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方法文章

从小肠绒毛上皮去分化过程中类器官的三维培养 关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养

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DOI：

10.3791/61809

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2021年4月1日

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1Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

本文内容

摘要

该实验方案描述了从小鼠肠道上皮中分离正在进行去分化的绒毛，以确定其形成类器官的潜能。

摘要

类器官的克隆形成能力源于肠道上皮中存在的干细胞。小鼠小肠上皮分为隐窝和绒毛：干细胞和增殖细胞局限于隐窝，而绒毛上皮仅含有已分化细胞。因此，正常的肠隐窝可在三维培养中形成类器官，而绒毛则不能。此处描述的方法仅适用于经历去分化并获得干性的绒毛上皮。该方法使用Smad4功能缺失：β-catenin功能获得（Smad4KO:β-cateninGOF）条件性突变小鼠。该突变导致肠道绒毛发生去分化，并在绒毛中生成干细胞。发生去分化的肠绒毛通过玻璃片从肠组织上刮取，置于70 µm细胞筛中，并多次洗涤以去除任何松散的细胞或隐窝，然后接种于BME-R1基质中，以评估其形成类器官的潜能。为确保所形成的类器官来源于去分化的绒毛区室而非隐窝，采用了两个主要标准：1）在接种于三维基质前后，通过显微镜评估 分离的绒毛，确保不存在任何附着的隐窝；2）监测绒毛来源类器官发育的时间进程。绒毛来源的类器官仅在接种后两至五天才开始形成，且形态不规则；而同一肠上皮来源的隐窝类器官在接种后16小时内即可明显观察到，且呈球形。然而，该方法的局限性在于，所形成的类器官数量以及绒毛来源类器官启动所需时间，取决于去分化的程度。因此，根据引起去分化的突变特异性或损伤类型，必须通过实验经验确定收获绒毛以检测其类器官形成潜能的最佳阶段。

引言

肠隐窝而非绒毛在Matrigel或BME-R1基质中培养时可形成类器官。这些类器官是自组织结构，常被称为 "类肠道器官" 由于肠道上皮中存在多种分化谱系、前体细胞和干细胞 体内类器官的形成潜力归因于隐窝中存在干细胞1另一方面，肠绒毛仅由已分化的细胞组成，因此无法形成类器官。然而，突变2 或可允许绒毛上皮去分化的条件可能会导致绒毛中出现干细胞2,3将去分化的绒毛上皮接种于三维基质中，通过检测其类器官形成能力作为干细胞特性的指标，可证实绒毛上皮中因命运改变而产生的干性特征 从头合成 绒毛上皮中的干性。因此，该操作的关键在于确保无隐窝污染。

Smad4KO:β-cateninGOF 条件性突变可导致肠上皮去分化，其特征是在绒毛中表达增殖和干细胞标志物，并最终在绒毛中形成类似隐窝的结构，称为异位隐窝。这些去分化的绒毛中是否存在干细胞，是通过检测异位隐窝中干细胞标志物的表达（体内）以及突变绒毛在Matrigel3中培养时形成类器官的能力来确定的。以下所述步骤详细说明了用于验证Smad4KO:β-cateninGOF突变小鼠肠上皮去分化过程中干细胞特性的方法。该方法在分离绒毛时的一个关键特征是采用刮取肠腔的方式，而非EDTA螯合方法4。与EDTA螯合法不同，通过刮取法分离绒毛能够保留大部分下方的间充质组织，并可通过调节刮取压力获得不带附着隐窝的绒毛。刮取压力依赖于操作者的主观判断，因此，需由操作者通过实验经验确定最佳压力，以获得无隐窝附着的绒毛。该操作的关键环节在于，在将绒毛接种于BME-R1基质前后，均需通过显微镜检查确保绒毛样本中无隐窝污染。

使用玻璃载片刮取肠腔内的肠绒毛，并将其置于70 µm滤膜上，用PBS洗涤以去除松散的细胞或隐窝（如有），然后在BME-R1基质中进行接种。该方法强调以下几点以避免隐窝污染：a）仅从十二指肠近端一半区域采集绒毛，该区域绒毛最长；b）尽量减少获得绒毛的刮取次数；c）将含有绒毛的滤膜在六孔板中用一系列PBS进行洗涤；d）在接种于BME-R1基质前后，均通过显微镜检查确认无隐窝污染。通过刮取法而非EDTA螯合法分离绒毛，可防止底层间充质的完全丢失，若需要从绒毛上皮启动类器官形成，该间充质可能提供必要的微环境信号5, 6, 7, 8。

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方案

所有小鼠实验，包括他莫昔芬的使用和通过颈椎脱位实施安乐死，均已获得斯蒂文斯理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 小鼠

