用于活细胞质膜分子扩散分析的斑点变异荧光相关光谱法

摘要

本文旨在介绍一种构建点变异荧光相关光谱（svFCS）显微镜的实验方案，用于测量活细胞质膜上分子的扩散行为。

摘要

活细胞中的动态生物学过程，包括与质膜结构相关的各种过程，发生在不同的空间和时间尺度上，分别从纳米到微米、微秒到分钟不等。如此广泛的生物学过程对传统的显微镜技术提出了挑战。本文详细描述了如何在一台经过定制的经典荧光显微镜上实施斑点变异荧光相关光谱（svFCS）测量的操作步骤。该方案包括svFCS系统特定的性能检测，以及在生理条件下利用svFCS对活细胞质膜上分子扩散进行测量的操作指南。此外，我们还提供了一种通过胆固醇氧化酶处理破坏质膜筏状纳米结构域的方法，并展示了svFCS分析如何揭示质膜侧向结构的这些变化。总之，这种基于荧光的方法能够以适当的空间和时间分辨率，前所未有地揭示质膜侧向组织的精细细节。

引言

质膜结构的复杂性
目前对细胞膜结构的理解需要考虑多个方面¹。首先，复杂的脂质组成不仅在不同细胞类型之间存在差异，即使在同一细胞内（如膜性细胞器与质膜之间）也各不相同。此外，膜相关或内在膜蛋白通常以动态的多聚体复合物形式存在，其大分子结构域延伸至膜外，所占面积显著大于仅由跨膜结构域所占据的区域。同时，膜相关蛋白表现出特异性的脂质结合或脂质相互作用能力，在调控蛋白质功能中发挥重要作用。这些作用直接依赖于局部脂质的组成及其可及性²。

最后，由于膜蛋白的内在不对称结构以及脂质的分布，细胞膜的两个脂双层之间表现出显著的不对称性。事实上，脂质合成与水解之间的代谢平衡，加上脂质在两个单层之间的翻转运动，导致了这种不对称分布。由于极性头部基团穿过膜的疏水内部需要克服较高的自由能障碍，任何跨双分子层的运输通常都需要特异性转运蛋白的协助。对于每种细胞类型而言，这种不对称性往往被严格维持。总体而言，这些因素共同导致了质膜的侧向不均一性或区室化^3,4。

通过考虑双分子层内部及跨双分子层的固有分子扩散，我们进一步丰富了质膜的这一表征。这种扩散导致了尺度在数十至数百纳米、时间在微秒至秒范围内的动态侧向异质性。例如，依赖脂质的膜纳米结构域——即所谓的脂筏，被定义为富含胆固醇和鞘脂类的信号平台——有助于质膜的空间区室化^5,6。然而，当前对膜结构的认识并不仅限于脂筏。膜纳米结构域在组成、来源和功能上更为复杂且具有异质性。尽管如此，这些结构域在质膜上的存在必须受到严密调控，而蛋白质与脂质之间的动态相互作用似乎在膜纳米结构域的空间分布和化学修饰过程中起着重要作用^1,3,7,8。

svFCS 原理及其在研究质膜组织结构中的应用
尽管在膜结构域分析方面已取得显著进展，主要得益于生物物理技术的发展，但对决定质膜局部组织特性的因素仍需在适当的空间和时间分辨率下进一步明确。基于单分子追踪的方法可提供优异的空间精度，并能表征多种运动模式^9,10,11,12，但在传统低相机帧率下时间分辨率有限，且需要更多的实验投入以获取足够数量的轨迹数据。另一种方法是通过光漂白后荧光恢复（FRAP）¹³ 或荧光相关光谱（FCS）¹⁴ 来评估膜组分的扩散系数。其中，FCS 受到更多关注，主要因其具有高灵敏度和选择性、显微检测体积小、侵扰性低以及宽广的动态范围¹⁵。

荧光相关光谱（FCS）的概念基础由Magde及其同事约50年前提出^16,17。该技术基于以高时间分辨率（从µs到s）记录荧光发射的波动¹⁸。在其现代版本中，通过将一个小的共聚焦激发体积（约0.3飞升）定位在感兴趣区域（例如质膜处）来进行活细胞内的测量；扩散中的荧光分子进出观测体积时产生的荧光信号以极高的时间分辨率被采集（即记录每个光子到达探测器的时间）。随后，对信号进行计算以生成自相关函数（ACF），从中可提取出分子在焦体积内停留的平均时间t_d（扩散时间），以及观测体积内存在的平均粒子数（N），后者与ACF的振幅成反比。最后一个参数可能提供有关观测体积内分子浓度的重要信息。

此后，得益于生物光子学领域仪器的快速发展，越来越多的FCS技术被实现，使得能够描述生命系统中发生的动态现象。然而，分子种类的扩散系数值分布往往更加重叠，通常表现为反常扩散特征，即分子的扩散与时间呈非线性关系¹⁹，并且难以阐明这种反常亚扩散的生物学意义。过去，这一难题通过在不同大小的区域而非单一区域进行FRAP分子扩散记录而得到一定程度的解决，从而提供了额外的空间信息。例如，这使得膜微区的概念得以建立^20,21,22。

