利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量

Summary

我们描述了一种更一致和快速的方法，通过使用 Fiji-ImageJ 来量化 4T1 乳腺癌模型中的肺转移。

Abstract

乳腺癌是一种毁灭性的恶性肿瘤，仅2019年就导致美国4万名女性死亡，占新诊断女性癌症的30%。乳腺癌相关死亡的主要原因为转移性负担。因此，乳腺癌的临床前模型需要分析转移性负担，以临床相关。4T1乳腺癌模型为第四阶段人类乳腺癌提供了一个自发转移的、可量化的小鼠模型。然而，大多数 4T1 协议通过手动计算组织培养板上的染色菌落来量化转移性负担。虽然这足以使转移负担较低的组织使用，但人工计数中的人为错误会导致板汇合且难以计数时的结果不一致和可变。此方法为人工计数错误提供了基于计算机的解决方案。在这里，我们使用肺（4T1模型中的一种高度转移性组织）来评估协议。在斐济-ImageJ中获取并上传甲基蓝染色板的图像进行分析。然后，Fiji-ImageJ 确定图像选定区域的百分比为蓝色，表示具有转移性负担的板的百分比。这种基于计算机的方法比对高度转移组织的手动计数或组织病理学评估更一致和快速的结果。Fiji-ImageJ 结果的一致性取决于图像的质量。图像之间可能会发生细微的结果变化，因此建议拍摄多个图像并计算结果平均值。尽管其局限性最小，但这种方法通过提供一致和快速的结果，对量化肺转移性负担进行了改进。

Introduction

八分之一的女性将在有生之年被诊断出患有乳腺癌，尽管有多种选择治疗，但乳腺癌是美国女性癌症相关死亡的第二^大原因。这些妇女不会死于乳房的原发性肿瘤。相反，转移性负担是导致这种疾病的死亡，因为它通常蔓延到肺，骨，脑，肝脏和淋巴结^2。因此，乳腺癌模型需要评估转移，以有助于遏制这种疾病的死亡率。4T1乳腺癌模型是一个极好的协议，以做到这一点。此处描述的方法通过使用 Fiji-ImageJ 量化肺转移，从而产生一致和快速的结果，从而改进了 4T1 模型。

4T1模型是成熟的，大多数实验室使用的协议，如那些由普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格在2001^年3。4T1细胞系为6-硫冠宁（6TG）耐药，代表四期，三重阴性乳腺癌^3，4，5。它是临床上相关的，因为它是一个正畸模型和自发转移到相同的器官，在人类乳腺癌^3，4。4T1细胞根据注入的^3，4细胞的数量，以可预测的^{速率自发转移}。重要的是，这里使用的小鼠之间的遗传差异导致了转移性负担的预期个体间变异。为了评估转移，组织被收获，以收集和量化癌细胞在遥远的地点使用6TG选择和甲基蓝染色。其结果是组织培养板的集合与蓝点代表转移菌落。然而，普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议通过手动计算转移菌落来量化它们，因此，这是评估该模型中转移的标准方法。虽然这对于转移性负担低的组织来说很容易，但像肺这样的组织往往充满了转移。由于肺板可以高度汇合，通过人工计数准确和精确地量化转移菌落是困难的，并且容易出现人为错误。为了更好地量化转移性负担，我们描述使用 Fiji-ImageJ 作为基于计算机的人工计数误差解决方案。与血氧林和eosin（H&E）染色的组织病理学分析是量化肺转移的另一种手段，有趣的是，斐济-ImageJ软件^6，7也改进^了。然而，由于组织病理学分析观察肺的一片，它可以是不准确和不具代表性的。这是因为4T1模型导致整个器官的一些转移性病变，这些病变分布不均匀。虽然组织病理学分析和人工计数之间的总体趋势可能^相似，但单个值可能不同，因此组织病理学分析不应作为唯一的量化手段。我们演示了与组织病理学分析相比的好处，以及不同计数器之间手动计数的不一致，同时也展示了使用 Fiji-ImageJ 的一致性。此外，我们表明，这种方法可以减少孵化时间从10-14天到5天，这意味着研究人员可以分析数据从他们的研究比当依靠手动计数更快。

