研究神经肽及其他调节因子在成年蚊子排泄系统中的活性

摘要

本方案概述了用于研究成年蚊虫排泄系统（包括马氏管和后肠）的拉姆齐测定法、离子选择性微电极、扫描离子选择性电极技术（SIET）以及体外收缩测定法，这些方法可共同用于测量离子和液体分泌速率、收缩活动以及跨上皮离子转运。

摘要

对昆虫生理学的研究，特别是在那些作为病原体传播媒介并导致人类和其他脊椎动物疾病的物种中，为开发新型害虫控制策略奠定了基础。本文描述了一系列常规用于研究神经肽及其他神经因子（如生物胺）在埃及伊蚊（Aedes aegypti）排泄系统中功能作用的方法。负责原尿形成的马氏管（MTs）在从蚊体取出后仍可维持数小时的功能，从而可在激素处理后进行液体分泌量的测定。因此，拉姆齐（Ramsay）测定法是一种用于测量离体马氏管分泌速率的有效技术。随后可使用离子选择性微电极（ISME）测定分泌液中离子浓度（如 Na⁺ 和 K⁺）。该方法可在同一时间测定多个马氏管，以评估不同激素和药物的作用效果。扫描离子选择性电极技术（SIET）利用离子选择性微电极测量离子转运器官表面静止层中代表离子活性的电压，从而近乎实时地测定跨上皮离子转运过程。该方法可用于理解激素及其他调节因子在上皮组织离子吸收或分泌过程中的作用。后肠收缩测定也是一种有效的工具，可用于表征具有肌活性的神经肽，这些神经肽可能增强或减弱该器官排出多余液体和废物的能力。总体而言，这些方法有助于深入了解成蚊排泄系统的调控机制。这一点至关重要，因为排泄器官的功能协调对于蚊虫在羽化后、寻找合适脊椎动物宿主获取血餐前应对干燥应激等挑战具有关键意义。

引言

昆虫通过维持体内盐分和水分的平衡，得以在多种生态和环境位点中成功生存，并利用多样的摄食策略¹。大多数昆虫已进化出机制，能够在狭窄范围内调节其血淋巴的成分，以应对特定环境带来的不同挑战²。陆生昆虫常面临保水的挑战，其排泄系统会启动抗利尿作用，防止水分和某些重要盐类的流失，从而避免脱水。相反，当昆虫摄食后面临过量水分及潜在过多盐分时，则会发生利尿作用^3,4。通过其特化且高度活跃的排泄系统，昆虫已进化出相应的调控机制，以应对渗透调节所面临的挑战。在成年埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，排泄系统由马氏管（MTs）和后肠组成，其中后肠又包括前部回肠和后部直肠⁵。马氏管负责生成原尿，其通常富含NaCl和/或KCl。原尿在沿马氏管向后流动并进入后肠的过程中，通过分泌和重吸收过程被进一步修饰⁵。最终排泄物的渗透压可高于或低于血淋巴，具体取决于摄食或环境条件，并富含毒性物质和含氮废物²。

马氏管（MTs）是研究上皮细胞液体和溶质转运多种特性的理想模型，因其可执行多种多样的转运和排泄功能^2,6。通过激素调节²，马氏管将离子及其他溶质从血液中分泌至管腔内⁷，形成渗透梯度，使水分子通过水通道蛋白（aquaporins）进行转运^8,9，共同形成原尿，随后原尿流向具有重吸收功能的后肠²。因此，通过收集离体马氏管分泌的液体，可连续监测跨上皮的液体和离子转运过程。测量分泌速率和尿液成分有助于揭示介导跨上皮离子和液体转运的机制。研究液体分泌速率的一种常用方法是Ramsay法，该方法由Ramsay于1953年首次提出¹⁰。在此方法中，将马氏管远端（封闭端）暴露于激素（或其他测试化合物/药物）中，而近端（开放端）则缠绕在浸润了水饱和石蜡油的针头上，分泌出的原尿在针尖处聚集成液滴。在优化的体外条件下，离体马氏管可长期存活并保持功能（长达24小时），使其成为测量液体分泌的合适且高效的模型。昆虫具有开放的循环系统，因此马氏管通常自由漂浮于血淋巴中，易于解剖和取出⁶。此外，除蚜虫缺乏马氏管¹¹外，不同昆虫物种的马氏管数量差异较大，可从四条到数百条不等（例如，伊蚊（Aedes）有五条），从而允许从单个昆虫中进行多次测量。