将该策略应用于FCS测量（即所谓的焦点尺寸可变荧光相关光谱法，svFCS），通过改变观测焦点体积的大小，可在不同空间尺度上记录荧光强度的波动²³。因此，svFCS方法可提供间接的空间信息，用于识别和确定被研究分子的扩散模式以及膜区室化类型（孤立区室与连续区室²⁴）。通过绘制扩散时间t_d随由束腰（ω）值定义的不同空间尺度的变化关系，其中束腰值在此情况下对应检测光束的半径大小^23,25，即可表征特定分子在特定生理条件下的扩散规律。因此，svFCS在时间域中是单粒子追踪技术的理想对应方法²⁶。在布朗扩散约束下，扩散时间t_d与束腰ω之间应呈现严格的线性关系（图1）^23,25。偏离该线性关系的扩散规律可能源于多种非排他性因素，例如细胞骨架网格结构、分子拥挤效应、在纳米区室中的动态分区，或这些因素与其他效应的组合（图1），这些均需通过实验加以验证²⁵。

本文提供了从零开始自行搭建的定制化小体积荧光相关光谱（svFCS）光学系统在日常使用中所需的所有必要控制检查点，以补充我们此前关于该实验方法的协议综述^27,28。此外，作为概念验证，我们给出了该系统校准、细胞制备、数据采集与分析的操作指南，用于建立Thy1-GFP（一种定位于脂筏纳米结构域的质膜糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白）的svFCS扩散定律（DL）²⁹。最后，我们展示了通过胆固醇氧化酶处理部分破坏脂筏纳米结构域后，Thy1-GFP扩散特性所发生的变化。另外，从零开始构建svFCS系统的详细说明见于补充材料中。

方案

1. 组装定制svFCS装置的设定规范

注意：所提出的svFCS装置结构简单，便于以低成本实现便捷的安装、操作和维护，同时确保光子回收的高效性。更多细节请参见补充材料。

1. 实验环境与安全
   1. 将系统安装在温度稳定在约 21 °C 的房间内。
   2. 避免气流直接吹拂被动（或主动）光学平台，并遵守激光安全规则进行光路准直。
2. 硬件与软件
   注意：补充材料 详细说明了 图2 中所示的安装步骤。
   1. 使用 LabVIEW 编写主要的数据采集与控制软件，采用状态机与事件结构架构，其中多功能数据采集板驱动大多数控制器。
      注意：相关器、激光器和功率计由其各自的软件进行控制或监测。
   2. 根据所使用的硬件调整硬件和软件的安装流程。
3. 光学装置
   注意：图3 展示了在后续部分中用于控制光路准直质量的光学平台模块。所有光学元件的规格均列于材料表中。补充材料 中对搭建该装置的步骤进行了详尽描述。该系统包括一台连续波激光器、一台配备浸水物镜的电动倒置显微镜、一个与单光子计数模块耦合的雪崩光电二极管探测器，以及一个硬件相关器。为活细胞实验专门设计了一个带有无振动加热器的显微镜培养舱，用于精确控温。按照惯例，XY 轴对应于光路的垂直平面，Z 轴对应于光路方向。

2. 实验运行前每日检查点

1. 控制激发光路（图3， & ）。
   1. 打开所有虹膜光阑。
   2. 使用功率计测量激光功率，同时保持第一个虹膜光阑完全打开。
   3. 旋转半波片（HWP）以找到最大功率。
   4. 如果激光功率低于正常值，使用虹膜光阑检查光路对准情况，并在必要时交替调节L1和M1。
   5. 在实验记录本中记录功率数值。
2. 控制检测光路（图3， & ）。
   1. 在物镜上放置水、盖玻片以及一滴2 nM罗丹明6G（Rh6G）溶液。
   2. 如果荧光信号（由LabVIEW软件记录的APD计数）低于正常水平，重新配制Rh6G溶液，检查物镜上盖玻片的位置和编号，或清除可能存在的气泡。
      1. 如果荧光信号仍然偏低，将功率计置于光路中以阻断光束。
      2. 关闭APD（下文中APD指APD及其单光子计数模块）。
      3. 移除样品。
      4. 清洁物镜，并用反射靶替代物镜。
      5. 将功率计从光路中移出，检查反射靶上的激光光斑。确保光斑居中，且后向反射光到达光路中的第一个虹膜光阑 （图3）。
      6. 若未对准，使用M2调节中心位置，或使用二向色镜调节后向反射。
      7. 若显微镜耦合正确，将物镜推回原位，加入一滴水、一张盖玻片以及一滴更高浓度的Rh6G溶液（例如200 nM），并设置比常规测量更低的激光功率（几µW）。
      8. 打开APD，并在监控强度信号（LabVIEW软件）的同时，交替调节APD和针孔的XYZ调节螺丝，以优化对准。
      9. 更换盖玻片，并使用较低浓度的Rh6G（2 nM）。沿Z轴移动针孔，找到分子亮度比增加且束腰最小的位置。
      10. 逐渐关闭虹膜光阑直至信号下降：此时激光束尺寸已达到物镜后孔径尺寸（即最小束腰尺寸，见补充材料）。
      11. 启动相关器软件并记录数据（数据记录详见第7节）。
      12. 检查自相关函数（ACF），其应显示较低噪声、较小束腰尺寸以及较高的每分子每秒计数率（数据分析与束腰尺寸评估详见第7节）。

