞配体的结合增强时，将触发细胞毒性颗粒的释放，从而介导NK细胞的细胞毒作用1。此外，NK细胞还可通过活化受体CD16与表达免疫球蛋白Fc段（FcR）的靶标结合，发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）2。除直接细胞毒性外，NK细胞还能通过释放细胞因子，连接先天免疫与适应性免疫系统3。

NKG2D 是一种主要的活化性受体，表达于自然杀伤细胞（NK）、NKT 细胞、γδ T 细胞以及初始型 CD8+ T 细胞4，使这些细胞毒性免疫细胞能够识别并裂解表达 NKG2D 配体（NKG2DL）的靶细胞。健康细胞通常不表达 NKG2DL，而恶性转化或病毒感染的细胞则会上调 NKG2DL 的表达，从而使其易于被免疫系统清除5。

人类NKG2D配体（NKG2DL）家族包含八种已知分子，其中包括两种主要组织相容性复合体I类链相关分子A和B（MICA和MICB6），以及巨细胞病毒UL16结合蛋白1–6（ULBP1-67）。NKG2DL的表达在转录、转录后以及翻译后水平均受到调控8。因此，尽管健康细胞表面通常无法检测到NKG2DL的表达，但在健康组织中已报道存在NKG2DL的mRNA9以及细胞内蛋白的表达。这种表达的功能意义及其表达模式差异背后的机制仍有待阐明10。

在癌细胞中，NKG2D配体（NKG2DL）表达的机制性调控是一个引人入胜的研究领域。已知参与细胞应激（例如热休克应激通路9）或DNA损伤相关通路（如共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）和Rad3相关蛋白（ATR）通路11）的信号通路，以及病毒感染或细菌感染，均被直接证实与NKG2DL表达的诱导有关12。然而，即使NKG2DL的表面表达被有效诱导，其表达仍可能通过蛋白水解介导的脱落而再次丧失，这种机制与某些癌症中的免疫逃逸及不良临床预后相关13。

细胞表面NKG2D配体（NKG2DL）的缺失在急性髓系白血病（AML）患者中也可能发挥重要作用。在此类患者中，强化化疗通常可诱导缓解，但复发常源于白血病干细胞（LSC），这些细胞能够选择性地在化疗中存活并逃避免疫应答。正如我们近期研究所示，例如，LSC可通过抑制NKG2DL在细胞表面的表达，从而逃逸自然杀伤（NK）细胞的杀伤作用14。

相反，表面NKG2D配体（NKG2DL）表达的缺失可作为一种方法，用于鉴定并活体分离出白血病细胞群体中具有干细胞样特性的亚群。本文介绍了两种流式细胞术方法，可用于检测NKG2DL的表面表达，从而鉴定白血病中（可能也包括其他癌症中）NKG2DL阴性的干细胞：一种是针对所有配体的广谱性表面识别方法，另一种是使用针对已知单个NKG2DL蛋白的单一或混合抗体进行染色的方法。

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方案

患者样本的采集已获得巴塞尔大学医院和图宾根大学医院伦理审查委员会的批准。

1. NKG2D 融合蛋白的生物素标记

注意：此步骤使用生物素标记试剂盒（参见材料表）并按照制造商说明书进行操作。本方案的此步骤必须在染色前至少24小时完成。生物素化的NKG2D融合蛋白应保存在-20 °C。

  1. 将生物素和NKG2D融合蛋白管在室温（RT）下解冻。
    注意：如果细胞后续实验使用需要保持无菌（如注射到小鼠体内、集落形成单位实验等），则应在超净工作台内重组融合蛋白以避免污染。否则，所有步骤均可在实验台上进行。
  2. 短暂离心50µg冻干的NKG2D融合蛋白。加入500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）溶解粉末，并使用P1000移液器充分混匀。
  3. 取100 µL NKG2DL融合蛋白加入生物素管中，得到终浓度为100 µg/mL的储备液。
  4. 使用P100移液器反复吹打，充分混匀溶液。
  5. 将融合蛋白/生物素溶液在可控的室温条件下孵育24小时。此时融合蛋白已可使用。

