研究神经肽及其他调节因子在成年蚊子排泄系统中的活性

摘要

本方案概述了用于研究成年蚊虫排泄系统（包括马氏管和后肠）的拉姆齐测定法、离子选择性微电极、扫描离子选择性电极技术（SIET）以及体外收缩测定法，这些方法可共同用于测量离子和液体分泌速率、收缩活动以及跨上皮离子转运。

摘要

对昆虫生理学的研究，特别是在那些作为病原体传播媒介并导致人类和其他脊椎动物疾病的物种中，为开发新型害虫控制策略奠定了基础。本文描述了一系列常规用于研究神经肽及其他神经因子（如生物胺）在埃及伊蚊（Aedes aegypti）排泄系统中功能作用的方法。负责原尿形成的马氏管（MTs）在从蚊体取出后仍可维持数小时的功能，从而可在激素处理后进行液体分泌量的测定。因此，拉姆齐（Ramsay）测定法是一种用于测量离体马氏管分泌速率的有效技术。随后可使用离子选择性微电极（ISME）测定分泌液中离子浓度（如 Na⁺ 和 K⁺）。该方法可在同一时间测定多个马氏管，以评估不同激素和药物的作用效果。扫描离子选择性电极技术（SIET）利用离子选择性微电极测量离子转运器官表面静止层中代表离子活性的电压，从而近乎实时地测定跨上皮离子转运过程。该方法可用于理解激素及其他调节因子在上皮组织离子吸收或分泌过程中的作用。后肠收缩测定也是一种有效的工具，可用于表征具有肌活性的神经肽，这些神经肽可能增强或减弱该器官排出多余液体和废物的能力。总体而言，这些方法有助于深入了解成蚊排泄系统的调控机制。这一点至关重要，因为排泄器官的功能协调对于蚊虫在羽化后、寻找合适脊椎动物宿主获取血餐前应对干燥应激等挑战具有关键意义。

引言

昆虫通过维持体内盐分和水分的平衡，得以在多种生态和环境位点中成功生存，并利用多样的摄食策略¹。大多数昆虫已进化出机制，能够在狭窄范围内调节其血淋巴的成分，以应对特定环境带来的不同挑战²。陆生昆虫常面临保水的挑战，其排泄系统会启动抗利尿作用，防止水分和某些重要盐类的流失，从而避免脱水。相反，当昆虫摄食后面临过量水分及潜在过多盐分时，则会发生利尿作用^3,4。通过其特化且高度活跃的排泄系统，昆虫已进化出相应的调控机制，以应对渗透调节所面临的挑战。在成年埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，排泄系统由马氏管（MTs）和后肠组成，其中后肠又包括前部回肠和后部直肠⁵。马氏管负责生成原尿，其通常富含NaCl和/或KCl。原尿在沿马氏管向后流动并进入后肠的过程中，通过分泌和重吸收过程被进一步修饰⁵。最终排泄物的渗透压可高于或低于血淋巴，具体取决于摄食或环境条件，并富含毒性物质和含氮废物²。

马氏管（MTs）是研究上皮细胞液体和溶质转运多种特性的理想模型，因其可执行多种多样的转运和排泄功能

方案

1. 制作硅胶衬里培养皿

注意：此步骤应在实验前完成。这些培养皿将用于准备解剖用的检测皿以及收缩实验。

1. 按照制造商的建议，使用硅胶弹性体试剂盒制备硅胶。将双组分液体以10:1的比例混合，通过倒置容器的方式轻柔而充分地混匀，注意尽量减少气泡的产生。
2. 将硅胶弹性体倒入标准的60 mm一次性聚苯乙烯培养皿中，通常深度为7–9 mm。根据需要准备相应数量的培养皿。在倒入硅胶后，立即在显微镜下用细针去除任何气泡。将培养皿置于无尘环境或柜中，室温（RT）下静置至少48小时，或在50 °C烘箱中加热约4小时，使其固化（硬化）（图5A）。

2. 制备Ramsay测定皿

注意：培养皿可在不同实验间重复使用，因此仅当培养皿损坏或破裂时才需重复此步骤。解剖操作需使用单独的培养皿。

1. 使用手术刀（遵循标准锐器防护措施），在其中一个硅胶包被的培养皿上开凿小孔，以制备检测用培养皿。具体操作为从培养皿顶部去除约 ~5 mm 的硅胶层（此孔大小可容纳约 20 µL 浸浴液滴）。操作前，先用永久性记号笔在培养皿底部标记出需开孔的位置。各孔之间应相距约 1 cm，直径约为 4 mm，以便容纳小管远端。每个孔将放置一条分泌液体的小管，因此一个含有 20 个孔的培养皿....