此方法是普拉斯基和奥斯特朗-罗森博格协议³的简单调整的集合。由于4T1模型被广泛使用，并且肺转移是临床前模型中测量的关键参数，我们相信这种方法可以被广泛使用，对乳腺癌研究人员具有很高的价值。唯一需要的额外用品是一台照相机和访问计算机与斐济-ImageJ，一个自由软件经常使用的图像分析^9。这种方法特别侧重于肺转移，但它可用于其他组织与严重的转移负担。

Protocol

此处描述的所有方法都经过弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并符合美国国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南。执行此协议需要获得相应机构的许可并遵守所有适当的准则。

1. 细胞培养

1. 制作完整的培养基（RPMI = 10% 胎儿牛血清 +1% 笔链） 。根据 ATCC 协议¹⁰ 恢复 4T1 细胞，在 T-25 烧瓶中孵育 37 °C 和 5% CO_2， 直到汇合。在恢复后的第二天更改介质以移除死细胞，如果介质在细胞汇合到足以通过之前被使用，则再次更改介质。
2. 一旦T-25烧瓶汇合，通过丢弃介质将电池通过将瓶体通过，用5 mL的1xDulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）清洗烧瓶，并加入500μL的三叶松-EDTA。在37°C下孵育5-10分钟，直到细胞分离。
   1. 分离后，向细胞中加入5 mL的温热完整培养媒体。吸气并转移5 mL到T-75烧瓶含有15mL的加热完整培养。
3. T-75烧瓶中的通道细胞至少四次。一旦烧瓶与8 mL的1x DPBS进行洗涤，加入1 mL用于分离细胞，向细胞中加入10 mL的暖介质，将1:6-1:8稀释到含有20mL全暖培养培养剂的新T-75烧瓶中。
4. 通道细胞，最多为适当数量的T-150烧瓶，含有40 mL的加热完整培养培养，用于注射小鼠的数量。大多数研究将需要多个T-150烧瓶，以确保足够的细胞注射。
5. 当小鼠准备注射（8周大或体重超过20克，取决于国际动物和协议），收获细胞丢弃介质，用10 mL的1x DPBS洗涤每个烧瓶，并添加2 mL的尝试性EDTA。在37°C下孵育5-10分钟，直到细胞分离。
6. 用 10 mL 的完整介质清洗烧瓶，将所有内容物（10 mL 的介质 = 2 mL 的 trypsin-EDTA 细胞混合物）转移到下一个烧瓶中。继续使用相同的 10 mL 介质从每个烧瓶中清洗和收集细胞，以避免使用过量的介质。
   1. 收集所有烧瓶后，将内装物转移到 50 mL 离心管中。收集 10 μL 样品，在微离心管中计数，并在 125 x g 下将 50 mL 锥形管离心 5 分钟。
7. 当细胞离心时，将10μL的锥盘蓝加入10μL的细胞样品。使用血细胞计计算细胞。确定细胞总数后，计算每只小鼠注射小鼠所需的1.2 x 10^6个 细胞所需的细胞浓度（每100μL）。
8. 离心后，在正确数量的无菌1x DPBS中，将脱毒介质和重新暂停细胞颗粒，每100μL含有1.2 x^{10 6} 个细胞。将细胞/DPBS混合物分离成微离心管，便于在吸气细胞注射时与注射器接触。将细胞留在冰上，并在不久之后注射，因为细胞在冰上长时间后将开始死亡。

2. 注射

1. 通过敲击或轻轻混合微离心管来重新注入细胞，然后将600μL吸入1 mL注射器，准备注射细胞。向上转动注射器，向下拉柱塞，使细胞远离注射器开口。点击注射器以清除气泡。
2. 将针头斜接并分配细胞回微离心管，直到注射器中仅保留 500 μL。把注射器平放在冰上。
   注:4T1细胞迅速从悬浮液中脱落。因此，通过频繁点击将细胞混合回悬浮状态非常重要。
3. 麻醉8周大/>20克雌性BALB/c小鼠使用异氟或其他批准的麻醉剂。监测小鼠的呼吸，以评估麻醉深度。
4. 一旦鼠标被正确麻醉，如缺乏角膜反射所示，将鼠标放在它的背上。使用拇指、指针和中指轻轻按住鼠标。使用指针和中指按住鼠标的上半身和拇指的左后腿。温柔但坚定。
5. 随着针头的斜面，将100μL的细胞皮下注射到小鼠的左腹部乳腺脂肪垫中。监控良好的出血和任何泄漏，并确保鼠标唤醒，注射后轻松移动。
   1. 在每只鼠标之间换针。
      注:不要让针头进入腹腔。这会导致癌症迅速扩散，不能代表模型。为确保皮下注射，插入左腹部乳腺脂肪垫时，轻轻向上拉针。如果针头易于向上抬起，则其定位在皮下正确。

