一种简易的干切法获取整粒种子大小的树脂切片及其应用

摘要

该技术可快速、简便地制备整粒种子大小的树脂切片，用于观察和分析种子不同区域的细胞、淀粉粒和蛋白体。

摘要

细胞、淀粉粒 和蛋白体在种子中的形态、大小和数量决定了种子的重量和品质。它们在种子不同区域之间存在显著差异。为了清晰观察细胞、淀粉粒和蛋白体的形态，并准确地对其形态参数进行定量分析，需要制备贯穿整个种子尺寸的切片。尽管全种子尺寸的石蜡切片可用于研究种子中贮藏物质的积累情况，但由于切片较厚，分辨率较低，难以对细胞和贮藏物质的形态参数进行定量分析。树脂薄切片具有高分辨率，但常规树脂切片方法不适用于制备体积较大、淀粉含量高的成熟种子的全种子尺寸切片。本研究介绍了一种简便的干法切片技术，用于制备全种子尺寸的树脂切片。该技术可用于制备发育中、成熟、萌发及煮熟的种子在LR White树脂包埋后的横切和纵切全种子尺寸切片，即使对于淀粉含量高、体积大的种子也同样适用。全种子尺寸切片可用荧光增白剂28、碘和考马斯亮蓝R250分别特异性染色，以清晰显示细胞、淀粉粒和蛋白体的形态。所获得的图像还可进行定量分析，以展示种子不同区域中细胞、淀粉粒和蛋白体的形态参数。

引言

植物种子含有淀粉和蛋白质等贮藏物质，为人类提供能量和营养。细胞及贮藏物质的形状、大小和数量决定了种子的重量和品质。种子不同区域的细胞和贮藏物质具有显著不同的形态，尤其对于一些因抑制淀粉分支酶IIb而具有高直链淀粉含量的谷类作物而言更是如此^1,2,3。因此，研究种子不同区域中细胞和贮藏物质的形态具有重要意义。

石蜡切片是一种制备全种子尺寸切片的良好方法，能够展示种子的组织结构以及种子不同区域中贮藏物质的积累情况^4,5,6。然而，石蜡切片通常厚度为6–8 µm，分辨率较低，因此很难清晰观察并定量分析细胞和贮藏物质的形态。树脂切片通常厚度为1–2 µm，分辨率高，非常适合用于观察和分析细胞及贮藏物质的形态⁷。但常规树脂切片方法在制备全种子尺寸切片方面存在困难，尤其是对于体积较大且淀粉含量较高的种子，因此无法实现对种子不同区域中细胞和贮藏物质形态的观察与分析。LR White树脂是一种丙烯酸树脂，具有低黏度和强渗透性，因而适用于种子树脂切片的制备，特别是适用于体积大、淀粉含量高的谷类成熟籽粒。此外，包埋在LR White树脂中的样品可方便地使用多种化学染料进行染色，从而在光学显微镜或荧光显微镜下清晰显示细胞和贮藏物质的形态⁷。在我们之前的研究论文中，已报道了一种用于制备包埋于LR White树脂中的谷类成熟籽粒全种子尺寸切片的干法切片技术。该方法也可用于制备发育中、萌发后及煮熟的谷类籽粒的全种子尺寸切片⁸。所获得的全种子尺寸切片在微观形态学观察与分析方面具有广泛应用，尤其适用于清晰观察并定量分析种子不同区域中细胞和贮藏物质形态的差异^8,9。

该技术适用于希望利用光学显微镜观察组织微结构以及种子不同区域中细胞、淀粉粒和蛋白体的形态与大小的研究人员。通过对特异性染色的全籽粒大小切片进行成像，可使用形态学分析软件对种子不同区域中细胞、淀粉粒和蛋白体的形态参数进行定量测量。为展示该技术的适用性及全籽粒切片的应用效果，本研究考察了玉米和油菜的成熟种子，以及水稻的发育中、萌发和煮熟的籽粒。本实验方案包含四个步骤。此处以成熟玉米籽粒为例，因其体积大、淀粉含量高，是制备全籽粒大小切片最具挑战性的材料，用于逐步展示各操作流程。

方案

1. 树脂包埋种子的制备（图1）

1. 将六粒玉米成熟籽粒置于10 mL 2.5%磷酸盐缓冲戊二醛（0.1 M，pH 7.2）中，在4 °C下固定48小时。研究人员可根据研究目的和组织类型选择其他固定液组合、固定液浓度及固定条件。
2. 取出籽粒，用锋利的双面刀片将其纵向或横向切成2–3 mm厚的切片，再置于10 mL 2.5%磷酸盐缓冲戊二醛（0.1 M，pH 7.2）中，继续固定48小时。
3. 用10 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.2）清洗样品三次，每次30分钟。
4. 用10 mL乙醇水溶液逐步进行脱水处理，依次为30%、50%、70%、90%各一次，100%三次，每次30分钟。
5. 在4 °C条件下，用10 mL LR White树脂乙醇稀释液逐步渗透样品，浓度依次为25%、50%、75%各一次，100%两次，每次12小时。
6. 包埋前准备样品底座。向2 mL离心管中加入0.25 mL 100% LR White树脂，在60 °C下聚合48小时。
7. 将纯LR White树脂（0.5 mL）和已渗透的样品依次加入带有底座的离心管中，用解剖针将样品摆正，然后在60 °C烘箱中聚合48小时。

