一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

摘要

原代肝细胞是研究肝脏反应和代谢的有力工具 体外利用市售试剂，开发出一种改进的小鼠原代肝细胞分离方案，该方案更加节省时间和劳动力。

摘要

原代肝细胞被广泛用于肝脏研究 体外 研究，尤其是在葡萄糖代谢研究中具有重要意义。根据不同需求（如时间、人力、成本和原代肝细胞的使用）对基础技术进行了调整，从而产生了多种原代肝细胞分离方案。然而，原代肝细胞分离过程中步骤繁多以及耗时的试剂配制，严重影响了实验效率。在比较了不同方案的优缺点后，整合各方案的优势，建立了一种快速高效的原代肝细胞分离方案。该方案仅需约35分钟，即可获得与其它方法相当甚至更多的健康原代肝细胞。利用所分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验，进一步验证了该方案在相关研究中的实用性 体外 肝脏代谢研究。我们还全面回顾和分析了本研究中每一步骤的意义与目的，以便未来的研究人员能够根据需要进一步优化该方案。

引言

肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一，因其在食物消化、血液循环和解毒等多种维持生命的功能中发挥关键作用。小鼠原代肝细胞的应用 体外 培养在碳水化合物代谢和肝细胞癌研究中日益受到关注。因此，建立一种简便的小鼠原代肝细胞分离方法，同时维持其固有的生理功能，显得尤为重要。由于肝脏在葡萄糖代谢中发挥枢纽作用，它在葡萄糖的生成与储存过程中也处于核心地位¹原代肝细胞实验 体外 是大多数葡萄糖代谢研究中必不可少的。因此，多年来，多个研究团队已开发出多种小鼠原代肝细胞分离方案。

小鼠肝细胞分离的一般步骤是首先使用等渗液体（如磷酸盐缓冲液（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS））灌注肝脏以清除血液，然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些方案具有相似的总体流程，但根据不同的实验需求，在试剂和具体步骤上有所差异。然而，配制所需试剂并执行分离过程通常耗时较长。在制定本方案时，效率被列为首要目标，所有试剂均为市售即用型，且操作步骤尽可能简化。本方案的总体目标是提供一种快速、省力的小鼠原代肝细胞分离方法，同时不损害所分离原代肝细胞的纯度和活性。

....

方案

所有实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用8周龄C57BL/6雌性小鼠。

1. 准备：

1. 将 William's E 培养基（含 GlutaMAX 补充剂）与 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌素溶液混合，配制成培养液。
2. 将25 mL胶原酶-分散酶培养基（例如，Liver Digest Medium）通过0.45 µm注射器滤器过滤，以去除颗粒碎片。
3. 将50 mL双蒸水加热₂O (ddH₂O)₂O）、35 mL 灌注培养基（例如 Liver Perfusion Medium）（首次使用本方案时为 50 mL）以及 25 mL 过滤的胶原酶-分散酶培养基，置于 45 °C 水浴中预热 30 分钟。
4. 在无菌细胞培养操作台内，将 2 mL 10x HBSS 与 18 mL Percoll 混合于 50 mL 离心管中，配制成 20 mL 1x Percoll-HBSS，置于冰上或 4 °C 保存。
   注意：1x Percoll-HBSS 可在 4 °C 保存至少 6 个月。
5. 在无菌细胞培养操作台内，将30 mL洗涤液（例如，肝细胞洗涤液）倒入洁净的培养皿中，并置于冰上保存。
6. 将泵管浸入45 °C水浴的水中。若室温为25 °C，结....

结果

为了检测效率，本研究采用8周龄雌性C57BL/6小鼠进行了当前的原代肝细胞分离方案。检测了分离所得原代肝细胞的贴壁能力与纯度。原代肝细胞分离广泛应用于肝脏生理学相关的多种实验，如肝脏药物效应、葡萄糖代谢、药物生物标志物活性²、胰岛素敏感性以及葡萄糖生成等。因此，本研究通过以下实验检测了采用该方案分离得到的原代肝细胞的活性。

本方案中，原代肝细胞贴壁无需包被处理
分离得到的原代肝细胞以每孔 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 6 孔板中。接种 1 小时后观察到细胞已牢固贴附，并在接种后 12 小时完全铺展（图 3）。这表明接种 12 小时后，细胞已准备好用于后续实验。根据小鼠肝组织内肝细胞的细胞核形态特征，单核肝细胞多分布于边缘区域，而双核或多核肝细胞（终末分化的标志）则主要位于中央区域^3,4。显微.......

讨论

已开发出多种原代肝细胞分离方案，并根据不同需求持续优化和调整（表1）。分离方案通常包括两个部分：灌注（含酶消化）和纯化。

灌流可在整个肝脏体内^{2,20,21,22,23}条件下进行，也可在分离的肝叶上进行²⁴。出于操作便利性考虑，分离肝叶的灌流通常仅限于左叶和中叶。理论上，由于使用了包含所有肝叶的完整肝脏，体内灌流应能获得更多的原代肝细胞。在灌流过程中保持肝脏原位，也可能减少细胞死亡，因为在此步骤期间，体内的肝细胞可始终浸润于液体（血液或灌流缓冲液）中。

维持无菌条件在此步.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12孔板	FALCON	353043	无需包被
6孔板	FALCON	353046	无需包被
抗AKT抗体	Cell Signaling	2920S
抗生素-抗真菌溶液（100倍浓度，稳定型）	Sigma-Aldrich	A5955
抗FOXO1抗体	Cell Signaling	97635S
抗GAPDH抗体	Cell Signaling	2118S
抗p-AKT（S473）抗体	Cell Signaling	9271L
抗PEPCK抗体	Santa Cruz	SC-166778
抗p-FOXO1（S256）抗体	Cell Signaling	84192S
细胞滤筛，70 µm	CELLTREAT	229483
封闭式静脉导管，24号，0.75英寸	Becton Dickinson	383511
DMEM（无葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红）	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom葡萄糖检测试剂盒	BioAssay Systems	EBGL-100
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30071.03
佛司可林（Forskolin）	MilliporeSigma	F3917-10MG
胰高血糖素	Sigma-Aldrich	G2044
山羊抗小鼠IgG二抗	LI-COR	926-68070
山羊抗兔IgG二抗	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
肝细胞洗涤培养基	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
胰岛素	Lilly	NDC 0002-8215-01
盐酸氯胺酮（100 mg/mL）	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
肝脏消化液	Gibco	17703-034	在超净台中分装至50 mL离心管中，每管25 mL，置于-20 °C冰箱保存
肝脏灌注液	Gibco	17701-038
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
蠕动泵	Gilson	Minipuls 2	可实现4 mL/min的流速
培养皿	Fisherbrand	08-757-12
冷冻离心机	Sorvall	Legend RT	可在4 °C条件下离心50 mL离心管
L-乳酸钠	Sigma-Aldrich	L7022
丙酮酸钠	Gibco	11360070
注射器滤器，PVDF膜，0.45 µm，直径30 mm	CELLTREAT	229745
注射器，0.5 mL	Becton Dickinson	329461
注射器，60 mL	Becton Dickinson	309653
台盼蓝溶液，0.4%	Gibco	15250061
离心管，15 mL	Corning	430052
离心管，50 mL	Corning	430290
水浴槽	Corning	CLS6783	或任何可加热至45 °C的水浴槽
William’s E培养基（含GlutaMAX补充剂）	Gibco	32551020
赛拉嗪（Xylozine，100 mg/mL）	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10