2. 原代急性髓系白血病细胞的解冻

注意：每位患者约有 5,000,000 个冻存的白血病细胞，从液氮中取出后立即解冻并用于实验。白血病细胞的获取与冻存方法如前所述15。简言之，采集急性髓系白血病（AML）患者外周血样本，且原始细胞比例较高（单个核细胞中原始细胞比例>90%），通过密度梯度离心法分离单个核细胞，随后在含 10% 二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FCS）中冻存。不同患者间细胞数量差异较大，取决于患者的白细胞浓度（范围：每毫升血液含 1,000,000 至 30,000,000 个白血病细胞）。

  1. 使用水浴将含有10% FCS的RPMI培养基预热至37 °C。每管AML细胞（每管最多30,000,000个细胞，保存于1 mL FCS + 10% DMSO中），向一个15 mL离心管中加入10 mL预热的培养基。
  2. 从液氮罐中取出含有原代AML细胞的冻存管，立即放入37 °C水浴中快速解冻。轻轻来回晃动冻存管，使管内物质逐渐融化，直至仅剩微小冰晶。
  3. 立即将解冻后的细胞转移至含有预热培养基的离心管中，并用1 mL培养基冲洗冻存管内壁。
  4. 以300 x g离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  5. 用5 mL含有10% FCS的RPMI培养基重悬细胞，以300 x g离心10分钟。

3. 细胞计数

  1. 用已知体积的含10% FCS的RPMI培养基重悬细胞沉淀。
  2. 将少量细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，用台盼蓝或任何其他可区分活细胞与死细胞的替代染料，按已知比例稀释。
  3. 使用任意设备对细胞进行计数。
  4. 以 300 × g 离心细胞 × g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。

4. 使用生物素标记的 NKG2D 融合蛋白对原代 AML 细胞进行染色

  1. 通过向500 mL PBS中添加牛血清白蛋白（BSA）和乙二胺四乙酸（EDTA），使其终浓度分别为0.07 mM和2 mM，配制染色缓冲液。必要时调节pH至7.2–7.4。
  2. 用染色缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞终浓度为 0.5 × 10⁷ 个细胞/毫升。7 细胞/毫升
    注意：可选步骤，染色前可先用封闭剂（例如人 IgG（1µg/ml），在室温下孵育30分钟，或使用FcR阻断剂。
  3. 转移100 µ将100微升细胞悬液转移至细胞培养96孔圆底板中，以300 × g离心10分钟。 ×g 离心10分钟。弃去上清液，勿扰动沉淀。
  4. 配制生物素标记的NKG2D融合蛋白预混液，使细胞重悬于终体积为50微升的溶液中 µ每孔1升，终浓度为10 µ微克/毫升 每孔
  5. 使用100微升移液器加入在步骤4.4中配制的主混合液 µL 移液管，用300微升多通道移液管重悬细胞沉淀 µL型多通道移液器
    注意：根据细胞数量按比例减少最终体积，以降低染色所需的融合蛋白用量。
  6. 在室温下孵育细胞悬液25分钟，或在4℃下孵育50分钟 °C.
  7. 加入200微升洗涤缓冲液洗涤细胞 µ每孔300微升染色缓冲液 µL 多通道移液器
  8. 以300 × g离心该培养板 × g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。
  9. 重复步骤 4.7 和 4.8。
    注意：此处所述染色在细胞培养用96孔U型底板中进行，因此由于此类板孔体积容量较小，洗涤步骤需重复两次。染色也可在其他试管中进行，此时可使用较大体积，洗涤步骤仅需一次。
  10. 使用链霉亲和素-PE（Streptavidin-PE）配制主混合液（见 表1 用于稀释），使细胞重悬于终体积为 50 微升的溶液中 µL.
    注意：根据您感兴趣的细胞类型添加相应的分选抗体，例如 CD33、CD34…急性髓系白血病（AML）的检测方法。
  11. 使用100微升移液器加入在步骤4.10中配制的主混合液 µL 移液管，并用 300 µL型多通道移液器
  12. 将细胞悬液在室温下孵育15分钟，或在4℃下孵育30分钟 °避光。
  13. 加入 200 微升洗涤缓冲液洗涤细胞 µ每孔加入300微升染色缓冲液 µL型多通道移液器
  14. 以300 × g离心该培养板 ×g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。
  15. 重复步骤 4.13 和 4.14。
  16. 配制含有7-AAD（7-氨基放线菌素D，1:1000）的染色缓冲液溶液，或使用其他可用于区分活细胞与死细胞的试剂。
  17. 将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液中 µL 染色缓冲液 + 7-AAD（按步骤 4.16 配制），使用 300 µL型多通道移液器
  18. 使用流式细胞仪分析细胞。