3. svFCS 数据采集与分析的一般注意事项

1. 按照以下通用方案记录和分析荧光数据（参见第7、8和9节）：（1）荧光信号记录与自相关函数（ACF）生成（使用相关器软件），（2）剔除异常数据，对保留的数据进行平均，并使用适当模型进行拟合（使用自主开发的Igor Pro软件），（3）扩散定律作图（使用自主开发的MATLAB软件1），以及（4）可选的扩散定律比较（使用自主开发的MATLAB软件2）。上述不同软件程序可根据要求提供。
   注意：硬件相关器的最小采样时间为12.5 ns（即采样频率为80 MHz）。其提供的时间分辨率至少比溶液中自由扩散小分子的典型停留时间低1,000倍，比膜蛋白在共聚焦观测体积内的扩散时间低10⁶倍。

4. 细胞培养与转染

1. 使用含5%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）和L-谷氨酰胺（1 mM）的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以每孔10,000个细胞的密度将Cos7细胞接种于底部为#1.0硼硅酸盐玻璃的8孔腔室盖玻片中。
2. 将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养24小时。
3. 移除培养基，每孔加入300 µL新鲜完全培养基，并在37 °C下预孵育细胞30分钟。
4. 将编码与eGFP²⁵融合的Thy-1蛋白的0.5 µg质粒DNA溶于50 µL无血清DMEM中，短暂涡旋混匀。
5. 将1.5 µL DNA转染试剂溶于50 µL无血清DMEM中，并充分混匀。
6. 将稀释后的转染试剂直接加入已准备好的DNA溶液中，并立即混合各组分。
7. 将配制好的混合物在室温下孵育10至15分钟。
8. 将10 µL DNA/转染试剂复合物逐滴加入各孔培养基中，并通过轻轻摇动培养板使其均匀分布。
9. 将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。
10. 孵育结束后，弃去含DNA/转染试剂复合物的培养基，每孔更换为400 µL新鲜完全DMEM，并在进行svFCS实验前继续培养16小时。

5. 用于 svFCS 测量的细胞准备

1. 移除培养基。
2. 用不含血清、含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）缓冲液轻轻洗涤细胞两到三次，该缓冲液需添加 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 值为 7.4（HBSS/HEPES）。
3. 在所有 svFCS 采集过程中，始终将细胞维持在 HBSS/HEPES 缓冲液中。

6. 药理学治疗

1. 移除培养基，用添加了10 mM HEPES（pH 7.4）的无血清HBSS溶液洗涤细胞两到三次（HBSS/HEPES）。
2. 在37 °C条件下，用含1 U/mL胆固醇氧化酶（COase）的HBSS/HEPES缓冲液孵育细胞1小时。
3. 移除溶液后，在进行svFCS测量时，维持细胞处于含0.1 U/mL COase的HBSS/HEPES缓冲液中。

7. 光斑尺寸校准

1. 将显微镜腔室预热至 37 °C。
2. 通过逐级稀释制备 2 nM 的 Rh6G 标准溶液。
3. 在置于水浸物镜上的玻璃盖玻片上滴加 200 µL 的 2 nM Rh6G 溶液。
4. 启动所有硬件和软件。
5. 将 488 nm 激光束功率调节并测量至 300 µW。根据所用荧光探针的亮度和光稳定性，依据以下三点调整该功率：(1) LabVIEW 软件上的荧光强度应保持稳定；(2) 相关器软件上的 ACF 曲线形状应随时间保持恒定；(3) 拟合参数应显示较小的束腰尺寸和较高的每分子计数率（每分子每秒光子数，通常为每分子每秒数十至数百个光子）。
   注：ACF 的幅度（称为 G(0)）与分子数量（即荧光探针浓度）成反比。对于束腰尺寸校准，G(0) 是一个良好的质量控制候选参数。因此，相同浓度下每日测得的 G(0) 值应相近，因为它关联了束腰尺寸与浓度。在细胞测量中，由于 FCS 在低浓度下更准确，为获得合适的参数拟合结果，G(0) 应较高。
6. 使用 LabVIEW 软件设置 svFCS 的照明/检测显微镜端口。
7. 打开 APD。
8. 关闭虹彩光阑直至信号下降，以获得最小束腰尺寸；或为获得更大束腰尺寸而适当关闭光阑。
9. 使用相关器软件记录多个选定持续时间的 ACF（即一次运行），以提高统计重复性，通常进行 10 次运行，每次持续 20 秒。
10. 关闭 APD。
11. 使用 Igor Pro 软件检查并剔除因分子聚集体导致强烈波动的运行数据。此步骤需手动完成——在用户经过培训后，该操作应具有用户无关性。
12. 使用三维扩散模型对保留的 ACF 的平均值进行拟合。
13. 从拟合参数中提取平均扩散时间 ，并将其保存至“*.txt”文件中（文件格式由 Igor Pro 软件决定）。
14. 通过将平均荧光强度（从荧光轨迹中提取）除以分子数量（从 ACF 中提取），计算每分子每秒的计数率（一个良好的性能指标）。
    注：确保在相同采集参数下，该值每日均保持较高且稳定。
15. 已知 Rh6G 在 37 °C 水溶液中的扩散系数（D）和 （见 7.13），根据公式计算实验束腰尺寸 ω：。
16. 在绘制 FCS 扩散定律曲线或进行任何新的 svFCS 数据采集系列之前，对每次所需的束腰尺寸调整均应用此流程。

