四聚体荧光抗原阵列用于单步鉴定抗原特异性B细胞

摘要

本方案详细介绍了用于标记抗原特异性B细胞的荧光探针的可定制化制备与使用方法。

摘要

荧光抗原的制备是鉴定抗原特异性B细胞的关键步骤。本文详细介绍了四臂荧光聚乙二醇（PEG）-抗原偶联物的制备、纯化及其应用，该偶联物可通过与同源B细胞受体的高亲和力结合，选择性地识别抗原特异性B细胞。利用模块化的点击化学反应及市售的荧光染料标记试剂盒，我们展示了制备定制化荧光PEG偶联物的灵活性，成功构建了针对蛋白脂质蛋白（PLP_139-151）和胰岛素的独立阵列，这两种抗原分别是多发性硬化和1型糖尿病小鼠模型中的重要自身抗原。针对每种荧光偶联物，我们分别在相应的疾病模型中建立了基于流式细胞术的检测方法。通过将抗原阵列与单价自身抗原进行比较，量化了多聚化修饰在PEG骨架上的优势。最后，我们通过体外抗原刺激后分离并评估抗胰岛素B细胞反应，展示了该技术平台的应用价值。对胰岛素特异性B细胞进行标记，能够放大共刺激分子（CD86）变化的检测信号，而这些信号在总体B细胞分析中往往被掩盖。综上所述，本研究为荧光抗原阵列的制备与应用提供了可靠方法，使其成为研究B细胞群体的有力工具。

引言

适应性免疫系统在多种疾病状态（包括自身免疫病、癌症和传染病）的发展或消退过程中起着关键作用¹。在免疫病理学研究或开发新型精准治疗策略等广泛应用中，评估驱动疾病进展的抗原特异性B细胞和T细胞反应往往至关重要^2,3,4。主要组织相容性复合体（MHC）四聚体已广泛商业化，可用于鉴定抗原特异性T细胞克隆⁵。这些带有荧光标记的结构可呈现四价肽-MHC复合物，能够高效结合相应的T细胞受体，从而用于显微镜观察和流式细胞术等标记应用。

用于B细胞检测的抗原可能具有高度差异化的分子量、电荷和溶解度^6,7。当使用单体抗原作为可溶性B细胞探针时，其理化性质可能因无法与更大且水溶性的链霉亲和素分子形成复合物而难以稳定，或在偶联前作为单体试剂时出现溶解度问题。因此，某些蛋白质在实际操作中可能存在生物偶联困难并导致意外结果^7,8。直接荧光染料偶联有时会使偶联物失去水溶性并呈现亲脂性。这些直接染料-抗原化合物容易非特异性地嵌入细胞膜中，干扰抗原特异性分析^7,8,9。一些策略通过将抗原和荧光基团与其他功能基团偶联来克服溶解度挑战。例如，Cambier等人使用天然形式的生物素化胰岛素与胰岛素特异性B细胞受体（BCRs）结合，随后逐步加入荧光标记的链霉亲和素¹⁰。尽管该方法能够高分辨率地检测结合单体胰岛素的B细胞，但需要两个标记步骤。若能建立一种通用的、基于聚合物的即用型B细胞探针制备方案，并可轻松整合到常规荧光抗体标记流程中，将有助于推动疾病相关B细胞研究的深入发展。