注意：已有关于生成 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 小鼠的先前描述3。实验使用八至十二周龄的成年雌性小鼠。

  1. 诱导 Smad4敲除β-catenin功能获得性（GOF） 基因突变在 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+；Villin-CreERT2 连续四天通过玉米油腹腔注射他莫昔芬。
  2. 在首次注射他莫昔芬后十天，通过颈椎脱位法处死小鼠。
  3. 用70%乙醇喷洒腹部，以防止小鼠毛发进入腹腔。
  4. 用解剖剪打开腹腔以暴露肠道。借助解剖剪和镊子分离肠道。
    ​注意：Smad4 的缺失与 β-catenin 的功能获得性突变同时发生 (Smad4敲除β-catenin功能获得（GOF）) 在肠上皮中通过注射实现Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+；Villin-CreERT2 每天连续四天，以每公斤体重0.05克他莫昔芬溶于玉米油中对小鼠进行处理。首次注射他莫昔芬后十天处死小鼠，以确保去分化绒毛中存在表达干细胞相关标志物的细胞。

2. 十二指肠的分离与制备

  1. 分离出十二指肠的近端一半。
  2. 用10 mL注射器吸取5 mL冰冻PBS冲洗十二指肠，以清除管腔内容物。
  3. 用斜角剪刀纵向剪开十二指肠，并将其平铺在冰上的15 cm培养皿中，使十二指肠管腔面向操作者。

3. 通过刮取法分离绒毛

  1. 开始刮取前，将一个70 µm的滤网放入6孔细胞培养板的一个孔中。在所有孔中加入4 mL的1×PBS，并将6孔细胞培养板置于冰上（图1）。
  2. 使用两片显微镜玻片按以下方式刮取绒毛：一片用于固定十二指肠，另一片用于刮取（图1B1）。
    1. 在十二指肠腔面轻轻来回刮取两次，以去除黏液。施加适当压力，使此步骤仅去除黏液层而不损伤绒毛。
    2. 再次以与步骤3.1相同的压力来回刮取十二指肠两次，此时可见绒毛在玻片上聚集（图1B2）。此为最佳压力（需由操作者通过经验确定），可使绒毛脱离而无隐窝附着。
  3. 使用含有PBS的1 mL移液器，将步骤3.2.2中玻片上收集的绒毛转移至置于6孔板中的70 µm滤网中。每次刮取后均以此方式收集绒毛（图1B2）。
  4. 通过将装有绒毛的70 µm滤网依次转移至含有冷PBS（约4 mL/孔）的6孔板各孔中，清洗滤网上收集的绒毛（来自步骤3.3），以去除可能存在的游离隐窝。
  5. 使用P1000移液器，将70 µm滤网中PBS中的绒毛悬液（约3 mL）转移至冰上预冷的新15 mL离心管中。
  6. 使用经0.1% BSA包被的钝头P200移液器吸头吸取50 µL绒毛悬液至玻片上。在4倍物镜下计数50 µL液滴中的绒毛数量，以确定PBS悬液中绒毛的浓度。例如，若在50 µL悬液中观察到10根绒毛，则绒毛浓度为0.2 根/µL。此时也应确认无附着隐窝存在。
  7. 计算所需绒毛悬液体积，以达到在BME-R1基质中接种浓度为0.5 根/µL。额外增加100 µL体积，以补偿移液误差以及用于显微镜检查以确保绒毛纯度所需的样品量。
    ​注意：在首次观察到绒毛释放后，后续刮取应采用前两次刮取所用的压力（即去除黏液但不损伤绒毛的压力），并将来回刮取次数限制为两次。此措施可避免绒毛与隐窝共同脱落。必须通过显微镜评估绒毛，以确保无附着隐窝存在。

