原代肝细胞是研究肝脏反应和代谢的有力工具 体外利用市售试剂，开发出一种改进的小鼠原代肝细胞分离方案，该方案更加节省时间和劳动力。
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本文内容
摘要
摘要
原代肝细胞被广泛用于肝脏研究 体外 研究，尤其是在葡萄糖代谢研究中具有重要意义。根据不同需求（如时间、人力、成本和原代肝细胞的使用）对基础技术进行了调整，从而产生了多种原代肝细胞分离方案。然而，原代肝细胞分离过程中步骤繁多以及耗时的试剂配制，严重影响了实验效率。在比较了不同方案的优缺点后，整合各方案的优势，建立了一种快速高效的原代肝细胞分离方案。该方案仅需约35分钟，即可获得与其它方法相当甚至更多的健康原代肝细胞。利用所分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验，进一步验证了该方案在相关研究中的实用性 体外 肝脏代谢研究。我们还全面回顾和分析了本研究中每一步骤的意义与目的，以便未来的研究人员能够根据需要进一步优化该方案。
引言
肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一，因其在食物消化、血液循环和解毒等多种维持生命的功能中发挥关键作用。小鼠原代肝细胞的应用 体外 培养在碳水化合物代谢和肝细胞癌研究中日益受到关注。因此，建立一种简便的小鼠原代肝细胞分离方法，同时维持其固有的生理功能，显得尤为重要。由于肝脏在葡萄糖代谢中发挥枢纽作用，它在葡萄糖的生成与储存过程中也处于核心地位1原代肝细胞实验 体外 是大多数葡萄糖代谢研究中必不可少的。因此，多年来，多个研究团队已开发出多种小鼠原代肝细胞分离方案。
小鼠肝细胞分离的一般步骤是首先使用等渗液体（如磷酸盐缓冲液（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS））灌注肝脏以清除血液，然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些方案具有相似的总体流程，但根据不同的实验需求，在试剂和具体步骤上有所差异。然而，配制所需试剂并执行分离过程通常耗时较长。在制定本方案时，效率被列为首要目标，所有试剂均为市售即用型，且操作步骤尽可能简化。本方案的总体目标是提供一种快速、省力的小鼠原代肝细胞分离方法，同时不损害所分离原代肝细胞的纯度和活性。
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方案
所有实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用8周龄C57BL/6雌性小鼠。
1. 准备：
- 将 William's E 培养基（含 GlutaMAX 补充剂）与 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌素溶液混合，配制成培养液。
- 将25 mL胶原酶-分散酶培养基（例如，Liver Digest Medium）通过0.45 µm注射器滤器过滤，以去除颗粒碎片。
- 将50 mL双蒸水加热2O (ddH₂O)2O）、35 mL 灌注培养基（例如 Liver Perfusion Medium）（首次使用本方案时为 50 mL）以及 25 mL 过滤的胶原酶-分散酶培养基，置于 45 °C 水浴中预热 30 分钟。
- 在无菌细胞培养操作台内，将 2 mL 10x HBSS 与 18 mL Percoll 混合于 50 mL 离心管中，配制成 20 mL 1x Percoll-HBSS，置于冰上或 4 °C 保存。
注意：1x Percoll-HBSS 可在 4 °C 保存至少 6 个月。 - 在无菌细胞培养操作台内，将30 mL洗涤液（例如，肝细胞洗涤液）倒入洁净的培养皿中，并置于冰上保存。
- 将泵管浸入45 °C水浴的水中。若室温为25 °C，结果最为可靠。
- 通过混合225 µL盐酸氯胺酮、93.75 µL赛拉嗪和1681 µL 1x PBS，配制2 mL 1x麻醉剂。
- 使用批准的方法麻醉一只小鼠。此处采用腹腔注射150 µL 1x麻醉剂。通过检测反射消失（如脚趾夹捏反应）以确认小鼠已完全麻醉。
- 将小鼠仰卧固定在解剖垫上，四肢可用大头针、防水胶带或其他机构动物护理与使用委员会（或同等机构）批准的方法固定。
- 准备无菌的镊子和剪刀用于解剖。为避免可能的污染，所有步骤均应在无菌操作台内进行。
2. 实验步骤：
- 使用蠕动泵，以 4 mL/min 的速度泵入预热的 ddH2O，持续 5 分钟。将泵管从水中更换为预热的灌注培养基。
- 用 70% 乙醇对麻醉小鼠的腹部进行消毒，用剪刀剪开腹腔，暴露肝脏、门静脉和下腔静脉（IVC）。
- 停止蠕动泵。将一根 24 G 导管（例如：封闭式静脉导管，24 G，0.75 英寸）插入下腔静脉（IVC）。启动泵液，并剪开门静脉。
- 继续泵液，直至流出液体变澄清（约 3–5 分钟）。每隔一分钟按压一次门静脉，使液体流经肝脏各个区域。注意避免气泡进入下腔静脉。
注意：此步骤旨在尽可能将肝脏中的血液冲洗干净。 - 将泵管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。在执行步骤 2.6 的同时，继续泵液，直至 25 mL 胶原酶-分散酶培养基完全注入。
- 每隔一分钟按压一次门静脉，使液体流经肝脏各个区域。
注意：在此阶段，小鼠若完全失血将导致死亡。实验结束后可通过心跳是否停止确认小鼠死亡。按照机构规定妥善处理尸体。 - 将不含胆囊的完整肝脏分离，并转移至冰上培养皿中的 30 mL 清洗培养基中。
- 用镊子将肝脏撕成小块，使原代肝细胞释放到溶液中。此步骤会使清洗培养基变为浑浊的溶液，其中含有大量释放的原代肝细胞和细小肝组织碎片。
- 将步骤 2.8 中的浑浊溶液通过 70 µm 细胞筛过滤，收集至冰上 50 mL 离心管内的 20 mL 1× Percoll-HBSS 溶液中。轻轻倒置离心管 20 次以混匀。
- 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟。
- 在组织培养超净台内，吸除上清液。用 30 mL 冷的清洗培养基重悬沉淀。
- 在 4 °C 条件下，以 50 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，在组织培养超净台内用 25 mL 培养基（或其他适当体积）重悬沉淀。
- 计数细胞数量，并根据实验设计将细胞接种至所需的培养板中。
注意：从一只 8 周龄小鼠中成功分离的原代肝细胞，通常足以接种于四个 6 孔板或四个 12 孔板。
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结果
