两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

摘要

我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。

摘要

在同一患者体内，NKG2D配体（NKG2DL）表面表达的缺失可用来区分具有干细胞特性的白血病亚群（即所谓的白血病干细胞，LSCs）与分化程度较高的白血病细胞亚群；后者虽携带相似的白血病特异性基因突变，但缺乏引发疾病的能力。NKG2DL是一类生物化学上高度多样化的MHC I类分子样自身分子。在稳态条件下，健康细胞通常不在细胞表面表达NKG2DL。相反，当细胞受到应激刺激（如癌基因转化或感染性刺激）时，会诱导这些配体的表达，从而通过表达NKG2D受体的免疫细胞（如自然杀伤细胞，NK细胞）介导的裂解作用，清除受损细胞。有趣的是，在LSC亚群中，NKG2DL的表面表达被选择性抑制，使这些细胞能够逃避免疫系统通过NKG2D途径的监视。本文展示了两种不同流式细胞术方法的并列分析，可用于检测肿瘤细胞表面NKG2DL的表达情况：一种是基于广谱配体识别的方法，另一种是使用多种针对单一配体的抗体进行染色的方法。这些方法可用于从NKG2DL阳性的非LSC群体中分离出存活的、NKG2DL阴性且可能具有癌症干细胞特性的细胞亚群。

引言

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统的重要效应细胞，能够在无需预先抗原刺激的情况下识别并清除恶性细胞或处于应激状态的健康细胞（例如因病毒感染所致）¹。该过程通过一系列复杂的活化受体——如自然细胞毒性受体（NCRs）、NKG2D和CD16——以及主要由杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）构成的抑制性受体进行严格调控²。KIRs与体细胞表面的人类白细胞抗原（HLA）I类分子结合，可实现自我识别并维持NK细胞的耐受性；相反，当自我识别缺失，且活化受体与其靶细胞配体的结合增强时，将触发细胞毒性颗粒的释放，从而介导NK细胞的细胞毒作用¹。此外，NK细胞还可通过活化受体CD16与表达免疫球蛋白Fc段（FcR）的靶标结合，发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）²。除直接细胞毒性外，NK细胞还能通过释放细胞因子，连接先天免疫与适应性免疫系统³。

NKG2D 是一种主要的活化性受体，表达于自然杀伤细胞（NK）、NKT 细胞、γδ T 细胞以及初始型 CD8+ T 细胞⁴，使这些细胞毒性免疫细胞能够识别并裂解表达 NKG2D 配体（NKG2DL）的靶细胞。健康细胞通常不表达 NKG2DL，而恶性转化或病毒....

方案

患者样本的采集已获得巴塞尔大学医院和图宾根大学医院伦理审查委员会的批准。

1. NKG2D 融合蛋白的生物素标记

注意：此步骤使用生物素标记试剂盒（参见材料表）并按照制造商说明书进行操作。本方案的此步骤必须在染色前至少24小时完成。生物素化的NKG2D融合蛋白应保存在-20 °C。

1. 将生物素和NKG2D融合蛋白管在室温（RT）下解冻。
   注意：如果细胞后续实验使用需要保持无菌（如注射到小鼠体内、集落形成单位实验等），则应在超净工作台内重组融合蛋白以避免污染。否则，所有步骤均可在实验台上进行。
2. 短暂离心50µg冻干的NKG2D融合蛋白。加入500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）溶解粉末，并使用P1000移液器充分混匀。
3. 取100 µL NKG2DL融合蛋白加入生物素管中，得到终浓度为100 µg/mL的储备液。
4. 使用P100移液器反复吹打，充分混匀溶液。
5. 将融合蛋白/生物素溶液在可控的室温条件下孵育24小时。此时融合蛋白已可使用。

2. 原代急性髓系白血病细胞的解冻

注意：每位患者约有 5,000,000 个冻存的白血病细胞，从液氮中取出后立即解冻并用于实验。....