在本实验方案中，我们详细描述了荧光抗原阵列（FAA）的制备与使用方法，该技术可用于显微镜和流式细胞术实验中对抗原特异性B细胞进行通用且单步标记（图1）。在过去十年中，可溶性抗原阵列（SAgA）已被用作靶向B细胞的抗原特异性免疫疗法，用于治疗自身免疫性疾病^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22}。SAgA利用柔性聚合物骨架上的多价抗原展示，高效结合B细胞受体并诱导免疫调节效应；然而，当其与荧光染料偶联时，其抗原特异性还提供了另一种探查目标B细胞的机会²³。构成SAgA的聚合物骨架赋予整个生物大分子良好的水溶性，并可减弱某些抗原本身极端的理化特性，从而避免探针制备和染色特异性方面的问题^6,24。我们已通过模块化的点击化学方法，将多种不同大小和复杂程度的抗原成功接枝到SAgA平台上，该方法适用于小肽表位和完整蛋白质^14,18。本文中，我们展示了FAA作为稳定高效的抗原特异性B细胞标记工具，可与常规荧光抗体标记方法并行使用。我们制备并评估了含人胰岛素的FAA，用于在1型糖尿病转基因小鼠模型（VH125）中标记B细胞；同时还构建了包含蛋白脂质蛋白139-151（PLP）的FAA，该肽段是多发性硬化小鼠模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的肽表位。选用这些疾病模型的目的在于展示该平台的广泛适用性，不仅能够灵活替换所使用的抗原，而且同样适用于肽表位（PLP）和完整蛋白质（胰岛素）的标记。本实验方案的设计注重可及性，无需研究者具备深厚的生物偶联技术背景。所用试剂以及合成与纯化方法均具有良好的通用性，可在专注于化学、分子生物学或免疫学研究的大多数实验室中便捷实施。

方案

本研究中涉及的所有动物实验程序均经堪萨斯大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 抗原阵列合成（4–6 天）

1. 用炔基手性基团对未修饰抗原进行功能化处理（1 小时）。将 1 当量胰岛素（100 mg，17.4 μmol）加入带有搅拌子的 20 mL 玻璃小瓶中，用无水二甲基亚砜（DMSO）（2 mL）溶解，并使用热风枪或水浴轻轻加热至 40–50 °C。
   1. 加入 1,1,3,3-四甲基胍（40.2 mg，348.8 μmol）和 1.35 当量新配制的 78.5 mM 丙炔基 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-酯）无水 DMSO 储备液（0.3 mL，5.3 mg，23.6 μmol）。
   2. 室温下搅拌 30 分钟，然后用 0.05% HCl（12 mL）淬灭反应。
2. 通过反相液相色谱纯化单修饰的胰岛素-炔（4 小时）。使用制备型 C18 柱（19 mm × 250 mm，300 Å 孔径，5 μm 粒径），采用 10 分钟 30–40% B 的梯度洗脱（A：含 0.05% 三氟乙酸（TFA）的水；B：含 0.05% TFA 的乙腈），流速为 14 mL/min。目标产物在未修饰胰岛素之后立即洗脱出来。
   1. 用氮气流或减压（650 帕斯卡）、150 rpm 转速旋转蒸发除去乙腈和 TFA。将水溶液冷冻并冻干至完全干燥。在干燥气氛下于 -20 °C 保存功能化胰岛素。
      注：在上述储存条件下，功能化胰岛素可稳定保存长达一年。
3. 通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）合成抗原阵列（2.5 小时）²²。将 6 当量胰岛素-炔（38 mg，6.3 μmol）加入带有搅拌子的 10 mL 玻璃小瓶中，用 DMSO（1.2 mL）溶解并轻微加热。
   1. 加入 50 mM 磷酸钠缓冲液（1.8 mL，pH 7.4）、1 当量 20 kDa 四臂 PEG 叠氮（21 mg，1.05 μmol）、五水合硫酸铜（3.15 mg，12.6 μmol）、三（3-羟丙基三唑甲基）胺（27.37 mg，63 μmol）和抗坏血酸钠（50.34 mg，254 μmol）。
   2. 室温下搅拌 2 小时，然后加入 DMSO（3 mL）以溶解任何沉淀物，并用 0.05% HCl（4 mL）酸化溶液。
4. 通过反相液相色谱纯化抗原阵列（3 小时）。使用制备型 C18 柱（19 mm × 250 mm，300 Å 孔径，5 µm 粒径），采用 10 分钟 20–60% B 的梯度洗脱（A：含 0.05% TFA 的水；B：含 0.05% TFA 的乙腈），流速为 14 ml/min。目标产物在胰岛素-炔之后立即洗脱出来。
   1. 用氮气流或减压旋转蒸发除去乙腈。将水溶液冷冻并冻干至完全干燥。在干燥气氛下于 -20 °C 保存。
      注：胰岛素抗原阵列具有强吸湿性。冻干纤维在反复暴露于大气后可能聚集成致密团块。FAA 的性质可能因应用中所用抗原的不同而有所差异。在上述储存条件下，胰岛素抗原阵列可稳定保存数月。

