该技术可快速、简便地制备整粒种子大小的树脂切片，用于观察和分析种子不同区域的细胞、淀粉粒和蛋白体。
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方法文章
一种简易的干切法获取整粒种子大小的树脂切片及其应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
细胞、淀粉粒 和蛋白体在种子中的形态、大小和数量决定了种子的重量和品质。它们在种子不同区域之间存在显著差异。为了清晰观察细胞、淀粉粒和蛋白体的形态，并准确地对其形态参数进行定量分析，需要制备贯穿整个种子尺寸的切片。尽管全种子尺寸的石蜡切片可用于研究种子中贮藏物质的积累情况，但由于切片较厚，分辨率较低，难以对细胞和贮藏物质的形态参数进行定量分析。树脂薄切片具有高分辨率，但常规树脂切片方法不适用于制备体积较大、淀粉含量高的成熟种子的全种子尺寸切片。本研究介绍了一种简便的干法切片技术，用于制备全种子尺寸的树脂切片。该技术可用于制备发育中、成熟、萌发及煮熟的种子在LR White树脂包埋后的横切和纵切全种子尺寸切片，即使对于淀粉含量高、体积大的种子也同样适用。全种子尺寸切片可用荧光增白剂28、碘和考马斯亮蓝R250分别特异性染色，以清晰显示细胞、淀粉粒和蛋白体的形态。所获得的图像还可进行定量分析，以展示种子不同区域中细胞、淀粉粒和蛋白体的形态参数。
引言
植物种子含有淀粉和蛋白质等贮藏物质，为人类提供能量和营养。细胞及贮藏物质的形状、大小和数量决定了种子的重量和品质。种子不同区域的细胞和贮藏物质具有显著不同的形态，尤其对于一些因抑制淀粉分支酶IIb而具有高直链淀粉含量的谷类作物而言更是如此1,2,3。因此，研究种子不同区域中细胞和贮藏物质的形态具有重要意义。
石蜡切片是一种制备全种子尺寸切片的良好方法，能够展示种子的组织结构以及种子不同区域中贮藏物质的积累情况4,5,6。然而，石蜡切片通常厚度为6–8 µm，分辨率较低，因此很难清晰观察并定量分析细胞和贮藏物质的形态。树脂切片通常厚度为1–2 µm，分辨率高，非常适合用于观察和分析细胞及贮藏物质的形态7。但常规树脂切片方法在制备全种子尺寸切片方面存在困难，尤其是对于体积较大且淀粉含量较高的种子，因此无法实现对种子不同区域中细胞和贮藏物质形态的观察与分析。LR White树脂是一种丙烯酸树脂，具有低黏度和强渗透性，因而适用于种子树脂切片的制备，特别是适用于体积大、....
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方案
1. 树脂包埋种子的制备（图1）
- 将六粒玉米成熟籽粒置于10 mL 2.5%磷酸盐缓冲戊二醛（0.1 M，pH 7.2）中，在4 °C下固定48小时。研究人员可根据研究目的和组织类型选择其他固定液组合、固定液浓度及固定条件。
- 取出籽粒，用锋利的双面刀片将其纵向或横向切成2–3 mm厚的切片，再置于10 mL 2.5%磷酸盐缓冲戊二醛（0.1 M，pH 7.2）中，继续固定48小时。
- 用10 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.2）清洗样品三次，每次30分钟。
- 用10 mL乙醇水溶液逐步进行脱水处理，依次为30%、50%、70%、90%各一次，100%三次，每次30分钟。
- 在4 °C条件下，用10 mL LR White树脂乙醇稀释液逐步渗透样品，浓度依次为25%、50%、75%各一次，100%两次，每次12小时。
- 包埋前准备样品底座。向2 mL离心管中加入0.25 mL 100% LR White树脂，在60 °C下聚合48小时。
- 将纯LR White树脂（0.5 mL）和已渗透的样品依次加入带有底座的离心管中，用解剖针将样品摆正，然后在60 °C烘箱中聚合48小时。
2. 用于制备整粒种子大小切片的干切法（图1）
- 从离心管中取出包埋的....