5. 单一或混合的单一抗-NKG2DL 抗体染色

  1. 使用与步骤 4.2 相同的细胞悬液。
  2. 使用 300 µL 多通道移液器将 100 µL 细胞悬液转移至细胞培养 96 孔 U 型底板中，并在 300 x g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  3. 为每种一抗或混合抗体（稀释比例见 表 2）配制抗体主混合液，使细胞最终重悬于 50 µL 体积中。
  4. 使用 100 µL 移液器加入步骤 5.3 中配制的主混合液，并用 300 µL 多通道移液器重悬细胞沉淀。
  5. 在室温下孵育 25 分钟。
  6. 使用 300 µL 多通道移液器向每孔加入 200 µL 染色缓冲液，洗涤细胞。
  7. 将细胞培养 96 孔 U 型底板在 300 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  8. 重复步骤 5.6 和 5.7。
  9. 通过加入二抗（稀释比例见 表 2）配制抗体主混合液，使每孔细胞最终重悬于 50 µL 体积中。
  10. 使用 100 µL 移液器加入步骤 5.9 中配制的主混合液，并用 300 µL 多通道移液器重悬细胞沉淀。
  11. 在避光条件下于室温孵育 15 分钟，或于 4 °C 孵育 30 分钟。
  12. 使用 300 µL 多通道移液器向每孔加入 200 µL 染色缓冲液进行洗涤。
  13. 将细胞悬液在 300 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
  14. 重复步骤 5.12 和 5.13。
  15. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 含有步骤 4.16 中配制的 7-AAD 的染色缓冲液中。
  16. 按照步骤 6 所述，使用流式细胞仪分析细胞。

6. 数据采集

注意：务必每周对流式细胞仪进行质量控制，以确保激光器正常工作。对于本实验方案，每周使用相对荧光微球执行一次细胞仪追踪与校准（CTS）流程，以检测所有通道的激光性能。CTS 完成后，使用 8 峰微球记录 10,000 个事件作为内部对照。所有峰应在各自门控范围内位置一致，且彼此之间清晰分离。

  1. 使用微珠或细胞创建补偿矩阵，以减去检测器之间的光谱重叠16。
  2. 记录未染色细胞和单染微珠的10,000个事件。对于荧光减一（FMO）对照，记录50,000个事件；对于完全染色样本，记录最多100,000个事件。
    注意：也可以在细胞上进行单染色样本操作。如果采用此方法，需确保细胞对目标标记物呈阳性信号。
  3. 针对实验中使用的每种荧光染料，获取相应的单染细胞或微珠样本，以确定光谱重叠程度。使用流式细胞仪的补偿生成工具计算溢出值，并将补偿矩阵应用于所有检测样本。
    注意：若使用微珠计算补偿，则不能使用二抗进行微珠补偿。根据补偿微珠的类型，二抗可能不适用于微珠补偿。
  4. 对于融合蛋白的FMO对照和完全染色样本，首先根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）选择细胞。排除双联体后，根据7-AAD（PercP-Cy5.5）信号的阴性对细胞设门，以排除死细胞（见步骤5.15）。最终图显示活单细胞中CD34（Y轴）与NKG2DL（X轴）的表达情况。
  5. 对于单个抗NKG2DL抗体，对样本采用相同策略，但需注意配体阳性信号位于Alexa Fluor 488通道，而非PE通道。
  6. 根据FMO对照调整设门策略（见步骤6.4和6.5），参考表3中本实验应执行的适当FMO对照：在分析软件中，在阴性组分上绘制设门。在记录完全染色样本时，位于此前所设门上方的细胞即为该分析标记物的阳性细胞。

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结果

本文介绍的两种方案均允许通过流式细胞术分析，利用已知的LSC标志物CD34对急性髓系白血病干细胞（AML LSC）进行富集17，结合使用泛配体识别或采用针对各个配体的混合抗体进行染色，以检测NKG2DL表面表达。在 图1我们结果显示，所分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性，但也存在阴性亚群，总共显示出四种不同的细胞群体。我们的数据展示了此类染色的典型设门策略，首先根据细胞的FSC和SSC特征选主要细胞群体。在后续分析中排除了双联体细胞和死细胞（图1A)。使用FMO对照调节设门，以确保正确鉴定阳性细胞（图1B).

