不同深度低温对心肌保护作用的差异尚未得到充分评估。本研究旨在利用基于人源心肌细胞的模型，定量分析不同低温处理后细胞死亡水平，为后续深入的分子机制研究奠定基础。
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方法文章
体外评估低温预处理对人心肌细胞模型的心肌保护作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
缺血/再灌注所致的心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床情况。特别是心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，低温可在一定程度上保护心肌，以应对预期的缺血性损伤。然而，关于低温诱导的复杂分子变化的研究仍然有限。因此，有必要建立一种类似于体内条件的培养环境，能够以可重复的方式诱导出与临床状况相似的心肌损伤。为了在体外模拟缺血样条件，本模型中的细胞接受了氧糖剥夺（OGD）处理。此外，我们采用了心脏手术期间常用的标准时间-温度方案。同时，我们提出了一种简单而全面的定量分析心肌损伤的方法。通过流式细胞术和ELISA试剂盒检测了细胞凋亡及凋亡相关蛋白的表达水平。在本模型中，我们验证了不同温度条件对心肌细胞体外凋亡影响的假设。该模型的可靠性依赖于严格的温度控制、可调控的实验流程以及稳定的实验结果。此外，该模型可用于研究低温心脏保护作用的分子机制，这可能对开发与低温联合使用的辅助治疗策略具有重要意义。
引言
缺血/再灌注所致的心肌功能障碍是心脏手术后患者常见的临床情况1,2。在非搏动性低流量灌注及完全循环停止期间，各类心肌细胞仍会发生损伤。特别是心肌细胞对缺血性损伤的敏感性高于其他细胞群体。目前，治疗性低温（TH）可在接受心脏手术的患者中对预期的缺血性损伤提供显著保护作用3,4。TH定义为机体核心温度在14–34 °C之间，但关于心脏手术期间低温的定义尚无共识5,6,7。2013年，一个国际专家小组提出了一种标准化报告系统，用于对全身性低温循环停止的不同温度范围进行分类8。根据脑电图和脑代谢研究，他们将低温分为四个等级：深低温（≤ 14 °C）、深中度低温（14.1–20 °C）、中度低温（20.1–28 °C）和轻度低温（28.1–34 °C）。该专家共识提供了清晰且统一的分类标准，使不同研究之间更具可比性，并能提供更具临床相关性的结果。TH的保护作用基于其降低细胞代谢活性的能力，从而进一步限制高能磷酸化合物的消耗速率9<....
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方案
有关商用试剂和仪器的信息列在材料表中。
AC16 人源心肌细胞系由成人左心室心肌组织的原代细胞与SV40转化的人成纤维细胞融合而成17，其中成纤维细胞购自BLUEFBIO公司（中国上海）。该细胞系具有心肌细胞典型的多种生物化学和形态学特征。此外，该细胞系被广泛用于体外评估心肌损伤和心肌功能18,19。
1. 细胞培养
注意：基础培养基由无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）、1% 心肌细胞生长补充剂和 1% 青霉素/链霉素溶液组成。将培养基储存在 4 °C，使用前预热至 37 °C。
- 从液氮中取出冷冻保存的人心肌细胞（HCM），并在37 °C水浴中解冻。
- 轻轻摇动冻存管（<1分钟），置于37 °C水浴中，直至管内仅剩一小块冰。
- 将冻存管转移至无菌超净工作台中，用浸有70%酒精的棉球擦拭管外壁。
- 将4 mL预热的完全培养基逐滴加入含有解冻细胞的离心管中。
- 将细胞悬液在200 × g 条件下离心10分钟。离心后弃....
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结果
通过CCK-8法检测OGD暴露对HCM细胞活力的影响。与对照组相比，细胞活力随时间呈显著的时间依赖性下降（图2A）。再灌注后不同时间点HCM细胞的凋亡率呈现特定趋势：从0至16 h，凋亡率逐渐升高，并在16 h时间点达到峰值（图2B）。由于12 h的OGD处理使细胞活性降低约50%，因此在后续实验中采用12 h OGD诱导细胞损伤。
随后我们考察了温度对细胞凋亡过程的影响。与OGD组相比，接受低温处理的三个组中活细胞比例更高（图3B）。此外，深度低温组细胞的存活率最高（>92%），是OGD组的2.1倍。同时，流式细胞术结果表明，低温处理可防止OGD条件下HCMs的细胞凋亡（图3A&3C）。由于线粒体功能障碍与细胞凋亡相关，我们进一步获取了数据以评估线粒体功能紊乱情况。采用DCFH-DA法测定细胞内ROS水.......
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讨论
完整动物的复杂性，包括不同类型细胞之间的相互作用，常常阻碍对缺血/再灌注（I/R）损伤特定组分的深入研究。因此，有必要建立一种能够准确反映体内缺血后分子变化的体外细胞模型。关于氧糖剥夺（OGD）模型的研究已有先前报道13,22，并已建立多种精密的方法23,24。OGD模型的制备过程包括两个关键步骤：缺氧和缺糖。在本研究中，通过在无糖培养基中培养细胞实现缺糖，通过氮气置换实现缺氧，这是目前制备OGD模型的一种成熟方法25,26。然而，根据细胞类型的不同，必须考虑两个因素：1）细胞接种密度和2）OGD暴露时间。贴壁细胞数量越多，对OGD应激的抵抗力越强，因此OGD前的接种时间至关重要。HCMs（2 × 105 个细胞/孔）在6孔板中接种后培养30–34小时，此时细胞融合度.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由国家自然科学基金（81970265，81900281，81700288）、中国博士后科学基金（2019M651904）以及国家重点研发计划（2016YFC1101001，2017YFC1308105）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | Bio-Technology,中国 | C1062M | |
| 心肌细胞生长添加剂 | Sciencell,美国 | 6252 | |
| Caspase 3活性检测试剂盒 | Bio-Technology,中国 | C1115 | |
| Caspase 8活性检测试剂盒 | Bio-Technology,中国 | C1151 | |
| 无葡萄糖DMEM培养基 | Gibco,美国 | 11966025 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco,美国 | 11960044 | |
| 胎牛血清 | Gibco,美国 | 16140071 | |
| 流式细胞仪 | CytoFLEX,美国 | B49007AF | |
| 人源心肌细胞 | BLUEFBIO,中国 | BFN60808678 | |
| JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Bio-Technology,中国 | C2006 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco,美国 | 10378016 | |
| 活性氧检测试剂盒 | Bio-Technology,中国 | S0033S | |
| 三气培养箱 | Memmert,德国 | ICO50 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco,美国 | 25200056 |
参考文献
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (3), 230-238 (2016).
- Klein, P., et al. Less invasive ....
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