2. 用于制备整粒种子大小切片的干切法（图1）

1. 从离心管中取出包埋的样品，用锋利的刀片切去样品周围多余的树脂。
2. 将树脂块固定在超薄切片机（EM UC7）的样品夹上，用刀片切去样品表面及周围的多余树脂。
3. 使用玻璃刀精细修平样品表面，直至能够形成完整的切片。
4. 在切片前，于刀刃上方约2 mm处放置一个小铜钩，将样品切成2 µm厚的切片。铜钩的作用是防止切片向上卷曲。
5. 当切片变长时，将铜钩置于切片下方以支撑切片。
6. 在未处理的载玻片上加入100 µL水，用镊子小心地将完整且无破损的切片转移至水中。
7. 为展平皱褶的切片，将样品在50 °C的展片台上加热并干燥过夜。
   1. 若切片碎裂或撕裂，可将每次树脂浸透样品的时间从12 h延长至24 h或48 h。
   2. 若切片出现与刀刃平行的条纹，请将样品块夹紧；若出现与刀刃垂直的条纹，请更换新刀片。

3. 切片的染色与观察

注意：为了观察细胞、淀粉粒和蛋白质体的组织结构与形态，应根据研究目的使用特定染色剂对切片进行染色。此处，我们分别使用荧光增白剂28、碘液和考马斯亮蓝R250对细胞壁、淀粉粒和蛋白质体进行染色。

1. 为观察细胞形态，将切片置于70 mL密闭玻璃染色瓶中，加入40 mL 0.1% (w/v) 荧光增白剂28水溶液，在45 °C下染色10分钟，然后用流水冲洗5分钟。使用配备CCD相机的荧光显微镜观察并拍照。
2. 为观察淀粉粒形态，将切片用40 µL碘溶液（含0.07% (w/v) I₂ 和0.14% (w/v) KI 的25% (v/v) 甘油溶液）染色1分钟，并用盖玻片覆盖含碘溶液的样品。使用配备CCD相机的光学显微镜观察并拍照。
3. 为观察蛋白体形态，将切片置于70 mL密闭玻璃染色瓶中，加入40 mL 10% (v/v) 乙酸溶液，在45 °C下浸泡10分钟，随后在45 °C下用40 mL 含1% (w/v) 考马斯亮蓝R250、25% (v/v) 异丙醇和10% (v/v) 乙酸的溶液染色15分钟。染色后的切片用流水洗涤5分钟，并干燥。使用配备CCD相机的光学显微镜观察并拍照。

4. 形态参数的定量分析

1. 使用形态学分析软件（Image-Pro Plus 6.0 软件），按照 Zhao 等人⁹ 的实验步骤，对种子不同区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白体的显微图像进行处理，并定量分析其面积、长/短轴及圆形度。

结果

一种简便的干法切片技术以获得全种子尺寸的切片
我们建立了一种简便的干法切片方法，用于制备包埋在LR-white树脂中的种子的全种子尺寸切片（图1）。该方法可制备厚度为2 µm的横切和纵切全种子尺寸切片（图2-5，补充图1-4）。例如，油菜的成熟种子可进行横切和纵切（图2）。对于谷类作物，其成熟籽粒富含淀粉粒，导致制备全种子尺寸切片极为困难。采用本技术，也可成功制备大体积的成熟玉米籽粒的横切和纵切全种子尺寸切片（图4，补充图1）。此外，水稻的发育中籽粒（补充图2）、萌发籽粒（补充图3）以及煮熟籽粒（补充图4）均可利用该方法进行研究。

讨论

种子是食品、饲料和工业原料最重要的可再生资源，富含淀粉和蛋白质等贮藏物质。细胞的形态与数量以及贮藏物质的含量和构型均影响种子的重量和品质^7,12。尽管体视学和图像分析技术可用于测量组织区域内细胞的大小和数量，但这些技术在许多实验室中仍较为缺乏。石蜡切片和树脂切片仅能提供二维（2D）图像，无法用于分析细胞的真实大小和数量。然而，由于细胞在任意平面上被随机切割，通过统计至少三个不同组织区域切片中大量细胞（超过100个）的平均值，可反映细胞的二维形态参数（如长度、宽度和面积），而所选区域面积与平均细胞面积的比值则可反映细胞数量。因此，原位观察和分析种子不同区域中细胞及贮藏物质的形态具有重要意义。石蜡切片最适合制备整粒种子大小的切片，尤其适用于大粒种子⁷。然而，随着种子发育，细胞中充满贮藏物质，导致从发育后期种子和成熟种子中获得高质量的整粒种子大小切片极为困难。此外，石蜡切片过厚，难以清晰展示细胞形态，仅适用于研究种子的组织结构⁷。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	生工生物（上海）有限公司	A501931
紧凑型玻璃染色缸（5位）	生工生物（上海）有限公司	E678013
考马斯亮蓝R-250	生工生物（上海）有限公司	A100472
盖玻片	生工生物（上海）有限公司	F518211
双面刀片	吉列上海有限公司	74-S
无水乙醇	生工生物（上海）有限公司	A500737
展片台	徕卡	HI1220
荧光显微镜	奥林巴斯	BX60
荧光增白剂28	Sigma-Aldrich	910090
玻璃条	徕卡	840031
50% 戊二醛水溶液	生工生物（上海）有限公司	A600875
甘油	生工生物（上海）有限公司	A600232
碘	生工生物（上海）有限公司	A500538
异丙醇	生工生物（上海）有限公司	A507048
光学显微镜	奥林巴斯	BX53
LR White 树脂	Agar Scientific	AGR1281A
烘箱	上海精宏实验设备有限公司	9023A
碘化钾	生工生物（上海）有限公司	A100512
载玻片	生工生物（上海）有限公司	F518101
镊子	生工生物（上海）有限公司	F519022
十二水合磷酸氢二钠	生工生物（上海）有限公司	A607793
二水合磷酸二氢钠	生工生物（上海）有限公司	A502805
超薄切片机	徕卡	EM UC7