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结果
一种简便的干法切片技术以获得全种子尺寸的切片
我们建立了一种简便的干法切片方法，用于制备包埋在LR-white树脂中的种子的全种子尺寸切片（图1）。该方法可制备厚度为2 µm的横切和纵切全种子尺寸切片（图2-5，补充图1-4）。例如，油菜的成熟种子可进行横切和纵切（图2）。对于谷类作物，其成熟籽粒富含淀粉粒，因此制备全种子尺寸切片非常困难。采用本技术，也可成功制备大体积的成熟玉米籽粒的横切和纵切全种子尺寸切片（图4，补充图1）。此外，水稻的发育中籽粒（补充图2）、萌发籽粒（补充图3）以及煮熟籽粒（补充图4）均可利用该方法进行研究。
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讨论
种子是食品、饲料和工业原料最重要的可再生资源，富含淀粉和蛋白质等贮藏物质。细胞的形态与数量以及贮藏物质的含量和构型均影响种子的重量和品质7,12。尽管体视学和图像分析技术可用于测量组织区域内细胞的大小和数量，但这些技术在许多实验室中仍较为缺乏。石蜡切片和树脂切片仅能提供二维（2D）图像，无法用于分析细胞的真实大小和数量。然而，由于细胞在任意平面上被随机切割，通过统计至少三个不同组织区域切片中大量细胞（超过100个）的平均值，可反映细胞的二维形态参数（如长度、宽度和面积），而所选区域面积与平均细胞面积的比值则可反映细胞数量。因此，原位观察和分析种子不同区域中细胞及贮藏物质的形态具有重要意义。石蜡切片最适合制备整粒种子大小的切片，尤其适用于大粒种子7。然而，随着种子发育，细胞中充满贮藏物质，导致从发育后期种子和成熟种子中获得高质量的整粒种子大小切片极为困难。此外，石蜡切片过厚，难以清晰展示细胞形态，仅适用于研究种子的组织结构7。<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（32071927）、扬州大学人才项目以及江苏省高校优势学科建设工程资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | 生工生物（上海）有限公司 | A501931 | |
| 紧凑型玻璃染色缸（5位） | 生工生物（上海）有限公司 | E678013 | |
| 考马斯亮蓝R-250 | 生工生物（上海）有限公司 | A100472 | |
| 盖玻片 | 生工生物（上海）有限公司 | F518211 | |
| 双面刀片 | 吉列上海有限公司 | 74-S | |
| 无水乙醇 | 生工生物（上海）有限公司 | A500737 | |
| 展片台 | 徕卡 | HI1220 | |
| 荧光显微镜 | 奥林巴斯 | BX60 | |
| 荧光增白剂28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| 玻璃条 | 徕卡 | 840031 | |
| 50% 戊二醛水溶液 | 生工生物（上海）有限公司 | A600875 | |
| 甘油 | 生工生物（上海）有限公司 | A600232 | |
| 碘 | 生工生物（上海）有限公司 | A500538 | |
| 异丙醇 | 生工生物（上海）有限公司 | A507048 | |
| 光学显微镜 | 奥林巴斯 | BX53 | |
| LR White 树脂 | Agar Scientific | AGR1281A | |
| 烘箱 | 上海精宏实验设备有限公司 | 9023A | |
| 碘化钾 | 生工生物（上海）有限公司 | A100512 | |
| 载玻片 | 生工生物（上海）有限公司 | F518101 | |
| 镊子 | 生工生物（上海）有限公司 | F519022 | |
| 十二水合磷酸氢二钠 | 生工生物（上海）有限公司 | A607793 | |
| 二水合磷酸二氢钠 | 生工生物（上海）有限公司 | A502805 | |
| 超薄切片机 | 徕卡 | EM UC7 |
参考文献
- Cai, C., et al. Heterogeneous structure and spatial distribution in endosperm of high-amylose rice starch granules with different morphologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (41), 10143-10152 (2014).
- He, W., et al.
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重印与许可
