该实验方案描述了从小鼠肠道上皮中分离正在进行去分化的绒毛，以确定其形成类器官的潜能。
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摘要
摘要
类器官的克隆形成能力源于肠道上皮中存在的干细胞。小鼠小肠上皮分为隐窝和绒毛：干细胞和增殖细胞局限于隐窝，而绒毛上皮仅含有已分化细胞。因此，正常的肠隐窝可在三维培养中形成类器官，而绒毛则不能。此处描述的方法仅适用于经历去分化并获得干性的绒毛上皮。该方法使用Smad4功能缺失：β-catenin功能获得（Smad4KO:β-cateninGOF）条件性突变小鼠。该突变导致肠道绒毛发生去分化，并在绒毛中生成干细胞。发生去分化的肠绒毛通过玻璃片从肠组织上刮取，置于70 µm细胞筛中，并多次洗涤以去除任何松散的细胞或隐窝，然后接种于BME-R1基质中，以评估其形成类器官的潜能。为确保所形成的类器官来源于去分化的绒毛区室而非隐窝，采用了两个主要标准：1）在接种于三维基质前后，通过显微镜评估 分离的绒毛，确保不存在任何附着的隐窝；2）监测绒毛来源类器官发育的时间进程。绒毛来源的类器官仅在接种后两至五天才开始形成，且形态不规则；而同一肠上皮来源的隐窝类器官在接种后16小时内即可明显观察到，且呈球形。然而，该方法的局限性在于，所形成的类器官数量以及绒毛来源类器官启动所需时间，取决于去分化的程度。因此，根据引起去分化的突变特异性或损伤类型，必须通过实验经验确定收获绒毛以检测其类器官形成潜能的最佳阶段。
引言
肠隐窝而非绒毛在Matrigel或BME-R1基质中培养时可形成类器官。这些类器官是自组织结构，常被称为 "类肠道器官" 由于肠道上皮中存在多种分化谱系、前体细胞和干细胞 体内类器官的形成潜力归因于隐窝中存在干细胞1另一方面，肠绒毛仅由已分化的细胞组成，因此无法形成类器官。然而，突变2 或可允许绒毛上皮去分化的条件可能会导致绒毛中出现干细胞2,3将去分化的绒毛上皮接种于三维基质中，通过检测其类器官形成能力作为干细胞特性的指标，可证实绒毛上皮中因命运改变而产生的干性特征 从头合成 绒毛上皮中的干性。因此，该操作的关键在于确保无隐窝污染。
Smad4KO:β-cateninGOF 条件性突变可导致肠上皮去分化，其特征是在绒毛中表达增殖和干细胞标志物，并最终在绒毛中形成类似隐窝的结构，称为异位隐窝。这些去分化的绒毛中是否存在干细胞，是通过检测异位隐窝中干细胞标志物的表达（体内）以及突变绒毛在Matrigel3中培养时形成类器官的能力来确定的。以下所述步骤详细说明了用于验证Smad4KO:β-....
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方案
所有小鼠实验，包括他莫昔芬的使用和通过颈椎脱位实施安乐死，均已获得斯蒂文斯理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠
注意：已有关于生成 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 小鼠的先前描述3。实验使用八至十二周龄的成年雌性小鼠。
- 诱导 Smad4敲除β-catenin功能获得性（GOF） 基因突变在 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+；Villin-CreERT2 连续四天通过玉米油腹腔注射他莫昔芬。
- 在首次注射他莫昔芬后十天，通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 用70%乙醇喷洒腹部，以防止小鼠毛发进入腹腔。
- 用解剖剪打开腹腔以暴露肠道。借助解剖剪和镊子分离肠道。
注意：Smad4 的缺失与 β-catenin 的功能获得性突变同时发生 (Smad4敲除β-catenin功能....
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结果
决定该实验成功的关键因素是防止隐窝污染。通过确认以下四个主要标准，可确保类器官来源于绒毛（而非任何污染的隐窝）：1）在将绒毛接种至BME-R1前及接种后，通过显微镜检查确认所收获绒毛的纯度；2）每孔接种少量绒毛，以便能够单独观察每一个接种的绒毛；3）每日监测类器官的发育情况；时间序列图像显示了类器官从绒毛发育的过程（图3）；4）监测从绒毛起始的类器官的生长动力学及其形态特征；源自绒毛的类器官最初呈不规则形状，需两至五天后才可在4×放大下观察到，而通过EDTA/PBS螯合方法分离隐窝所培养的隐窝来源类器官则在过夜后即形成具有清晰边界的球形结构（1,4）（图2）。
为检测绒毛类器官形成潜能而处死小鼠的最佳时间点，是在去分化后的绒毛上皮表达干细胞标志物并开始在体内（in vivo）形成异位隐窝之后（约在给予Smad4f.......
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讨论
该方法可验证去分化绒毛上皮获得干细胞标志物后所具备的自我更新能力 在体内 正常的肠上皮在三维培养条件下能够由隐窝区形成类器官，但不能由绒毛区形成类器官，这是由于干细胞存在于隐窝中1因此，从去分化的绒毛上皮形成类器官 在三维培养中培养可证实细胞命运逆转导致干细胞的形成。关于肠道上皮中因突变和/或损伤引发细胞命运逆转的报道日益增多2, 3, 9, 10, 11, 12因此，该方法适用于绒毛上皮去分化并表达干细胞标志物的类似情况 体内.
我们通过时间过程观察到类器官从 Smad4KO<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本出版物获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所资助编号 K22 CA218462-03 的支持。表达 R-Spondin1 的 HEK293-T 细胞系由 Michael P. Verzi 博士慷慨惠赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM F-12培养基 | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-二氨基联苯胺 | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96孔U型底板 | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC试剂盒 | Vector Labs | PK4001 | |
| 斜头剪刀 | Fisher Scientific | 11-999 | |
| 无动物源性重组人EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A | Gibco | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）无蛋白酶粉末 | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44抗体 | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2抗体 | Cell Signaling | 12306 | |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70微米细胞筛 | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex低生长因子基底膜提取物，R1型 | R&D | 3433-005-R1 | |
| 解剖剪刀 | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax（100倍浓度） | Gibco | 35050-061 | |
| 表达RSPO-1的HEK 293-T细胞 | 由Michael Verzi博士惠赠 | ||
| HEPES（1 M） | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| 网状滤器 | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 89218-844 | |
| N-2添加剂（100倍浓度） | Gibco | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200平头吸头 | VWR | 46620-642 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin（50 mg/mL） | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS（10倍浓度） | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| 重组小鼠Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| 信号稀释液 | Cell Signaling | 8112L | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6孔组织培养板 | Fisher Scientific | 50-146-770 |
参考文献
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation a....
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