利用计算机图像分析提高4T1乳腺癌模型中肺转移的定量

Summary

我们描述了一种更一致和快速的方法，通过使用 Fiji-ImageJ 来量化 4T1 乳腺癌模型中的肺转移。

Abstract

乳腺癌是一种毁灭性的恶性肿瘤，仅2019年就导致美国4万名女性死亡，占新诊断女性癌症的30%。乳腺癌相关死亡的主要原因为转移性负担。因此，乳腺癌的临床前模型需要分析转移性负担，以临床相关。4T1乳腺癌模型为第四阶段人类乳腺癌提供了一个自发转移的、可量化的小鼠模型。然而，大多数 4T1 协议通过手动计算组织培养板上的染色菌落来量化转移性负担。虽然这足以使转移负担较低的组织使用，但人工计数中的人为错误会导致板汇合且难以计数时的结果不一致和可变。此方法为人工计数错误提供了基于计算机的解决方案。在这里，我们使用肺（4T1模型中的一种高度转移性组织）来评估协议。在斐济-ImageJ中获取并上传甲基蓝染色板的图像进行分析。然后，Fiji-ImageJ 确定图像选定区域的百分比为蓝色，表示具有转移性负担的板的百分比。这种基于计算机的方法比对高度转移组织的手动计数或组织病理学评估更一致和快速的结果。Fiji-ImageJ 结果的一致性取决于图像的质量。图像之间可能会发生细微的结果变化，因此建议拍摄多个图像并计算结果平均值。尽管其局限性最小，但这种方法通过提供一致和快速的结果，对量化肺转移性负担进行了改进。

Introduction

八分之一的女性将在有生之年被诊断出患有乳腺癌，尽管有多种选择治疗，但乳腺癌是美国女性癌症相关死亡的第二^大原因。这些妇女不会死于乳房的原发性肿瘤。相反，转移性负担是导致这种疾病的死亡，因为它通常蔓延到肺，骨，脑，肝脏和淋巴结^2。因此，乳腺癌模型需要评估转移，以有助于遏制这种疾病的死亡率。4T1乳腺癌模型是一个极好的协议，以做到这一点。此处描述的方法通过使用 Fiji-ImageJ 量化肺转移，从而产生一致和快速的结果，从而改进了 4T1 模型。

4T1模型是成熟的，大多数实验室使用的协议，如那些由普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格在2001^年3。4T1细胞系为6-硫冠宁（6TG）耐药，代表四期，三重阴性乳腺癌^3，4，5。它是临床上相关的，因为它是一个正畸模型和自发转移到相同的器官，在人类乳腺癌^3，4。4T1细胞根据注入的^3，4细胞的数量，以可预测的^速率自发

Protocol

此处描述的所有方法都经过弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并符合美国国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南。执行此协议需要获得相应机构的许可并遵守所有适当的准则。

1. 细胞培养

1. 制作完整的培养基（RPMI = 10% 胎儿牛血清 +1% 笔链） 。根据 ATCC 协议¹⁰ 恢复 4T1 细胞，在 T-25 烧瓶中孵育 37 °C 和 5% CO_2， 直到汇合。在恢复后的第二天更改介质以移除死细胞，如果介质在细胞汇合到足以通过之前被使用，则再次更改介质。
2. 一旦T-25烧瓶汇合，通过丢弃介质将电池通过将瓶体通过，用5 mL的1xDulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）清洗烧瓶，并加入500μL的三叶松-EDTA。在37°C下孵育5-10分钟，直到细胞分离。
   1. 分离后，向细胞中加入5 mL的温热完整培养媒体。吸气并转移5 mL到T-75烧瓶含有15mL的加热完整培养。
3. T-75烧瓶中的通道细胞至少四次。一旦烧瓶与8 mL的1x DPBS进行洗涤，加入1 mL用于分离细胞，向细胞中加入10 mL的暖介质，将1:6-1:8稀释到含有20mL全暖培养培养剂的新T-75烧瓶中。
4. 通道细胞，最多为适当数量的T-150烧瓶，含有40 mL的加热完整培养培养，用于注射小鼠....