在图1C中，我们展示了CD34阳性（APC，纵轴）与NKG2DL阳性（PE，横轴）细胞的荧光强度。CD34阳性的急性髓系白血病（AML）细胞表现出较低的NKG2DL表面表达水平（<...

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讨论

本文介绍了两种流式细胞术方法，可用于检测人原代急性髓系白血病（AML）细胞表面NKG2D配体（NKG2DL）的表达。我们证明，这两种检测方法均可与其他抗体染色（例如，检测CD34表达）联合使用。类似染色也可应用于其他原代细胞类型和细胞系。

我们最近发现，急性髓系白血病（AML）患者原始细胞表面缺乏NKG2D配体可富集白血病干细胞（LSC）14在急性髓系白血病（AML）中，NKG2DL阴性但非NKG2DL阳性的白血病亚群具有克隆形成能力 体内 白血病起始能力。未来的研究将揭示NKG2D配体表面表达的缺失是否也可作为富集其他癌症类型中干细胞的工具。

CD34 传统上被用于标记急性髓系白血病（AML）中的白血病干细胞（LSC），但 AML 是一种高度异质性的疾病，并非所有 AML 患者都表达 CD34（即 CD34 阴性 AML18）。我们先前已证明，缺乏 NKG2D 配体（NKG2DL）的表面表达可作为识别此类 CD3...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由瑞士国家科学基金会（179239）和苏黎世抗癌基金会资助， 威尔海姆·桑德基金会（Wilhelm Sander Foundation）资助项目 CL（2019.042.1），诺华医学-生物学研究基金会（Novartis Foundation for medical-biological research）资助 C.L。此外，本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议 No. 765104 下的资助。我们感谢巴塞尔流式细胞术平台提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7-氨基放线菌素D（7-AAD）InvitrogenA1310活率染料
96孔U型底板Sarstedt833925500用于流式细胞仪的96孔板
APC小鼠抗人CD34BD555824检测CD34的抗体
RRID: AB_398614
牛血清白蛋白PanReac AppliChemA1391,0050染色缓冲液组分
乙二胺四乙酸Roth8043.1染色缓冲液组分
胎牛血清（FCS）BioConcept2-01F10-I补充RPMI培养基的组分
FlowJo 10.2BD/用于流式细胞术实验数据分析的软件
山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488Thermo ScientificA21222检测MICA和MICB一抗的二抗
RRID: AB_1037853
人NKG2D Fc嵌合蛋白，CFR&D1299-NK-050可检测所有NKG2DL的融合蛋白
RRID:
人ULBP-1抗体R&DAF1380检测ULBP1的抗体
RRID: AB_354765
人ULBP-2/5/6抗体R&DAF1298检测ULBP2/5/6的抗体
RRID: AB_354725
人ULBP-3抗体R&DAF1517检测ULBP3的抗体
RRID: AB_354835
MICA多克隆抗体Thermo ScientificPA5-35346检测MICA的抗体
RRID: AB_2552656
MICB多克隆抗体Thermo ScientificPA5-66698检测MICB的抗体
RRID: AB_2663413
一步式抗体生物素化试剂盒（1条，用于8次反应）Miltenyi Biotec130-093-385用于NKG2DL融合蛋白的生物素化试剂盒
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichD8537-500ML染色缓冲液组分
兔抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 488Thermo ScientificA11034检测ULBP一抗的二抗
RRID: AB_2576217
彩虹校准微粒（8峰），3.0 μmSpherotech Inc.RCP-30-20A用于流式细胞仪维护的微珠
RPMI培养基Sigma AldrichR8758-500ML细胞培养基
RayBright通用补偿微珠Raybiotech137-00013-100用于建立补偿矩阵的微珠
链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）- 1 mg/mLInvitrogenS866检测生物素化NKG2DL融合蛋白的第二步试剂

参考文献

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NKG2D NKG2D CD34

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