3. 监测

1. 每周至少监测小鼠体重、身体状况评分、肿瘤大小、肿瘤状况、呼吸、活动水平、外观和运动。一旦肿瘤达到0.7-0.8厘米的直径，开始每天监测。
   1. 考虑安乐死时，肿瘤大小达到1.5厘米，或体重减轻达到20%，或严重临床下降的身体状况评分，肿瘤状况，呼吸，活动水平，外观，或运动观察基于机构指南。
      注:身体状况评分是至关重要的监测，因为体重可能会增加，因为肿瘤的大小增加，否定由于疾病负担的身体状况损失。确切的监测协议将取决于核准的 IACUC 或机构协议。

4. 尸检

1. 使用 CO_{2 按照机构指南对} 鼠标实施安乐死。
2. 用70%乙醇喷洒鼠标进行消毒。在小鼠的腹腔中线切开，露出体腔。
3. 取出肾脏。继续切割中线，直到隔膜可见。用剪刀刺穿隔膜使肺部泄气。修剪隔膜，以便更好地进入型腔。
4. 用钝剪刀剪断肋骨的中心。针肋回暴露肺和心脏。
5. 将针头插入心脏的顶点，直到将针头插入肾脏切除的腹腔中，使心脏具有 2 mL 的非无菌 1x DPBS。
6. 要切除心脏和肺部，请使用钝剪刀将食道和气管直接切到心脏上方。使用钳子，开始将心脏从身体中拉开，并切开任何保持连接的结缔组织。肺会和心脏一起出来。
7. 确定多叶（右）和单叶（左）肺。保持心脏附着供参考，但一旦肺部被鉴定，切掉心脏。
8. 在每个孔中标有含有 1x Hank 平衡盐水溶液 （HBSS） 的 12 孔板。每只鼠标需要2口井。将多叶（右）肺放在12个井板中，进行转移评估并保持在冰上。现在把相邻的井保持空。
   注:使用每只鼠标相同的肺（多叶）以确保每个样本的大小接近非常重要。然后，单叶肺可用于其他分析，如组织病理学。
   注:样品在冰上或4°C稳定数小时。

5. 加工组织

注:本节中的所有步骤都应使用无菌技术完成。

1. 标签1 15 mL锥形管每只鼠标，并添加2.5 mL的IV型胶原蛋白混合物和30单位的弹性酶到每个管。要制作IV型胶原酶混合物，每mL 1x HBSS和无菌过滤器溶解2毫克IV型胶原酶。这可以在-20°C下储存长达12个月，并根据需要解冻。
2. 将肺转移到第二个，清洁1x HBSS井的样品。用钳子旋转以去除任何剩余的血液。将干净的肺转移到空的3.5厘米组织培养板。用剪刀薄荷肺。用 2.5 mL 的 1x HBSS 冲洗板，将 1x HBSS 和肺片转移到已经含有胶原酶/弹性酶鸡尾酒的 15 mL 锥形管中（共 5 mL）。
3. 在4°C下孵育75分钟。 在此期间继续混合样品，请将管子放在摇杆或旋转轮上。在此孵育步骤中，为每只小鼠贴上50 mL离心管和10厘米组织培养板的标签。如果进行稀释，标记足够的10厘米组织培养板进行稀释。
   注:标记组织培养板的盖子。如果标记板本身，写入将干扰斐济图像J分析。
4. 使用 1x HBSS，使每个管的体积达到 10 mL。将含量倒入每个样品的 70 μm 细胞过滤器中 50 mL 锥形管中。使用 1 mL 注射器的柱塞通过过滤器轻轻研磨样品，让更多细胞过滤通过。
5. 在室温 （RT） 下在 350 x g 下离心 5 分钟。丢弃上一杯，用 10 mL 的 1x HBSS 洗涤颗粒。重复此步骤两次。
6. 在 10 mL 的 60 μM 6TG 完整培养基中重新发送颗粒，无论是 RPMI 还是 IMDM。10 cm 细胞培养板中的板样品，如果需要，使用稀释方案。在37°C下孵育，5%CO2孵育5天。
   注:1:2、1:10 和 1:100 是常见的稀释，需要根据研究参数进行实证确定。
   注意:6TG 是有毒的。处理时要小心，并遵守所有环境健康和安全指南进行处置。