2. 荧光染料偶联（1–2 天）

1. 将荧光染料与抗原阵列偶联（2.5 小时）。将 1 当量的四价胰岛素（21.7 mg，0.5 μmol）加入含有搅拌子的 20 mL 玻璃小瓶中，用 DMSO（1.75 mL）溶解并轻微加热。加入新配制的 100 mM 碳酸盐缓冲液（8 mL，pH 9.0）和 5 当量的异硫氰酸荧光素（以 DMSO 配制的新鲜 10 mM 储存液 0.25 mL，0.97 mg，2.5 μmol）。室温避光搅拌反应 2 小时。
2. 通过透析纯化产物（24 小时）。使用 3.5 kDa 分子量截留的透析袋，在 5 L 搅拌容器中以蒸馏水进行透析，室温避光操作。透析 24 小时，每 6–12 小时更换一次透析液。
3. 将透析后的溶液冷冻并冻干至完全干燥，得到 FAA。在 -20 °C 干燥避光条件下保存。
   注：在此储存条件下，FAA 可稳定保存数月。

3. FAA 表征（2–4 小时）

1. 根据 Laemmli²⁵ 方法，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析步骤 1 和 2 的产物（2 小时）。制备含有 5 μg 纯化单价抗原、20 kDa 四臂 PEG 叠氮化物、抗原阵列和 FAA 的样品。
   1. 使用凝胶成像仪通过荧光成像观察 FAA 样品中的荧光标记。
   2. 进行考马斯亮蓝染色²⁶ 以观察抗原。
   3. 进行碘染色²⁷ 以观察 PEG 骨架。用蒸馏水冲洗凝胶（每次 2 分钟，共 3 次），在 5% 氯化钡溶液（20 mL）中孵育 10 分钟，再用蒸馏水冲洗（每次 2 分钟，共 3 次），然后在 0.1 N 碘溶液（20 mL）中孵育 1 分钟，最后再次用蒸馏水冲洗（每次 2 分钟，共 3 次），以在观察前去除背景染色。
      注：配制 0.1 N 碘溶液时，将碘化钾（2.0 g，12 mmol）和碘（1.27 g，5 mmol）加入 100 mL 蒸馏水中。
2. 通过紫外-可见光谱法计算染料标记程度（1 小时）。将少量 FAA 溶解至浓度为 0.1 mg/mL，记录其在 280 nm 处的吸光度以及染料的最大吸收波长处的吸光度。获取抗原和染料的摩尔消光系数。
   注：某些染料对 pH 敏感。测量 FAA 吸光度时，应使用适当缓冲的溶液（如 pH 8.3 的 100 mM 碳酸盐缓冲液），以确保所报告的染料消光系数准确。
   1. 进行以下计算²⁸，其中 A_{Dye, maxλ} 为 FAA 在染料最大吸收波长处的吸光度，E_{Dye, maxλ} 为染料在最大吸收波长处的摩尔消光系数，E_{antigen, 280 nm} 为单价抗原在 280 nm 处的摩尔消光系数：
      校正因子（CF）= A_{Dye, 280 nm} / A_{Dye, maxλ} 0.25 * (A_{Dye, maxλ} / E_{Dye, maxλ}) * (E_{antigen, 280 nm} / (A_{280 nm} – (A_{Dye, maxλ} * CF))) = 染料/FAA
3. 通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析 FAA 中是否存在游离染料或潜在降解产物（1 小时）。
   1. 将少量 FAA 溶解至浓度为 1.0 mg/mL，使用分析型 C18 色谱柱（4.6 mm × 150 mm，300 Å 孔径，2.5 μm 粒径），采用 10 分钟 5–95% B 梯度（A 相：含 0.05% 三氟乙酸的水；B 相：含 0.05% 三氟乙酸的乙腈），流速为 1 mL/min 进行分析。将紫外-可见光检测器设置为监测染料的最大吸收波长（FITC 为 437 nm）。
      注：对于 pH 敏感性染料，在酸化溶剂中进行 HPLC 分析时，可能需要将监测波长从染料在中性水溶液中的最大吸收波长进行调整。在含 0.05% TFA 的条件下，pH 约为 3，FITC 的最大吸收波长会发生偏移。