Aedes蚊虫的马氏管与其他内变态昆虫类似，由两种细胞组成简单的上皮结构^2,12：较大的主细胞负责将阳离子（如Na⁺和K⁺）主动转运至管腔，以及较薄的星形细胞，其有助于跨上皮的Cl^-分泌¹³。马氏管无神经支配²，而是受多种激素调控，包括利尿和抗利尿因子，从而调节离子转运（主要是Na⁺、K⁺和Cl^-）以及伴随的渗透性水分运输²。已有大量研究探讨了Aedes马氏管的激素调控机制，以阐明内分泌因子在跨上皮转运中的作用^{14,15,16,17,18}。如代表性结果所示，本文所述实验方案展示了不同激素因子对成年雌性埃及伊蚊（A. aegypti）分离马氏管的作用，包括利尿和抗利尿调控（图1）。通过Ramsay法测定表明，抗利尿激素AedaeCAPA-1可抑制由利尿激素31（DH₃₁）刺激的马氏管液体分泌（图1）。

由于昆虫体型较小，需要开发微型方法来测量体液样本中或马氏管（MTs）和肠道等分离组织表面附近的离子活性和离子浓度。已采用多种方法，包括使用离子的放射性同位素¹⁹，该方法需收集分泌的液滴以测定离子浓度²⁰。Aedes 蚊虫离体马氏管在刺激状态下通常以约 0.5 nL/min 的速率分泌液体²¹，因此处理如此微量的液体可能带来操作困难，并在转移过程中引入误差。为此，离子选择性微电极（ISMEs）已被广泛用于体外测定马氏管分泌液滴中的离子浓度²²。本实验方案改编自 Donini 及其同事的方法²³，使用 Na⁺ 选择性离子载体来测定成年 Aedes 蚊虫受刺激马氏管分泌液滴中的离子活性。由于离子选择性微电极测量的是离子活性，若假设校准溶液与实验样品具有相同的离子活度系数，则可将测得数据表示为离子浓度²¹（图 1B,C）。

扫描离子选择性电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）也利用离子选择性微电极（ISMEs）来测量器官、组织或细胞附近静止层中离子浓度梯度，这些器官、组织或细胞正处于离子转运过程中。ISMEs测量电压梯度，进而可用于计算离子浓度梯度以及离子跨器官、组织或细胞的转运方向和通量大小²⁰。在该技术中，ISME被安装在由计算机控制的微步进电机驱动的三维操纵器上，从而实现对其三维位置的微米级精确控制²⁰。电压在静止层内的两个点进行测量，采样程序由计算机软件编程并控制。这两个点之间的距离通常为20–100 µm，其中一个点位于器官、组织或细胞表面5–10 µm范围内，另一个点则再远20–100 µm。通过计算两点间电压值的差异，获得电压梯度^24,25,26，再据此推算出浓度梯度，并进一步依据菲克定律（Fick’s Law）计算净离子通量^24,27。该方法适用于评估特定离子在昆虫肠道和马氏管不同区域的转运情况，或在吸血后或暴露于特定处理后的特定时间点的转运动态。例如，SIET可用于研究激素²⁸以及不同摄食行为和饲养条件²⁵如何调控蚊虫排泄系统的吸收与分泌过程。先前应用SIET的研究已揭示了幼虫和成虫蚊子肛乳突及直肠中参与离子转运的位点^24,28。本实验方案此前由Paluzzi及其同事描述²⁶，用于测量成年雌蚊直肠垫上皮中的Na⁺通量（图2）。