Results

此方法包含从普拉斯基和奥斯特朗德-罗森博格 4T1 协议³的简单调整，可在图1 中可视化。当3个独立的研究人员手动计算12个肺板的转移菌落（1:10稀释），结果非常不一致，不同的计数器之间（图2A）。所有研究人员都被指示"计算显示为蓝点的转移菌落"，然而这些不一致之处证明了手动计数高转移性板块的问题。研究人员对4T1模型有不同程度的经验。一位经过董事会认证的兽医病理学家分析了H&E染色肺滑梯的转移，作为另一种方法，比较斐济-ImageJ肺板分析（图2B）。

利用斐济-ImageJ分析，3名独立研究人员分析了3张12个板块集合的单独图像（1:2稀释）。图像是在两个独立的实验室空间拍摄的，其照明略有不同。每个图像的板的排列或拍摄角度不同。与手动计数结果相比，Fiji-ImageJ 结果在 3 个图像中的每个计数器之间是一致的 （

Discussion

如所示，手动计算每个肺板上的转移菌落可能是一种不准确和不精确的方法来量化肺转移，表明需要更好的定量方法（图2）。组织病理学分析与人工计数和斐济-ImageJ分析（图2B和4D）略有不同，可能是因为H&E幻灯片不是整个器官的代表性样本。该协议收获整个肺，因此更代表总肺转移，比手动计数更一致。尝试了几种不同的斐济-ImageJ分析方法，并在下面讨论，但上述协议似乎是优越的方法。

为这项研究收集了肺、血和大脑样本。然而，血液和大脑样本有很少的转移菌落，如果有任何。我们确定，手动计数转移菌落是这些不太转移的组织的最佳选择，因此不包括血液和大脑数据。当转移性负担易于手动计数（例如，10 或 20 个转移菌落（相对于数千个）时，最初的人为错误问题就不相关，因此不需要此协议。此外，血液样本在固定后可以在血盘上留下黑点，这会干扰斐济-ImageJ分析（图5）。重要的是，注射的细胞数量会影.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻醉室	见评论	见评论	在贵机构的政策中使用批准的材料
麻醉剂	见评论	见评论	在贵机构的政策中使用批准的材料
BALB/c 雌性小鼠	杰克逊实验室	000651
钝剪刀	Roboz	RS-6700
计算器	任意	任何
任何 相机	任意		最小 8000 百万像素
离心	任意		需要能够进行 125 x g 和 300 x g
的 CO2 安乐死设置	查看	评论 查看评论	在您所在机构的政策中使用批准的材料
冷藏室、冰箱、冷藏	任何	任何
带有 Fiji-ImageJ	的任何		需要能够运行 Fiji-ImageJ
计数室	Fisher Scientific	02-671-10
弯剪刀	Roboz	RS-5859
蒸馏水	任何	任何
弹性蛋白酶	MP 生物医学 100617
电子秤	任何	任何
胎牛血清 （FBS）	R&D Systems	S11150
镊子	Roboz	RS-8100
冰	N/A	N/A
培养箱	见评论	见评论	需要能够 5% CO2 和 37 °C
甲醇	Fisher Scientific	A412SK-4
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	03978-250ML
青霉素 链霉素	ATCC	30-2300
针或针	任何	用于	在尸检期间固定小鼠
塑料卡尺	VWR	25729-670
RMPI-1640 培养基	ATCC	30-2001
摇杆或旋转轮	任何
任何锋利的剪刀	Roboz	RS-6702
带 PES 膜的无菌一次性过滤器	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 烧瓶	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 烧瓶	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 培养瓶	Fisher Scientific	13-680-65
三角塑料烧杯	Fisher Scientific	14-955-111F	用于称量小鼠
台盼蓝	VWR	97063-702
胰蛋白酶-EDTA	ATCC	30-2101
IV 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm 组织培养板	Nunclon	153066
1 mL 注射器	BD	309659
1.7 mL 微量离心管	VWR	87003-294
10 cm 组织培养板	Fisher Scientific	08-772-22
12 孔板	Corning	3512
15 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate 缓冲盐水 （DPBS）	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank's 平衡盐水溶液 （HBSS）	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 针头	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 （ATCC®CRL&害羞;2539™）	ATCC	CRL-2539
50 mL 离心管	Fisher Scientific	14-959-49A
6-硫鸟嘌呤	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM 细胞过滤器	Fisher Scientific	22-363-548
70% 乙醇	Sigma Aldrich	E7023	用去离子水稀释至 70%