一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案

Summary

原代肝细胞是 研究体外肝脏反应和新陈代谢的宝贵工具。利用市售试剂，开发了一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案。

Abstract

原代肝细胞广泛用于肝脏 体外 研究，特别是在葡萄糖代谢研究中。根据不同的需求（如时间、人工、成本和原代肝细胞使用）对基本技术进行了调整，从而产生了各种原发性肝细胞分离方案。然而，原代肝细胞分离中的众多步骤和耗时的试剂制备是效率的主要缺点。在比较了不同方案的优缺点后，综合了每种方案的优点，并制定了快速有效的原代肝细胞分离方案。 在短短约35分钟内，该方案可以产生与其他方案一样多（如果不是更多）的健康原代肝细胞。此外，使用分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验验证了该方案 在体外 肝脏代谢研究中的有用性。我们还广泛回顾和分析了本研究每个步骤的意义和目的，以便未来的研究人员可以根据需要进一步优化该协议。

Introduction

肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一，因为它在食物消化，血液循环和解毒等许多生命支持功能中起着至关重要的作用。小鼠原代肝细胞 在体外 培养中的应用在碳水化合物代谢和肝癌的研究中越来越受欢迎。因此，在维持其先天生理功能的同时，开发一种方便的小鼠原代肝细胞分离方法非常重要。由于其作为葡萄糖代谢中心的功能，肝脏也是葡萄糖产生和储存的核心¹。在 体外 进行原代肝细胞实验是大多数葡萄糖代谢研究的必要条件。因此，多年来，各种研究小组已经制定了小鼠原代肝细胞分离方案。

小鼠肝细胞分离的一般程序是首先用等渗液体（如磷酸盐缓冲盐水（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS）冲洗肝脏中的血液，然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些实验方案共享一般程序，但根据不同的需求，试剂和步骤不同。然而，制备所需的试剂和执行分离步骤需要时间。在开发本方案时，效率被确定为优先事项，所有试剂都是即用型的，可以从市场上获得，并且步骤尽可能少。该协议的总体目标是提供一种快速且劳动高效的方法，以从小鼠中分离原代肝细胞，而不会危及分离的原代肝细胞纯度和活力。

....

Protocol

所有程序均由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用C57BL / 6雌性小鼠（8周龄）。

1. 准备工作:

1. 将William's E培养基（GlutaMAX补充剂）与10%FBS和1%抗生素抗真菌剂溶液混合，制成培养基。
2. 通过0.45μm注射器过滤器过滤25mL胶原酶 - 分散酶培养基（例如，肝脏消化培养基），以除去颗粒碎片。
3. 将50 mL双蒸馏H₂O（ddH₂O），35mL灌注培养基（例如，肝脏灌注培养基）（或首次使用该方案时为50mL）和25mL过滤的胶原酶 - 分散酶培养基在45°C水浴中加热30分钟。
4. 在无菌组织培养罩内，将2 mL 10x HBSS和18 mL Percoll混合在50 mL管中，制成20 mL 1x Percoll-HBSS并保持在冰上或4°C。
   注意:1x Percoll-HBSS可以在4°C下保持至少6个月。
5. 在无菌组织培养罩内，将30mL洗涤培养基（例如肝细胞洗涤培养基）倒入干净的培养皿中，并保持在冰上。
6. 将泵送管浸入45°C水浴的水中。如果室温为25°C，则结果最可靠。
7. 通过混合225μL氯胺酮盐酸盐，93.75μL木拉嗪和1681μL1x PBS制备2mL1x麻醉剂。
8. 使用批准的方法麻....