蚊虫排泄系统的末端需要协调的肌肉运动，以帮助混合食物并分泌废物²⁶。中肠消化后产生的不可吸收产物，连同马氏管（MTs）分泌的原尿，经幽门瓣进入后肠²。后肠的自发性收缩起始于幽门瓣，并以蠕动波的形式传播，通过环绕上皮细胞基底面的环形肌和纵行肌的协调收缩，将收缩信号传递至回肠²⁶。最后，直肠内的肌肉有助于推动并经肛道排出废物。尽管昆虫后肠的运动具有肌源性特征，依赖细胞外Ca²⁺产生自发性收缩，但这些过程也可受到神经系统的调控^26,29,30。神经系统对外源性调控在摄食后尤为重要，因为动物必须将肠道废物排出，并恢复血淋巴的平衡³¹。因此，开展体外生物测定以鉴定促肌活性或抑肌活性的神经肽，对于评估神经化学物质如何影响后肠运动具有重要意义。本方案由Lajevardi和Paluzzi²⁸建立，采用视频记录技术观察回肠对神经肽刺激的运动反应（图3）。类似地，也可使用力传感器或阻抗转换器，结合数据采集软件记录收缩轨迹^32,33。然而，视频技术使我们能够直观地评估器官活动，并利用一系列参数进行进一步分析，从而明确激素在后肠运动中的作用。

采用这些技术有助于表征调控和协调排泄系统中液体与离子转运以及后肠蠕动的因素。重要的是，马氏管的利尿反应与后肠蠕动之间存在功能联系：一些利尿激素（如 DH₃₁ 和 5HT）已被证实能够刺激马氏管的液体分泌，同时也被发现可在蚊子后肠中表现出肌活性作用^21,34,35。这些发现凸显了在需要快速排泄废物的昆虫中，例如餐后利尿期间，马氏管与后肠之间严格协调的重要性。

本文详细描述了拉姆齐测定法（Ramsay assay）用于测量埃及伊蚊（A. aegypti）体液分泌速率的技术，以及利用离子选择性微电极测定马氏管（MTs）分泌液中 Na⁺ 浓度的方法；将这两种方法结合，可推算出跨上皮离子转运速率。此外，还介绍了扫描离子选择性电极技术（SIET）和后肠收缩测定法，分别用于测量离子流和运动性，有助于阐明后肠的激素调控机制（图4）。

方案

1. 制作硅胶衬里培养皿

注意：此步骤应在实验前完成。这些培养皿将用于准备解剖用的检测皿以及收缩实验。

1. 按照制造商的建议，使用硅胶弹性体试剂盒制备硅胶。将双组分液体以10:1的比例混合，通过倒置容器的方式轻柔而充分地混匀，注意尽量减少气泡的产生。
2. 将硅胶弹性体倒入标准的60 mm一次性聚苯乙烯培养皿中，通常深度为7–9 mm。根据需要准备相应数量的培养皿。在倒入硅胶后，立即在显微镜下用细针去除任何气泡。将培养皿置于无尘环境或柜中，室温（RT）下静置至少48小时，或在50 °C烘箱中加热约4小时，使其固化（硬化）（图5A）。