8. 细胞上的svFCS数据采集

1. 测量并调节488 nm激光束功率至2至4 µW之间。根据所用荧光探针的亮度和光稳定性，调整该功率以实现每分子较高的计数率（通常为每秒数千个光子），同时保持较低的光漂白水平（即LabVIEW软件中强度轨迹稳定）。
2. 在开始测量前，将样品在37 °C下平衡10分钟。
3. 使用LabVIEW软件设置倒置荧光照明显微镜。
4. 选择一个荧光探针定位合适且荧光信号强度（较低）适中的细胞。
   注意：荧光信号越低，FCS测量效果越好（见步骤8.1）。
5. 使用LabVIEW软件设置svFCS照明/检测显微镜端口。
6. 开启APD（雪崩光电二极管）。
7. 使用LabVIEW软件对选定细胞进行xy扫描。
8. 进行z轴扫描，并通过选择细胞顶部的质膜，将共聚焦光斑定位在荧光强度最大的位置，然后开始数据采集。为最大化两个膜之间的分离度，建议在细胞的核区域进行扫描。
9. 使用相关器软件记录一组20次、每次持续5秒的运行。
   注意：确保每次运行的持续时间足够长，以获得噪声较低的自相关函数（ACF）。长时间采集易受光漂白或意外显著变化（如聚集）的影响。应根据样品情况调整运行次数、每次持续时间和组数，但为保证可重复性，同一批实验中这些参数必须保持一致。
10. 关闭APD。
11. 使用Igor Pro软件剔除异常的运行数据。
12. 采用双组分二维扩散模型拟合平均ACF。根据目标分子的扩散行为类型调整该模型。
13. 将拟合参数保存至前一步的文件中（见步骤7.13）。
14. 在至少10个不同的细胞上进行10至15组记录，并重复步骤8.3至8.13。检查最终获得的单个文件是否包含腰斑尺寸信息及10–15次记录的拟合参数。
15. 为建立单一扩散定律，需分析至少四种不同的腰斑尺寸，范围在200至400 nm之间。该范围由光学衍射极限决定，但依赖于物镜（数值孔径）和激光（波长）。
    注意：由于腰斑尺寸校准并非绝对，存在一定不确定性，因此专门开发了一套MATLAB软件²⁸，可考虑x和y方向的误差（即ω²和t_d），用于拟合扩散定律。
16. 启动MATLAB软件1，选择一个包含至少四个腰斑尺寸实验对应的所有“.txt”文件的文件夹。
17. 绘制<t_d> 对 <ω²> 的关系图，即扩散定律。可从中提取两个主要参数：y轴截距（t₀）和有效扩散系数（D_eff，与斜率成反比）。

9. 不同实验条件下扩散规律的比较

注意：如有必要，针对不同的实验条件重复第7和第8节的操作。已开发专用软件（MATLAB 软件 2）用于根据 t₀ 和 D_eff 的数值判断这些扩散规律是否相似²⁸。该软件检验两个假设：两个数值不同，或两个数值在设定的误报概率（PFA）阈值以上无显著差异。设定任意的 PFA 值为 5%（T = 3.8），作为两个参数（t₀ 或 D_eff）之间差异显著性的上限，表明这两个数值相同的概率仅有 5%。

1. 创建一个“.xls”文件，其中包含待比较各条件的特征性扩散定律参数值（即，以表格形式列出未处理（NT）和经处理（COase）条件下的 t₀、t₀ 误差、D_eff 及 D_eff 误差）。
   1. 启动 MATLAB 软件 2。
   2. 选择该“.xls”文件。
   3. 分析生成的颜色编码二维图，其中 t₀ 和 D_eff 的统计检验结果分别绘制在 x 轴和 y 轴上（图 4）。T 值越高，表示被比较的数值之间差异越大。