Results

为了测试效率，在8周龄雌性C57BL / 6小鼠上进行了本原代肝细胞分离方案。测试分离的原代肝细胞的附着性和纯度。原发性肝细胞分离用于肝脏生理学的各种实验，例如肝脏药物效应和葡萄糖代谢，药物生物标志物活性²，胰岛素敏感性和葡萄糖产生。因此，在以下实验中测试了用该方案分离的原代肝细胞的活性。

在本方案中，原发性肝细胞附着不需要包衣
将分离的原代肝细胞以5×10⁵ 个细胞/孔接种在6孔板上。1 h后，观察到牢固的附着，并且原代肝细胞在接种后12 h完全膨胀（图3）。这表明接种后12小时，细胞已准备好用于实验。基于肝脏内小鼠肝细胞的细胞核形态，单核肝细胞在边界富集，而双核/多核肝细胞（终末分化的特征）位于中间^3，4。大量成像的细胞显示出典型的双核（二倍体）形态，表明分离和纯化活原代肝细胞的成功。这也表明胶.......

Discussion

已经开发了各种原发性肝细胞分离方案。它们还根据不同的需求进行了优化和调整（表1）。分离方案通常由两部分组成:灌注（包括酶消化）和纯化。

灌注可以与整个肝脏在体内^{2，20，21，22，23}或解剖的肝叶²⁴中进行。为了便于技术操作，解剖裂叶的灌注通常局限于左叶和中等波瓣。从理论上讲，由于使用整个肝脏的所有肺叶，体内灌注应产生更多的原代肝细胞。在灌注期间保持肝脏到位也可以减少细胞死亡，因为在这个步骤中，体内的肝细胞可以始终沐浴在液体中，无论是血液还是灌注缓冲液。

无菌条件的维持.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12 孔板	FALCON	353043	无需涂层
6 孔板	FALCON	353046	涂层无需
抗 AKT	细胞信号传导	2920S
抗生素抗真菌溶液 （100x），稳定	Sigma-Aldrich	A5955
抗 FOXO1	细胞信号转导	97635S
抗 GAPDH	细胞信号转导	2118S
抗 p-AKT （S473）	细胞信号转导	9271L
抗 PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
抗 p-FOXO1 （S256）	细胞信号转导	84192S
细胞过滤器， 70&微;m	CELLTREAT	229483
封闭式静脉导管，24 号 0.75 英寸	Becton Dickinson	383511
DMEM，无葡萄糖，无谷氨酰胺，无酚红	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom 葡萄糖检测试剂盒	BioAssay Systems	EBGL-100
胎牛血清 （FBS）	Hyclone	SH30071.03
毛喉素	MilliporeSigma	F3917-10MG
胰高血糖素	Sigma-Aldrich	G2044
山羊抗小鼠 IgG 二抗	LI-COR	926-68070
山羊抗兔 IgG 二抗	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad 软件	NA
肝细胞洗涤培养基	Gibco	17704-024
IBMX	细胞信号转导	13630S
礼来	胰岛素	NDC 0002-8215-01
盐酸氯胺酮 （100 mg/mL）	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
肝消化培养基	Gibco	17703-034	在组织培养通风橱内分装至 50 mL 试管中各 25 mL，并保持在 -20 °C;C 冷冻机
肝脏灌注培养基	Gibco	17701-038
笔式链球菌	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
蠕动泵	Gilson	Minipuls 2	能够以 4 mL/min 的速度泵送
培养皿	Fisherbrand	08-757-12
冷冻离心机	Sorvall	Legend RT	能够在 4 &°g 下离心 50 mL 试管;C
L-乳酸钠	Sigma-Aldrich	L7022
丙酮酸钠	Gibco	11360070
针式过滤器，PVDF 0.45 和微量;m 30 mm 直径	CELLTREAT	229745
针、0.5 mL	Becton Dickinson	329461
针、60 mL	Becton Dickinson	309653
台盼蓝溶液、0.4%	Gibco	15250061
管、15 mL	康宁	430052
管、50 mL	康宁	430290
水浴缸	康宁	CLS6783	或任何能够加热到 45 °C
威廉s E 培养基（GlutaMAX 补充剂）	Gibco	32551020
二苯嗪 （100 mg/mL）	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10