2. 制备Ramsay测定皿

注意：培养皿可在不同实验间重复使用，因此仅当培养皿损坏或破裂时才需重复此步骤。解剖操作需使用单独的培养皿。

1. 使用手术刀（遵循标准锐器防护措施），在其中一个硅胶包被的培养皿上开凿小孔，以制备检测用培养皿。具体操作为从培养皿顶部去除约 ~5 mm 的硅胶层（此孔大小可容纳约 20 µL 浸浴液滴）。操作前，先用永久性记号笔在培养皿底部标记出需开孔的位置。各孔之间应相距约 1 cm，直径约为 4 mm，以便容纳小管远端。每个孔将放置一条分泌液体的小管，因此一个含有 20 个孔的培养皿可在单次实验中最多分析 20 条中肠小管（MTs）。
2. 准备微型固定针时，将直径 0.1 mm 的不锈钢针平行排列于标签胶带上，方向垂直于胶带长轴。使用剪刀沿胶带长度方向剪开，将每根针切成两等份。每个孔使用半根针。
3. 使用钝头镊子，将每半根针插入硅胶包被的检测培养皿中，置于各孔旁侧。根据昆虫小管的长度，调整半根针的插入位置，使小管远端可浸入灌流盐溶液中，而近端则能缠绕在针上。此步骤可在显微镜下进行，以便清晰观察孔位。这些针可重复使用，但若针损坏或丢失，需及时更换。（图 5B）

3. 制备聚-L-赖氨酸包被的SIET培养皿

注意：此步骤对于在SIET测量期间确保器官粘附在培养皿底部至关重要，从而保证每个样本的测量位点保持一致。这些培养皿的制备应至少在实验前两天完成。每个培养皿仅可使用一次，用于施加特定处理。每次使用后或聚-L-赖氨酸涂层被刮伤或损坏时，应立即丢弃。

1. 每个样本均需将一个35 mm的培养皿置于水平表面上。取下皿盖，用移液器将70 µL聚-L-赖氨酸（0.1 mg/mL）滴加至每个培养皿中央。重新盖上皿盖，静置使聚-L-赖氨酸自然干燥（约48 h）。
2. 待干燥后，在培养皿底部用记号笔标记出干燥的聚-L-赖氨酸涂层轮廓，以便更清晰地指示解剖后待移植器官的放置位置。若实验中需尽量减少生理盐水和处理溶液的用量，可使用热熔胶枪围绕聚-L-赖氨酸涂层边缘涂一圈胶，留出足够空间以便电极移动并进行背景信号测量（胶圈直径约20–25 mm即可）。这些包被的培养皿可在室温下长期保存（图5C）。

4. 为实验准备Ramsay和收缩实验培养皿

注意：只要进行适当的清洗以去除先前使用的生理盐水/处理物，该培养皿可重复使用，因此仅当培养皿损坏或破裂时才需重复此步骤。解剖过程使用单独的培养皿。此步骤在实验当天进行。

1. 对于收缩实验培养皿，使用手术刀（遵循标准锐器安全操作规程），在其中一个硅胶涂层培养皿上打孔以制备实验用培养皿。将手术刀倾斜，使孔洞呈三角形，以便将解剖得到的组织固定在边缘。孔洞应足够大，可容纳最多250 µL液体，并能容纳整个消化道（不要挖得过深，应将孔扩大至约0.5–1 cm）（图5D）。
2. 对于Ramsay实验板，使用移液器将每个孔加液至20 µL（含步骤5.2中配制的18 µL 1X Aedes生理盐水:Schneider’s培养基，以及2 µL激素或药物）。对于未刺激的对照组，每个孔加入20 µL的1X Aedes生理盐水:Schneider’s培养基。所有孔加液完成后，向实验培养皿中倒入水合矿物油，直至孔洞和微型图钉完全浸没。使用20 µL移液器吸头戳破或移除可能干扰分泌液滴的气泡。