10. 胆固醇浓度测定

1. 细胞处理与裂解
   1. 将Cos7细胞以每孔4 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基，于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养，使细胞贴壁。
   2. 移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。
   3. 加入1 mL含有（对照组不加）1 U/mL Coase的HBSS/HEPES缓冲液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
   4. 更换为1 mL含有0.1 U/mL Coase的HBSS/HEPES缓冲液，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育1小时。
   5. 移除溶液，收集细胞。
   6. 用PBS洗涤细胞3次，于室温下以400 × g离心5分钟。
   7. 在冰上用放射免疫沉淀分析缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP40，10 mM MgCl₂，1 mM乙二胺四乙酸，2%甘油，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）裂解细胞，孵育30分钟。
   8. 将裂解物于4 °C下以10000 × g离心10分钟，收集上清液。
2. 使用工作液按照制造商推荐的方法，通过改良的Bradford蛋白测定法测定各样品的总蛋白浓度。
3. 胆固醇浓度测定
   1. 为通过酶法测定细胞总胆固醇水平，请根据制造商说明使用相应的试剂盒（例如Amplex Red胆固醇测定试剂盒）。
   2. 在每个反应体系中，将含5 µg蛋白的样品与Amplex Red试剂/辣根过氧化物酶/胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶工作液混合，于37 °C避光孵育30分钟。
   3. 使用酶标仪在激发波长520 nm下检测荧光，发射波长范围为560–590 nm。
   4. 从最终读数中扣除背景值，并利用标准曲线确定胆固醇浓度。
   5. 计算每微克蛋白所含胆固醇的纳克数（ng胆固醇/µg蛋白）。

结果

我们在表达 Thy1-GFP 的 Cos-7 细胞中生成了扩散定律（图4，黑色方块）。该扩散定律具有正的 t₀ 值（19.47 ms ± 2 ms），表明 Thy1-GFP 被限制在细胞质膜的纳米结构域中。对表达 Thy1-GFP 的细胞进行胆固醇氧化酶处理后，其扩散定律的 t₀ 值移至 7.36 ± 1.34 ms（图4，灰色方块）。该结果证实 Thy1-GFP 的限制特性依赖于胆固醇含量，并与脂筏纳米结构域相关。根据上述统计检验方法（见步骤 9.1.3），这两种扩散定律在 t₀ 和 D_eff 值上均表现出显著差异。此外，我们检测了未经处理的 Cos-7 细胞与经 COase 处理细胞中总细胞胆固醇的浓度。结果显示，COase 处理后总胆固醇含量出现轻微但显著的下降（图5）。由于该酶仅作用于质膜外小叶可接触的胆固醇池，我们推断所观察到的胆固醇减少仅限于质膜，并导致脂筏纳米结构域的不稳定。

图1：通过光斑变化荧光相关光谱法（spot-variation FCS）模拟不同膜组织形式下的荧光相关光谱（FCS）扩散定律。（上图）膜组织的示意图——（A）自由扩散，（B）网状结构屏障，以及（C）陷阱/结构域限制——其中绘制了一条单个分子的轨迹（红色）。蓝色圆圈表示膜与腰径为 ω 的激光束的交界面。（下图）FCS扩散定律通过扩散时间 t_d 与半径平方 ω² 的函数关系图表示。扩散定律的投影（绿色虚线）在时间轴上的截距分别为：（A）自由扩散情况下位于原点（t₀ = 0）；（B）存在网状结构屏障时位于负轴（t₀ < 0）；或（C）存在陷阱和结构域（脂筏）时位于正轴（t₀ > 0）。D 为布朗运动的侧向扩散系数；D_eff 为有效扩散系数；D_micro 为网状结构陷阱内部的微观扩散系数；D_in 为结构域内部的扩散系数；D_out 为结构域外部的扩散系数；L 为方形结构域边长；r_D 为圆形结构域的半径。本图改编自 He 和 Marguet⁶。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：svFCS硬件控制的示意图。计算机通过不同的通信协议控制所有设备：串口（显微镜、外部快门）、USB（XYZ压电载物台、相关器）和PCI（采集板）。DAQ：数据采集板，APD：雪崩光电二极管，SPCM：单光子计数模块，DO：数字输出。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：svFCS装置的激发与发射光路示意图。svFCS装置包含四个模块：（1）光纤输出的488 nm激光经准直；（2）通过半波片与偏振分束器组合调节光功率；（3）激光束经由无管镜的电动显微镜聚焦至样品；（4）荧光信号通过类似共聚焦的检测光路，由雪崩光电二极管接收，并连接至单光子计数模块，后者向硬件相关器输出信号。该系统的简洁性使其具备高灵敏度、高稳定性和操作便捷性（详见补充材料）。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：由表达 Thy1-GFP 的 Cos-7 细胞扩散分析生成的 svFCS 扩散定律。未经处理的 Cos-7 细胞（NT，黑色方块）和经胆固醇氧化酶处理后的 Cos-7 细胞（COase，灰色圆圈）的 svFCS 扩散定律。图中插图表示对所展示的两条 svFCS 扩散定律之间是否存在显著差异进行的统计检验（依据 Mailfert 等人²⁸）。当两条扩散定律不同时，检验值（T）应高于设定为 3.8 的阈值；T 值越高，表明两条扩散定律之间的差异越大。T 值以颜色编码。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：Cos-7 细胞中总胆固醇含量的比较。Cos-7 细胞未经处理（NT）或经 1 U/mL 胆固醇氧化酶（COase）处理 1 小时。数据代表一次实验的三复孔示例。采用双尾非配对 t 检验评估统计学差异（α=0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