6. 染色板

1. 将培养介质从盘子中倒入适当的废物容器中。通过每板添加5 mL未稀释的甲醇，并在RT孵育5分钟，确保旋转甲醇，使其覆盖整个板修复细胞。
   注意:如果摄入、吸入或皮肤上摄入甲醇是危险的。此步骤使用烟罩。
2. 将甲醇从盘子中倒入适当的废物容器中。用每盘5 mL的蒸馏水冲洗盘子，将水倒入适当的废物容器中。每板加入5 mL 0.03%的甲基蓝，在RT中孵育5分钟，确保使甲基蓝溶液旋转，使其覆盖整个板。
3. 将甲基蓝倒入适当的废物容器中。每盘用 5 mL 的蒸馏水再次冲洗板。将盘子倒置，用纸巾印上，以去除多余的液体。将板放在盖子上，让空气在RT处通宵干燥。
   注:转移性菌落为蓝色。一旦板干燥，它们可以无限期地存储在RT。

7. 图像分析

1. 从板上取下标签盖，注意确保样品的清晰识别。将所有染色的肺板放在干净、轻盈的表面上，在一张图片中拍摄所有板的照片。
2. 拍摄光线充足的区域中板材集合的照片，确保由于板非常反射，因此应尽量减少反射。板中的反射会影响图像分析，因此需要避免。
   注:斐济图像J的上限为2千兆像素。大多数现代智能手机将有足够的摄像头。请勿使用小于 800 万像素的相机。这个实验中使用的相机是谷歌像素2上的1220万像素。
3. 裁剪图像以包括板，但排除图像背景中的盖子或其他内容。将裁剪的图像上传到斐济图像J。
4. 使用以下命令将图像更改为黑白:图像、调整、颜色阈值、阈值方法:默认值、阈值颜色:黑白、阈值空间:实验室。取消选择"深色"背景框。图像现在应该是黑白的。黑色表示浅色背景，白色表示蓝色转移菌落。
5. 使用斐济-ImageJ 工具栏上的"圆圈"工具，选择要分析的区域。绘制一个圆圈用于所有板，以确保每个板都分析为相同大小的区域。选择可最大化板上分析区域的大小，同时最大限度地减少板边缘出现的背景噪声。绘制时，工具栏中会显示大小，因此在绘制圆时通过监视高度和宽度可以创建完美的圆。
6. 分析所选圆以确定区域的百分比为白色，表示具有蓝色转移菌落的板区域。使用以下命令:
   分析、分析粒子、大小（像素²）: 0-无限，循环度:0.00-1.00，显示:无，并选中"汇总"框。打好。
7. 记录百分比区域结果。这是所选区域的白色百分比，因此表示转移负担。
   注意:建议将结果保存在斐济-ImageJ 中，或将整个结果页复制/粘贴到单独的文档中。如果 % 面积结果是意外或可疑的，则可以查看任何其他测量是否也可疑，或者%区域记录不正确。
8. 将圆移动，而不通过抓住圆的中心将其移动到图片中的下一个板中来更改其大小。对图片中的所有板重复步骤 7.6 和 7.7。
9. 在至少两个图像上重复步骤 7.1 = 7.8。分析所有板和图像后，平均每个板的不同图像之间的 %面积结果，以减轻图片之间的任何不一致。