4. 通过 FAA 滴定进行检测方法开发（3–5 小时）

注意：此处介绍的是流式细胞术中FAA的使用方法，但相同步骤可经修改后用于其他实验形式，如免疫组织化学或荧光显微镜检测。当将FAA应用于新的实验形式时，必须重新进行优化实验。混合或分离的细胞群体可通过血液或淋巴器官处理方法获得^23,29。不推荐通过酶消化组织的方式获取细胞，因为细胞表面标志物可能在该过程中脱落。

1. 将FAA储备液用FACS缓冲液（1× PBS + 5% 胎牛血清和0.1% 叠氮化钠）稀释至1 mg/mL。可加入最多10%的DMSO以加速溶解。
2. 获取目标抗原特异性B细胞阳性的细胞，并分装至微量离心管中。总共需要约1 × 10⁷个细胞。
   注意：本演示中所用的脾细胞系根据堪萨斯大学IACUC批准的方案从VH125和EAE小鼠中分离获得。研究人员可采用本文所述方法处理适用于自身实验体系的细胞样本及FAA制备。
   1. 每管分装5 × 10⁵个细胞，用于滴定标记重复实验（每个滴定至少3个重复）。
   2. 每管分装1 × 10⁵个细胞，用于单染对照及未染色对照。
      注意：也可使用抗体同型对照和“减去一荧光”对照（fluorescence minus one control）以全面验证该检测方法的可靠性。
3. 向每管中加入1 mL FACS缓冲液洗涤细胞，200 × g离心5分钟。
4. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于50 µL FACS缓冲液中。
5. 按照厂家推荐浓度向各样品中加入CD3和CD19荧光标记抗体，同时加入已滴定浓度的FAA。
   注意：荧光抗体的工作浓度可独立进行滴定，以确认批次有效性。FAA的适宜剂量范围因应用而异，但建议起始剂量为每样本50、25、10、5和1 μg。1 µL FAA储备液相当于1 µg剂量。
6. 充分混匀各样品，避光冰上孵育30分钟。
7. 孵育结束后，向每管加入1 mL FACS缓冲液洗涤细胞，200 × g离心5分钟。
8. 吸除上清液，再向每管加入1 mL FACS缓冲液重复洗涤一次，200 × g离心5分钟。
9. 吸除上清液，将样品重悬于200 µL新鲜FACS缓冲液中，置于冰上，立即送至流式细胞仪进行检测。
10. 上机检测样品，每样本至少采集50,000个细胞事件。

5. FAA 滴定分析与标记剂量优化（1–2 小时）

1. 使用流式细胞术分析软件，对单细胞进行设门。
2. 在单细胞群体中，设置 CD19+（B 细胞）和 CD3+（T 细胞）的门。
3. 在 CD19+ 和 CD3+ 父代群体中，于相应的荧光染料通道中圈选 FAA+ 事件。
4. 记录 CD19+ 和 CD3+ 父代群体中 FAA+ 事件的百分比。
5. 通过将 CD19+ 群体中 FAA+ 事件的比例（特异性）除以 CD3+ 群体中 FAA+ 事件的比例（非特异性），计算特异性比率。为确保 FAA 的有效使用，应使特异性比率最大化。
6. 在后续实验中采用对应最高特异性比率的标记剂量。