材料列表：svFCS 实验装置所需的光学元件清单。

补充材料： 本文档介绍了从零开始搭建svFCS装置的过程。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了在标准荧光显微镜上实现svFCS模块的方法，这是一种强大的实验手段，通过FCS扩散定律分析，解析活细胞质膜组织的动态特性。从概念上讲，svFCS基于一个简单原理：在时间域内进行荧光相关性测量，同时改变照明区域的大小²³。该策略在从显微测量中提取纳米级信息方面发挥了关键作用，有助于阐明在稳态²⁵以及生理过程^30,31,32,33中影响质膜组织的主要物理化学因素。综合来看，这些svFCS分析明确证实了在多种细胞类型中存在脂质依赖性的纳米结构域，并揭示了其在调控不同信号事件中的直接作用。

在此框架下，构建扫描可变激发体积荧光相关光谱（svFCS）装置时，需考虑若干光学因素，以优化光子预算并最小化光学像差。因此，我们建议使用一种可在进行 svFCS 测量时移除管镜的显微镜。此外，单个光阑在 svFCS 装置中起着关键作用：它可改变物镜后孔径处的光束尺寸，从而直接调节有效束腰尺寸（即有效激发体积）。为获得最小的束腰尺寸，光束直径应与物镜的后瞳相匹配³⁴。该选项有助于调节束腰尺寸，能够优化光子预算，且易于实现。最后，光路中应尽量减少光学元件的数量；系统越简单，光子损失越少。上述各项措施均能显著提升 svFCS 实验的稳健性。

关于实验方案本身，有几个关键步骤需要考虑。最重要的是光学路径的适当对准，这对于成功的svFCS测量至关重要（方案，第2节）。可通过分析2 nM Rh6G溶液在300 µW激光照射下的荧光信号来轻松验证，其信号应约为200 kHz。所有光圈应完全打开，且自相关函数（ACF）应具有显著的幅度（通常G0~1.5–2.0）。另一个关键点涉及细胞及其为svFCS分析所做的准备（方案，第4–8节）。细胞密度需调整至合适水平，以确保有可供分析的孤立细胞。非贴壁细胞需使用聚-L-赖氨酸溶液将其固定在带腔盖玻片上。细胞标记产生的荧光信号不宜过强，否则会导致ACF曲线过于平坦而难以拟合，且拟合参数将带有较大误差。此外，细胞中标记不均匀或出现荧光聚集物会使svFCS测量结果极难解释。最后，胆固醇氧化酶处理会影响细胞活力，因此svFCS分析应在处理后一小时内完成。此外，最好记录来自上部质膜的荧光涨落信号，因为该区域未与支撑面接触，可避免分子因与支撑面发生物理相互作用而导致扩散受阻。

由于存在多种调节检测体积的模式，svFCS 技术已取得足够进展，可应用于不同的研究方法，从而能够在活细胞中研究多种生物过程。除调节激发体积大小外，另一种方法是使用可变光束扩束器³⁵。也可以通过记录沿 z 方向细胞质膜截面处的荧光信号，简单地调节照明区域的大小³⁶。该方法可在标准共聚焦显微镜上实现，且已有理论框架用于推导扩散规律^37,38。

尽管svFCS方法提供了表征细胞质膜中分子非均相侧向分布所必需的空间-时间分辨率，但不同的几何限制模式并非相互排斥。某一方向上t₀值的偏离仅能揭示占主导地位的限制模式²⁵。此外，当前svFCS方法的另一个重要局限源于经典的光学衍射极限（约200 nm），该尺度无疑大于细胞质膜内分子所处的微区尺度。因此，对限制行为的分析需依据从扩散定律外推得到的t₀值进行推断。

这一缺陷已通过采用替代方法得到克服。最初，利用带有纳米孔的金属薄膜实现了对极小膜区域的照明（即，低于单个纳米级孔径的光学衍射极限，其半径范围在75至250 nm之间）³⁹。因此，人们报道了由孤立结构域组织的理论扩散定律所预测的过渡区域，并得以更精确地确定纳米级膜异质结构的特征尺寸，以及对脂质依赖性纳米结构域所占表面积进行定量估算³⁹。此外，纳米级照明还通过近场扫描光学显微镜⁴⁰或平面光学纳米天线技术得以实现⁴¹。最近，将受激发射损耗（STED）与荧光相关光谱（FCS）相结合，提供了一种强大且灵敏的工具，可用于以极高空间分辨率记录扩散规律。该STED-FCS技术能够获取在极短时间内发生的纳米尺度分子扩散特性，从而实现对质膜上脂质探针动态组织的研究^42,43。然而，STED过程中荧光抑制不完全的问题，给FCS中自相关曲线的分析带来了挑战。