为了检测效率，本研究采用8周龄雌性C57BL/6小鼠进行了当前的原代肝细胞分离方案。检测了分离所得原代肝细胞的贴壁能力与纯度。原代肝细胞分离广泛应用于肝脏生理学相关的多种实验，如肝脏药物效应、葡萄糖代谢、药物生物标志物活性2、胰岛素敏感性以及葡萄糖生成等。因此，本研究通过以下实验检测了采用该方案分离得到的原代肝细胞的活性。
本方案中，原代肝细胞贴壁无需包被处理
分离得到的原代肝细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中。接种 1 小时后观察到细胞已牢固贴附，并在接种后 12 小时完全铺展（图 3）。这表明接种 12 小时后，细胞已准备好用于后续实验。根据小鼠肝组织内肝细胞的细胞核形态特征，单核肝细胞多分布于边缘区域，而双核或多核肝细胞（终末分化的标志）则主要位于中央区域3,4。显微...
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讨论
已开发出多种原代肝细胞分离方案，并根据不同需求持续优化和调整（表1）。分离方案通常包括两个部分：灌注（含酶消化）和纯化。
灌流可在整个肝脏体内2,20,21,22,23条件下进行，也可在分离的肝叶上进行24。出于操作便利性考虑，分离肝叶的灌流通常仅限于左叶和中叶。理论上，由于使用了包含所有肝叶的完整肝脏，体内灌流应能获得更多的原代肝细胞。在灌流过程中保持肝脏原位，也可能减少细胞死亡，因为在此步骤期间，体内的肝细胞可始终浸润于液体（血液或灌流缓冲液）中。
维持无菌条件在此步...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（资助号：5R01HD095512-02，授予 S.W.）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 10x HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| 12孔板 | FALCON | 353043 | 无需包被 |
| 6孔板 | FALCON | 353046 | 无需包被 |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling | 2920S | |
| 抗生素-抗真菌溶液（100倍浓度，稳定型） | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| 抗FOXO1抗体 | Cell Signaling | 97635S | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling | 2118S | |
| 抗p-AKT（S473）抗体 | Cell Signaling | 9271L | |
| 抗PEPCK抗体 | Santa Cruz | SC-166778 | |
| 抗p-FOXO1（S256）抗体 | Cell Signaling | 84192S | |
| 细胞滤筛，70 µm | CELLTREAT | 229483 | |
| 封闭式静脉导管，24号，0.75英寸 | Becton Dickinson | 383511 | |
| DMEM（无葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红） | ThermoFisher Scientific | A1443001 | |
| EnzyChrom葡萄糖检测试剂盒 | BioAssay Systems | EBGL-100 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30071.03 | |
| 佛司可林（Forskolin） | MilliporeSigma | F3917-10MG | |
| 胰高血糖素 | Sigma-Aldrich | G2044 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | LI-COR | 926-68070 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR | 926-32211 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | NA | |
| 肝细胞洗涤培养基 | Gibco | 17704-024 | |
| IBMX | Cell Signaling | 13630S | |
| 胰岛素 | Lilly | NDC 0002-8215-01 | |
| 盐酸氯胺酮（100 mg/mL） | Hospira Inc | NDC 0409-2051-05 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 肝脏消化液 | Gibco | 17703-034 | 在超净台中分装至50 mL离心管中，每管25 mL，置于-20 °C冰箱保存 |
| 肝脏灌注液 | Gibco | 17701-038 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen Strep） | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 蠕动泵 | Gilson | Minipuls 2 | 可实现4 mL/min的流速 |
| 培养皿 | Fisherbrand | 08-757-12 | |
| 冷冻离心机 | Sorvall | Legend RT | 可在4 °C条件下离心50 mL离心管 |
| L-乳酸钠 | Sigma-Aldrich | L7022 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360070 | |
| 注射器滤器，PVDF膜，0.45 µm，直径30 mm | CELLTREAT | 229745 | |
| 注射器，0.5 mL | Becton Dickinson | 329461 | |
| 注射器，60 mL | Becton Dickinson | 309653 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15250061 | |
| 离心管，15 mL | Corning | 430052 | |
| 离心管，50 mL | Corning | 430290 | |
| 水浴槽 | Corning | CLS6783 | 或任何可加热至45 °C的水浴槽 |
| William’s E培养基（含GlutaMAX补充剂） | Gibco | 32551020 | |
| 赛拉嗪（Xylozine，100 mg/mL） | Vetone Anased LA | NDC13985-704-10 |
参考文献
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