结果

DH的应用₃₁ 与未刺激的MT相比，导致分泌速率显著增加，证实其作为利尿激素的作用 伊蚊 蚊子（图1A）。当小管用 AedaeCAPA-1，DH中分泌速率降低₃₁-刺激的MTs。 图1B 演示使用离子选择性电极测量 Na⁺ 分泌液滴中的浓度。DH的处理₃₁ 在微管上的 Na 没有影响⁺ 分泌液滴中的浓度；然而，随着施加 AedaeCAPA-1，Na⁺ 分泌液中的浓度显著增加。此外，与未刺激的对照组相比，DH₃₁ 导致显著更高的 Na⁺ 转运速率，而 AedaeCAPA-1 消除了 DH 的这种升高₃₁-受刺激的肾小管（图1C）。这些样本结果共同展示了如何测量利尿激素和抗利尿激素作用后分泌液的速率.......

讨论

吸血昆虫在摄取血液餐后，面临血淋巴中溶质和水分过量的挑战²。为应对这一问题，它们具有特化的排泄系统，该系统受到激素因子的严密调控，使昆虫能够迅速启动餐后利尿。拉姆齐（Ramsay）测定法结合离子选择性微电极技术，可用于测量离体昆虫马氏管中的液体分泌速率、离子浓度及离子转运速率。这些方法中的关键步骤包括确保昆虫马氏管的正确解剖。从昆虫体内逐一取出每根马氏管时必须小心操作，因为任何对马氏管的损伤都可能导致液体从破裂处漏出，或导致制备物功能丧失。Aedes 马氏管在未受刺激的对照组中不易分泌液体，因此可施加激素或药物以刺激分泌。然而，即使使用利尿剂处理或精细解剖，部分马氏管仍可能因损伤（即使肉眼无法察觉）而无法分泌，因此可能需要重复多次实验。在离子选择性微电极（ISME）和扫描离子电极技术（SIET）测量过程中，为正确使用离子选择性电极，应确保标准曲线的斜率处于该离子载体所报道的正常范围内，以获得最准确的读数。若读数不稳定，应在显微镜下检查电极，确认离子载体已充分填充且无泄漏。若电极中存在气泡、尖端破损或离子载体未正确填充，则应重新制备新电极。若离子载体与回填液界面呈凸形，则表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Fisher Scientific	14955456
35 mm 培养皿	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝） （外径 1 mm，内径 0.58 mm，长度 100 mm）	World Precision Instruments	1B100F-4	用于 ISME 参比电极
硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝） （外径 2 mm，内径 1.12 mm，长度 102 mm）	World Precision Instruments	1B200F-4	用于 SIET 参比电极
硼硅酸盐玻璃毛细管（无丝） （外径 1.5 mm，内径 1.12 mm，长度 100 mm）	World Precision Instruments	TW150-4	用于 ISME 和 SIET 电极
CO2 垫片	Diamed	GEN59-114
二甲基三甲基硅烷溶液	Sigma-Aldrich	41716
法拉第屏蔽笼	定制		可由本地机械加工车间制作
氯化铁	Sigma-Aldrich	157740
镊子（Dumont #5）	Fine Science Tools	91150-20
玻璃培养皿	Fisher Scientific	08-748A
水合矿物油	Fisher Scientific	8042-47-5	具体品牌不重要
INFINITY1-2CB 视频摄像机	Luminera	INFINITY1-2CB
显微操作器（左、右手型）	World Precision Instruments	MMJL 和 MMJR	只要为高质量操作器，具体品牌不重要
轻质矿物油	Fisher Scientific	0121-4
微型钉针（0.1 mm 不锈钢）	Fine Science Tools	26002-10
非硬化型油泥	Sargent Art		具体品牌不重要
奥林巴斯光学显微镜（用于 SIET）	Olympus	定制系统
塑料巴斯德（转移）移液管	Fisher Scientific	13-711-7M
聚-L-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL）	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
聚氯乙烯（PVC）	Sigma-Aldrich	81395
手术刀片	Fine Science Tools	10050-00
手术刀柄	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's 果蝇培养基	Sigma-Aldrich	S0146
SIET 系统	Applicable Electronics	定制系统	详情请见：http://www.applicableelectronics.com/overview
银丝	World Precision Instruments	AGW1010
钠离子载体 II 混合液 A	Fluka	99357
标准聚苯乙烯培养皿（细胞培养用）	Fisherbrand	FB012921	任何尺寸均可使用，但 60 mm 培养皿适用于解剖和检测
带目镜测微尺的体视显微镜	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown 毛细管拉制仪	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒	Dow Chemical Company	NC9285739
四氢呋喃	Sigma-Aldrich	401757
VWR 高级铝制加热磁力搅拌器	VWR	9578	具体品牌不重要