结果

本文介绍的两种方案均允许通过流式细胞术分析，利用已知的LSC标志物CD34，对急性髓系白血病干细胞（AML LSC）进行富集。¹⁷，结合使用泛配体识别法或采用针对各个配体的混合抗体进行染色，以检测NKG2DL的表面表达。在 图1我们结果显示，所分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性，但也存在阴性亚群，总共显示出四种不同的细胞群体。我们的数据展示了此类染色的典型设门策略，首先根据细胞的FSC和SSC特征选主要细胞群体。在后续分析中排除双联体和死细胞（图1A)。使用FMO对照调节门控，以确保正确鉴定阳性细胞（图1B).

在图1C中，我们展示了CD34阳性（APC，纵轴）与NKG2DL阳性（PE，横轴）细胞的荧光强度。CD34阳性的急性髓系白血病（AML）细胞表现出较低的NKG2DL表面表达水平（.......

讨论

本文介绍了两种流式细胞术方法，可用于检测人原代急性髓系白血病（AML）细胞表面NKG2D配体（NKG2DL）的表达。我们证明，这两种检测方法均可与其他抗体染色（例如，检测CD34表达）联合使用。类似染色也可应用于其他原代细胞类型和细胞系。

我们最近发现，急性髓系白血病（AML）患者原始细胞表面缺乏NKG2D配体可富集白血病干细胞（LSC）¹⁴在急性髓系白血病（AML）中，NKG2DL阴性但非NKG2DL阳性的白血病亚群具有克隆形成能力 体内 白血病起始能力。未来的研究将揭示NKG2D配体表面表达的缺失是否也可作为富集其他癌症类型中干细胞的工具。

CD34 传统上被用于标记急性髓系白血病（AML）中的白血病干细胞（LSC），但 AML 是一种高度异质性的疾病，并非所有 AML 患者都表达 CD34（即 CD34 阴性 AML¹⁸）。我们先前已证明，缺乏 NKG2D 配体（NKG2DL）的表面表达可作为识别此类 CD3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-氨基放线菌素D（7-AAD）	Invitrogen	A1310	活率染料
96孔U型底板	Sarstedt	833925500	用于流式细胞仪的96孔板
APC小鼠抗人CD34	BD	555824	检测CD34的抗体 RRID: AB_398614
牛血清白蛋白	PanReac AppliChem	A1391,0050	染色缓冲液组分
乙二胺四乙酸	Roth	8043.1	染色缓冲液组分
胎牛血清（FCS）	BioConcept	2-01F10-I	补充RPMI培养基的组分
FlowJo 10.2	BD	/	用于流式细胞术实验数据分析的软件
山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	检测MICA和MICB一抗的二抗 RRID: AB_1037853
人NKG2D Fc嵌合蛋白，CF	R&D	1299-NK-050	可检测所有NKG2DL的融合蛋白 RRID:
人ULBP-1抗体	R&D	AF1380	检测ULBP1的抗体 RRID: AB_354765
人ULBP-2/5/6抗体	R&D	AF1298	检测ULBP2/5/6的抗体 RRID: AB_354725
人ULBP-3抗体	R&D	AF1517	检测ULBP3的抗体 RRID: AB_354835
MICA多克隆抗体	Thermo Scientific	PA5-35346	检测MICA的抗体 RRID: AB_2552656
MICB多克隆抗体	Thermo Scientific	PA5-66698	检测MICB的抗体 RRID: AB_2663413
一步式抗体生物素化试剂盒（1条，用于8次反应）	Miltenyi Biotec	130-093-385	用于NKG2DL融合蛋白的生物素化试剂盒
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537-500ML	染色缓冲液组分
兔抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	检测ULBP一抗的二抗 RRID: AB_2576217
彩虹校准微粒（8峰），3.0 μm	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	用于流式细胞仪维护的微珠
RPMI培养基	Sigma Aldrich	R8758-500ML	细胞培养基
RayBright通用补偿微珠	Raybiotech	137-00013-100	用于建立补偿矩阵的微珠
链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）- 1 mg/mL	Invitrogen	S866	检测生物素化NKG2DL融合蛋白的第二步试剂