4. 在BME-R1基质上接种绒毛

  1. 使用经0.1% BSA包被的p200平头吸头，将步骤3.6中获得的足量绒毛转移至微量离心管中，用12.5 µL BME-R1基质胶重悬，以实现每孔约6个绒毛的接种密度。在此步骤中使用BSA包被的平头吸头可确保较大体积的绒毛被顺利吸取，避免因尖头吸头过窄而导致堵塞，或因粘附在吸头壁上造成样本损失。
  2. 在4 °C条件下，以200 × g离心2分钟，使绒毛沉淀，随后弃去上清液。
  3. 重复步骤4.2以去除任何残留的PBS，并在层流罩内进行下一步操作。
  4. 用冰上融化的适量预冷BME-R1基质胶轻柔重悬绒毛沉淀。
  5. 使用p20移液器，将含绒毛的BME-R1基质胶以12.5 µL/孔的体积接种至预热的96孔U型底板中，形成三维培养体系。
  6. 将培养板置于37 °C组织培养孵箱中孵育15分钟，使BME-R1基质胶充分凝固。
  7. 每孔加入125 µL预热的ENR（表皮生长因子/诺金/N-磺酸素1）培养基：即在高级DMEM F-12培养基中添加1×青霉素-链霉素、10 mM HEPES、Glutamax、50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、5%由表达R-Spondin1的HEK293-T细胞产生的条件培养基、1× N2、1× B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸和0.05 mg/mL Primocin。
  8. 将接种后的绒毛置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育，并每隔一天更换一次培养基。
  9. 若在接种后两天内出现类器官，则应弃去该孔，因为绒毛来源的类器官最早预期出现时间应在接种后两天以上。
    注意：任何长度达到或超过完整绒毛一半的绒毛均计为一个绒毛。与隐窝来源的类器官不同，绒毛来源的类器官不会在接种后24小时内形成。具有类器官形成潜能的绒毛在类器官形成前会呈现变暗和收缩的形态。因此，若在接种后一天内即出现类器官的孔，应予以弃去，以避免可能由隐窝污染所导致的假阳性结果。条件培养基的制备方法可根据要求提供。

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结果

决定该实验成功的关键因素是防止隐窝污染。通过确认以下四个主要标准，可确保类器官来源于绒毛（而非任何污染的隐窝）：1）在将绒毛接种至BME-R1前及接种后，通过显微镜检查确认所收获绒毛的纯度；2）每孔接种少量绒毛，以便能够单独观察每一个接种的绒毛；3）每日监测类器官的发育情况；时间序列图像显示了类器官从绒毛发育的过程（图3）；4）监测从绒毛起始的类器官的生长动力学及其形态特征；源自绒毛的类器官最初呈不规则形状，需两至五天后才可在4×放大下观察到，而通过EDTA/PBS螯合方法分离隐窝所培养的隐窝来源类器官则在过夜后即形成具有清晰边界的球形结构（1,4）（图2）。

为检测绒毛类器官形成潜能而处死小鼠的最佳时间点，是在去分化后的绒毛上皮表达干细胞标志物并开始在体内（in vivo）形成异位隐窝之后（约在给予Smad4f...

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讨论

该方法可验证去分化绒毛上皮获得干细胞标志物后所具备的自我更新能力 在体内 正常的肠上皮在三维培养条件下能够由隐窝区形成类器官，但不能由绒毛区形成类器官，这是由于干细胞存在于隐窝中1因此，从去分化的绒毛上皮形成类器官 在三维培养中培养可证实细胞命运逆转导致干细胞的形成。关于肠道上皮中因突变和/或损伤引发细胞命运逆转的报道日益增多2, 3, 9, 10, 11, 12因此，该方法适用于绒毛上皮去分化并表达干细胞标志物的类似情况 体内.

我们通过时间过程观察到类器官从 Smad4KO<...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本出版物获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所资助编号 K22 CA218462-03 的支持。表达 R-Spondin1 的 HEK293-T 细胞系由 Michael P. Verzi 博士慷慨惠赠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM F-12培养基Gibco12634010
3,3-二氨基联苯胺Vector LabsSK-4105
96孔U型底板Fisher ScientificFB012932
ABC试剂盒Vector Labs PK4001
斜头剪刀Fisher Scientific11-999
无动物源性重组人EGFPeprotechAF-100-15
B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素AGibco12587010
牛血清白蛋白（BSA）无蛋白酶粉末Fisher ScientificBP9703100
CD44抗体BioLegend1030001
Cdx2抗体Cell Signaling12306
玉米油Sigma-AldrichC8267-500ML
Corning 70微米细胞筛Life Sciences431751
Cultrex低生长因子基底膜提取物，R1型R&D3433-005-R1
解剖剪刀Fisher Scientific22-079-747
镊子Fisher Scientific17-456-209
Glutamax（100倍浓度）Gibco35050-061
表达RSPO-1的HEK 293-T细胞由Michael Verzi博士惠赠
HEPES（1 M）Gibco15630-080
HistogelThermoscientificHG-4000-012
网状滤器Fisher Scientific07-201-431
显微镜载玻片VWR89218-844
N-2添加剂（100倍浓度）Gibco17502048
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
p200平头吸头VWR46620-642
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140-122
Primocin（50 mg/mL）Invivogenant-pm-1
Quality Biological Inc PBS（10倍浓度）Fisher Scientific50-146-770
重组小鼠NogginPeprotech250-38
信号稀释液Cell Signaling8112L
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648-1G
6孔组织培养板Fisher Scientific50-146-770

参考文献

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类器官形成去分化方案Smad4 基因敲除β-catenin 功能获得绒毛刮取法BME-R1 基质包被类器官启动时机隐窝污染避免表型分析
从小肠绒毛上皮去分化过程中类器官的三维培养 关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养
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