一种新的拟合模型已被开发出来，以克服这一困难，从而提高扩散时间及平均分子数测量的准确性⁴⁴。最后，对于细胞膜上较慢的分子扩散，可将svFCS原理应用于通过成像相关光谱技术记录的数据⁴⁵。最近的研究表明，将原子力显微镜（AFM）与成像全内反射荧光相关光谱（ITIR-FCS）相结合，有助于进一步阐明阻碍细胞膜分子扩散的机制本质，尤其是在纳米结构域密度较高、接近渗流阈值膜构型的情况下⁴⁶。

总之，通过慢速荧光相关光谱（svFCS）建立扩散定律，为推断由动态集体脂质和膜蛋白相互作用所形成的局部异质性提供了实验证据。正如Wohland及其同事⁴⁶所述：“FCS扩散定律分析仍然是利用动态信息推断超出分辨率极限的结构与组织特征的有力工具”。然而，我们仍需发展新的模型以优化对扩散定律的解释，从而更深入地理解细胞质膜上分子事件的动力学过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
校准工具	SM1螺纹卡环用拨片扳手	Thorlabs	SPW602
雪崩光电二极管与单光子计数模块（SPCM）	单光子计数模块，雪崩光电二极管	Excelitas	SPCM-AQRH-15
	BNC 50 Ω 插头转 50 Ω 插头连接线，2 m	RS Components	742-4315
	同轴电缆 415 Cinch 连接器，RG-316，50 Ω，带连接器，1.22 m，RoHS2	RS Components	885-8172
	T型 50Ω RF适配器，BNC插头转BNC插座，0 → 1GHz	RS Components	546-4948
	Brennenstuhl 2.5 m，8插口，E型 – 法式延长电源线，230 V	RS Components	768-5500
	Mascot，6W 插入式电源适配器，5V 直流，1.2A，单路输出开关电源，C型	RS Components	452-8394
	Crystek CCSMACL-MC-24 参考振荡器电源线 RF适配器	RS Components	792-4079
荧光滤光	535/70 ET带通滤光片，AOI 0°，Chroma，直径25 mm	AHF filter	F47-539
	激光分束器 zt488 RDC，AOI 45°，Chroma，25.5 x 36 x 1 mm	AHF filter	F43-088
	496/LP BrightLine HC长波通滤光片，AOI 0°，Chroma，直径25 mm	AHF filter	F37-496
硬件相关器	80 MHz 数字相关器	Correlator.com	Flex02-12D
激光器	LASOS LDM-XT 光纤耦合激光器，488 nm，65 mW	Lasos	BLD-XT 488100
激光安全	高性能黑色遮蔽胶带，1" x 180英尺（25 mm x 55 m）卷	Thorlabs	T743-2.0
	镜头纸，每本25张，共5本	Thorlabs	MC-5
	激光防护眼镜，浅橙色镜片，可见光透过率48%	Thorlabs	LG3B
显微镜	蔡司Axiovert 200M 电动倒置荧光显微镜 具备精细与粗调焦、反射镜转盘旋转、物镜转盘旋转、相机端口切换及内置光源快门功能	Carl Zeiss
	C-Apochromat 40x/1.2 W Korr.，用于FCS （D=0.14–0.19 mm）（D=0.17 mm时工作距离WD=0.28 mm），适用于紫外-可见-红外波段	Carl Zeiss	421767-9971-711
	适配器 W0.8 / M27x0.75 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-345
	中环 W0.8 - W0.8 H "5"	Carl Zeiss	000000-1698-347
光路组件	直径25.4 mm，保护银膜反射镜	Thorlabs	PF10-03-P01
	直径25.4 mm，焦距60.0 mm，可见光消色差透镜	Thorlabs	AC254-060-A
	直径25.4 mm，焦距35.0 mm，可见光消色差透镜	Thorlabs	AC254-035-A
	25 µm 安装式针孔	Thorlabs	P25S I
	25.4 mm 安装式零级半波片，488 nm	Thorlabs	WPH10M-488 (HWP)
	20 mm 偏振分束立方体，420–680 nm	Thorlabs	PBS201
	旋转台，内螺纹直径56 mm x 26 mm	Thorlabs	RSP1/M
	52 mm x 52 mm 运动学平台支架	Thorlabs	KM100B/M
	可调棱镜夹具	Thorlabs	PM3/M
	光束挡板，有效区域19 mm x 38 mm	Thorlabs	LB1/M
	虹膜光阑，孔径1 mm 至 25 mm	Thorlabs	ID25/M
	左手运动学柱面透镜支架	Thorlabs	KM100CL
	1" 光学元件安装座，M4螺纹孔	Thorlabs	MFF101/M
	1" 可堆叠透镜管	Thorlabs	SM1L03
	可堆叠透镜支架，适用于1"光学元件，可用深度½	Thorlabs	SM1L05
	可堆叠透镜支架，适用于1"光学元件，可用深度2"	Thorlabs	SM1L20
	小型光学导轨，600 mm，公制	Thorlabs	RLA600/M
	小型光学导轨，75 mm，公制	Thorlabs	RLA075/M
	小型光学导轨，150 mm，公制	Thorlabs	RLA150/M
	导轨载具，沉头孔1" x 1"	Thorlabs	RC1
	导轨载具，垂直燕尾槽	Thorlabs	RC3
	高精度1英寸平移透镜支架	Thorlabs	LM1XY/M
	½ "（12 mm）燕尾平移台	Thorlabs	DT12/M