结果

通过称重法测定，纯化的胰岛素-炔烃（图2，上图）产率通常为50–65%。产率低于40%的情况可能由无水DMSO中的水分污染或丙炔基NHS酯的水解引起。在抗原多聚化反应中（图1B），纯化的胰岛素抗原阵列（图2，中图）产率在60–75%之间，SDS-PAGE分析证实主要产物为四价物种（图3A）。在荧光染料修饰步骤中（图1C），纯化的FITC四臂胰岛素FAA（图2，下图）产率稳定在约50%。SDS-PAGE分析定性证实了染料成功连接至四价抗原阵列（图3A）。在酸性条件下以FITC的最大吸收波长437 nm对FITC四臂胰岛素进行HPLC分析，证实游离染料已从产物中去除（图3B

讨论

我们开发了一种用于构建定制化荧光激活探针（FAA）的方案（图1），以鉴定抗原特异性B细胞，从而简化针对难处理抗原靶标的B细胞探针的制备。我们选用带有末端叠氮基团的四臂聚乙二醇（PEG）聚合物作为构建FAA的简便底物，因为PEG具有良好的水溶性，而其功能化的叠氮基团可实现简单的点击化学偶联反应³³。明确数量的功能基团（4个臂）有利于简化化学抗原偶联过程，因为可使用摩尔过量的抗原，从而避免严格的反应条件优化。研究人员在设计抗原时，应考虑构建自身FAA所需的炔基功能。寡肽表位可从合成肽供应商处定制订购或合成，并带有均丙炔基（homopropargyl）连接臂。也可利用NHS化学方法将较大的蛋白抗原修饰上炔基功能基团¹⁸。如果步骤1.1中的NHS酯化反应未能进行，可能的原因是NHS酯发生水解。这种情况可能由于NHS酯未在干燥环境中妥善保存，或在反应过程中无水DMSO被水污染所致。如果步骤1.3中的铜催化叠氮-炔环加成反应未能生成四价抗原阵列，可能的解决方案包括提高反应抗原的浓度或加热至37 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,1,3,3-四甲基胍	Alfa Aesar	AAA12314AC
12 M 盐酸	Fisher Chemical	A508-4
12% Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶，10 孔，30 µL	Bio-Rad	4561043
20 kDa 4 臂 PEG 叠氮化物	Jenkem USA	A7185-1
3.5 kDa 截留分子量透析管（再生纤维素）	Fisher Scientific	25-152-10
乙腈，HPLC 级	Fisher Chemical	A998-4
Alexa Fluor 647 抗小鼠 CD19 抗体	BioLegend	115522
无水二甲基亚砜	ACROS Organics	AC610420010
氯化钡	ACROS Organics	203135000
亮蓝 G-250 染料	Fisher BioReagents	BP100-50
Cell Prime r-胰岛素	EMD Millipore	4512-01	用于胰岛素 FAA 合成的重组人胰岛素
五水硫酸铜(II)	ACROS Organics	AC197722500
二甲基亚砜	Fisher Chemical	S67496
异硫氰酸荧光素（FITC）异构体 1	Sigma-Aldrich	F7250-1G
冰乙酸	Fisher Chemical	A38-212
甘油	ACROS Organics	15892-0010
甘氨酸	Fisher Chemical	G46-500
高丙炔基-PLP	Biomatik	NA	定制合成（序列：高丙炔基-HSLGKWLGHPDKF；纯度：97.29%）
碘	Sigma-Aldrich	207772-100G
甲醇，HPLC 级	Fisher Chemical	A452-4
NHS-罗丹明（5/6-羧基-四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯），混合异构体	Thermo Scientific	46406	论文中使用的罗丹明-B NHS 酯的市售类似物
PE/氰基7 抗小鼠 CD3 抗体	BioLegend	100220
碘化钾	Sigma-Aldrich	30315
丙炔基 N-羟基琥珀酰亚胺酯	Sigma-Aldrich	764221
抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	A7631
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
十二烷基硫酸钠	Fisher BioReagents	BP166-100
磷酸二氢钠一水合物	Fisher Chemical	S468-500
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	302031-10x1mL
Tris 碱	Fisher BioReagents	BP152-500
三(3-羟丙基三唑基甲基)胺	ClickChemTools	1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 µm，4.6 × 150 mm 色谱柱	Waters	186003034
xBridge BEH C18 5 µm OBD 制备柱，19 × 250 mm	Waters	186004021