Results

此方法包含从普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格 4T1 协议³的简单调整，可在图1 中可视化。当3个独立的研究人员手动计算12个肺板的转移菌落（1:10稀释），结果非常不一致，不同的计数器之间（图2A）。所有研究人员都被指示"计算显示为蓝点的转移菌落"，然而这些不一致之处证明了手动计数高转移性板块的问题。研究人员对4T1模型有不同程度的经验。一位经过董事会认证的兽医病理学家分析了H&E染色肺滑梯的转移，作为另一种方法，比较斐济-ImageJ肺板分析（图2B）。

利用斐济-ImageJ分析，3名独立研究人员分析了3张12个板块集合的单独图像（1:2稀释）。图像是在两个独立的实验室空间拍摄的，其照明略有不同。每个图像的板的排列或拍摄角度不同。与手动计数结果相比，Fiji-ImageJ 结果在 3 个图像中的每个计数器之间是一致的 （

Discussion

如所示，手动计算每个肺板上的转移菌落可能是一种不准确和不精确的方法来量化肺转移，表明需要更好的定量方法（图2）。组织病理学分析与人工计数和斐济-ImageJ分析（图2B和4D）略有不同，可能是因为H&E幻灯片不是整个器官的代表性样本。该协议收获整个肺，因此更代表总肺转移，比手动计数更一致。尝试了几种不同的斐济-ImageJ分析方法，并在下面讨论，但上述协议似乎是优越的方法。

为这项研究收集了肺、血和大脑样本。然而，血液和大脑样本有很少的转移菌落，如果有任何。我们确定，手动计数转移菌落是这些不太转移的组织的最佳选择，因此不包括血液和大脑数据。当转移性负担易于手动计数（例如，10 或 20 个转移菌落（相对于数千个）时，最初的人为错误问题就不相关，因此不需要此协议。此外，血液样本在固定后可以在血盘上留下黑点，这会干扰斐济-ImageJ分析（图5）。重要的是，注射的细胞数量会影...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻醉室	见评论	见评论	在贵机构的政策中使用批准的材料
麻醉剂	见评论	见评论	在贵机构的政策中使用批准的材料
BALB/c 雌性小鼠	杰克逊实验室	000651
钝剪刀	Roboz	RS-6700
计算器	任意	任何
任何 相机	任意		最小 8000 百万像素
离心	任意		需要能够进行 125 x g 和 300 x g
的 CO2 安乐死设置	查看	评论 查看评论	在您所在机构的政策中使用批准的材料
冷藏室、冰箱、冷藏	任何	任何
带有 Fiji-ImageJ	的任何		需要能够运行 Fiji-ImageJ
计数室	Fisher Scientific	02-671-10
弯剪刀	Roboz	RS-5859
蒸馏水	任何	任何
弹性蛋白酶	MP 生物医学 100617
电子秤	任何	任何
胎牛血清 （FBS）	R&D Systems	S11150
镊子	Roboz	RS-8100
冰	N/A	N/A
培养箱	见评论	见评论	需要能够 5% CO2 和 37 °C
甲醇	Fisher Scientific	A412SK-4
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	03978-250ML
青霉素 链霉素	ATCC	30-2300
针或针	任何	用于	在尸检期间固定小鼠
塑料卡尺	VWR	25729-670
RMPI-1640 培养基	ATCC	30-2001
摇杆或旋转轮	任何
任何锋利的剪刀	Roboz	RS-6702
带 PES 膜的无菌一次性过滤器	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 烧瓶	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 烧瓶	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
三角塑料烧杯	Fisher Scientific	14-955-111F	用于称量小鼠
台盼蓝	VWR	97063-702
胰蛋白酶-EDTA	ATCC	30-2101
IV 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm 组织培养板	Nunclon	153066
1 mL 注射器	BD	309659
1.7 mL 微量离心管	VWR	87003-294
10 cm 组织培养板	Fisher Scientific	08-772-22
12 孔板	Corning	3512
15 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate 缓冲盐水 （DPBS）	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank's 平衡盐水溶液 （HBSS）	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 针头	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 （ATCC®CRL&害羞;2539™）	ATCC	CRL-2539
50 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
6-硫鸟嘌呤	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM 细胞过滤器	Fisher Scientific	22-363-548
70% 乙醇	Sigma Aldrich	E7023	用去离子水稀释至 70%