5. 溶液的配制

1. 按照表1所述方法（改编自Petzel及其同事³⁶）配制2X Aedes aegypti 生理盐水和10X葡萄糖。储备液应保存于4 °C。实验时用2X储备液配制1X Aedes aegypti 生理盐水工作液（表1），并保存于4 °C。实验当天使用前将其恢复至室温。若发现真菌或细菌生长迹象，应重新配制新鲜溶液。
2. 为制备浴液液滴，将步骤5.1中获得的Aedes生理盐水与Schneider's培养基按1:1比例混合。根据实际需要量分装成小份。Schneider's培养基应存放于冰箱中，若出现真菌或细菌污染迹象则应弃用。（此步骤应在实验当天进行）。
3. 若使用SIET进行Na⁺流速测定，请参照先前描述²⁶的方法配制改良的无Ca²⁺ Aedes生理盐水（表2）。

6. 蚊子中肠和后肠的解剖

1. 进行成蚊解剖时，将蛹收集于小烧杯中，并放入含有蔗糖溶液的容器内以供喂养。为确定蚊虫年龄，需将羽化的蚊虫单独隔离，并置于不同的容器中，记录其年龄和性别，以备后续解剖使用。
2. 将待解剖的蚊虫短暂置于CO₂麻醉垫上，待其失去反应。使用精细镊子夹住蚊虫的腿部或翅膀，将其放置于步骤1中准备好的硅胶弹性体包被的解剖皿上。将蚊虫侧放（侧面向上），用显微钉针刺入胸部以固定蚊虫。可选择性地去除蚊虫的翅膀和腿部，以便于解剖操作。
3. 使用巴斯德吸管滴加一滴室温Aedes生理盐水，使蚊虫完全浸没于盐溶液中。确保整个解剖过程均在生理盐水中进行（配制Aedes生理盐水的方法见表1）。
4. 将解剖皿置于体视显微镜下。用精细镊子夹住腹部最末一节，缓慢将其从蚊体上拉开。此步骤需同时在显微镜下观察以辅助操作。中肠连同马氏管（MTs）和后肠应随之暴露出来（图6）。
5. 进行Ramsay测定实验时，需小心地从后肠与中肠连接处逐个分离马氏管，注意避免损伤器官。使用锋利的精细镊子逐一取下马氏管——不得使用任何受损的马氏管进行测定。（测定装置设置详见步骤7。）
6. 进行SIET实验时，需在无Ca²⁺的Aedes生理盐水中解剖后肠（步骤5.3）。确保聚-L-赖氨酸包被的解剖皿中也含有固定体积的无Ca²⁺ Aedes生理盐水。小心去除直肠部位的角质层，并将后肠（可根据测量需求去除其他附着器官）放入聚-L-赖氨酸包被的解剖皿中。若需测量直肠垫上皮的离子转运，应确保至少一个直肠垫的血淋巴面朝向微电极，以便检测（图7）。
   1. 用镊子夹住后肠最尾端，将其轻柔地移至解剖皿底部（避免损伤待测结构）。一旦器官接触聚-L-赖氨酸涂层表面，即会牢固黏附。此解剖样本已准备好用于测量。（SIET装置设置与测量步骤详见步骤14–16。）
7. 进行回肠收缩实验时，解剖过程中需确保后肠仍与中肠相连（图4D）。小心去除马氏管，以便清晰观察后肠。该器官将被转移至按步骤4.1准备的新解剖皿中。（获取实验视频的方法详见步骤17。）