	导轨夹具	Thorlabs	CL6
	公制XYZ平移台（含PT102）	Thorlabs	PT3/M
	黑色橡胶化织物	Thorlabs	BK5
	球头螺丝工具套件，共6件	Thorlabs	BD-KIT/M
	带外螺纹M6 x 1.0和外螺纹M4 x 0.7的适配器	Thorlabs	AP6M4M
	安装底座，25 mm x 58 mm x 10 mm，5件装	Thorlabs	BA1S/M-P5
	25.4 mm 光学元件透镜支架	Thorlabs	LMR1/M
	SM1 FC/APC 适配器	Thorlabs	SM1FCA
	1英寸光学元件运动学反射镜支架	Thorlabs	KM100
	硅光电探头，400–1100 nm，50 mW	Thorlabs	S120C
	12.7 mm 支杆固定座，带弹簧加载六角锁紧旋钮， 长度50 mm，5件装	Thorlabs	PH50/M-P5
	带弹簧加载六角锁紧旋钮的支杆固定座，长度20 mm	Thorlabs	PH20/M
	12.7 mm x 50 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱， M6螺纹孔，5件装	Thorlabs	TR50/M-P5
	12.7 mm x 75 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱， M6螺纹孔，5件装	Thorlabs	TR75/M-P5
	USB功率与能量计接口	Thorlabs	PM100USB
	12.7 mm x 30 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱， M6螺纹孔	Thorlabs	TR30/M
	12.7 mm x 20 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱， M6螺纹孔	Thorlabs	TR20/M
	750 mm 长结构导轨（检测箱）	Thorlabs	XE25L750/M
	350 mm 长结构导轨（检测箱）	Thorlabs	XE25L350/M
	25 mm 导轨用快速直角棱镜	Thorlabs	XE25W3
	25 mm 导轨用直角支架	Thorlabs	XE25A90
	黑色卡纸，20" x 30"（508 mm x 762 mm），1/16"（1.6 mm）厚，5张	Thorlabs	TB5
	25 mm 导轨外壳用铰链	Thorlabs	XE25H
	25 mm 导轨外壳用盖板限位器	Thorlabs	XE25LS
	M4 内六角螺钉套件	Thorlabs	HW-KIT1/M
	M6 内六角螺钉套件及五金套件	Thorlabs	HW-KIT2/M
	桌夹，L型，5件装	Thorlabs	CL5-P5
	SM1环控虹膜光阑（Ø0.8 - Ø12 mm）	Thorlabs	SM1D12D
	Ø1" SM1安装式磨砂玻璃校准盘，带Ø1 mm 孔	Thorlabs	DG10-1500-H1-MD
	蜂窝结构光学平台台面，Standa	Standa	1HB10-15-12
	光学平台支撑架，Standa	Standa	1TS05-12-06-AR
样品纳米定位	高精度XYZ纳米定位系统	Physik Instrumente	PI P527-3.CD
	数字多通道压电控制器，3通道，-30 至 130 V 带Sub-D连接器，电容传感器	Physik Instrumente	PI E727-3.CD
温控腔室	蔡司200M倒置显微镜培养系统 MATT BLK	Digital Pixel
	双通道微处理器温度控制器	Digital Pixel	DP_MTC_2000_DUO
	两个无振动加热模块	Digital Pixel	DP_150_VF
	PT100 温度传感器	Digital Pixel	DP_P100_TS
生物试剂与材料
细胞培养与转染	Cos7细胞	ATCC®	CRL-1651™
	8孔Lab-Tek培养皿	Thermo Fisher Scientific	155411PK
	杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	11965092
	胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	16000044
	L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	25030081
	PBS缓冲液	Thermo Fisher Scientific	14190144
	青霉素-链霉素溶液（PenStrep）	Thermo Fisher Scientific	15140122
	PolyJet转染试剂	SignaGen Laboratories	SL100688
胆固醇含量测定	Amplex Red 胆固醇检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	A12216
	蛋白酶抑制剂混合物	Thermo Fisher Scientific	87786
	磷酸酶抑制剂混合物	Thermo Fisher Scientific	78420
	ROTI Nanoquant 工作液	Roth	K880
	GloMax Discover 微孔板读板仪	Promega	GM3000
svFCS测量	HBSS缓冲液	Thermo Fisher Scientific	14025092
	HEPES缓冲液	Thermo Fisher Scientific	15630080
	胆固醇氧化酶	Sigma-Aldrich	C8868
	罗丹明6G	Sigma-Aldrich	83697-1G