7. 建立Ramsay检测法

1. 用镊子尖端轻轻提起小管近端（开口端），将小管搭在镊子上（切勿夹捏小管），然后转移至检测培养皿的孔中。此步骤也可使用精细玻璃探针完成。
2. 当小管浸入孔中后，用镊子夹住小管近端，将其从小管浸泡液滴中取出，并将末端缠绕在针上。将小管在针上缠绕两圈，并保持留在浸泡液滴中的小管长度与其他小管一致。此时，小管远端应位于浸泡液滴中，而近端则缠绕在远离液滴的针上，使分泌的液体从小管开口的近端流出并积聚在针尖。
3. 小管缠绕到针上后，立即记录孔位（如 A、B、C）、时间（即液体开始从小管分泌的起始时间）以及其他识别信息（如激素、基因型等）。
4. 每只蚊子有五条小管，因此需对剩余小管重复步骤 7.1–7.3。对于对照和实验处理组，应将五条小管分配至不同处理组中。继续进行下一次解剖，直至整个检测培养皿填满。经过练习后，该技术通常可在 2–3 分钟内完成小管的解剖、转移至浸泡生理盐水并缠绕到针上的操作，从而使得每条小管的起始时间相差 2–3 分钟。
   注意：实验开始前，需使用台式显微测微尺在所选物镜下校准显微镜的目镜测微尺。分泌液滴通常在 40x–50x 总放大倍数下进行测量。
5. 经过设定的孵育时间后，可对分泌的液滴进行测量。使用显微镜的目镜测微尺测量并记录分泌液滴的直径。通过将测得的目镜单位直径乘以校准换算系数（表 3），计算分泌液滴的直径（d）。使用公式 V = πd³/6 计算分泌液滴的体积。
6. 为计算分泌速率（nL min^-1），使用公式：液体分泌速率 = V / 分泌时间，其中 V 为步骤 7.5 中计算出的分泌液滴体积，分泌时间指小管的孵育时间。

8. ISME 装置设置

1. 将显微操作器放置在体视显微镜两侧，以搭建 ISME 站点。通过将银丝浸入氯化铁溶液中进行氯化处理，并将每根银丝穿入各自的微电极夹持器中（如有需要，可将导线焊接到同轴电缆上）。当银丝失去氯化层时，需重复此步骤。
2. 将银丝连接至放大器，放大器将信号传递至数据采集系统。根据制造商的说明设置并校准系统。若出现较强的电干扰，应使用正确接地的法拉第笼。

9. 为ISME和SIET准备微电极

1. 使用 P-97 Flaming Brown 拉针仪，将约 5–6 根无丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm，内径 1.12 mm，长度 100 mm）拉制成尖端直径为 1–5 µm 的微电极。这些微电极将用作离子选择性微电极。对于 SIET 微电极，最终电极尖端开口应约为 5 µm，并具有较短的杆部结构。
2. 在通风橱内，将微电极小心放置于加热板上（注意轻放，避免损坏电极尖端）。在直径 15 cm 的玻璃培养皿中加入二氯二甲基硅烷，并将其倒扣在加热板上的电极上方。利用二氯二甲基硅烷对离子选择性微电极进行硅烷化处理，使其表面覆盖一层疏水性涂层，从而能够保留疏水性离子载体³⁷。未使用的硅烷化电极可保存数周，因此该步骤每数周执行一次，或在新拉制电极时进行。
   注意：操作二氯二甲基硅烷时需谨慎——该物质易燃、腐蚀性强且有毒，安全操作请参见材料安全数据表（MSDS）。
   1. 将加热板温度调至 350 °C，持续加热 75 分钟。微电极数量与所加二氯二甲基硅烷体积（µL）的比例应为 1:2。例如，对于 10 根微电极，应加入 20 µL 二氯二甲基硅烷。
3. 75 分钟后，关闭加热板。待电极和加热板冷却后，移除玻璃培养皿，并用镊子将电极转移至装有成型黏土的储存盒中。确保电极尖端朝上，以防损坏。
4. 制备 ISME 参比电极时，需拉制约 4–5 根带丝硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm，长度 100 mm）。这些电极无需进行硅烷化处理。标记后存放在类似的盒子中，注意避免尖端受损。
5. SIET 参比电极由标准玻璃毛细管（外径 2 mm，内径 1.12 mm，长度 102 mm）制成。毛细管内填充熔融的 1 M KCl + 3% 琼脂，使用前应保存在含有 1 M KCl 溶液的 50 mL 离心管中（完全浸没）。只要未出现气泡或琼脂断裂，即可重复使用。若存在任何气隙，应丢弃该玻璃管并更换新的，以确保电路完整。

10. 准备回填注射器

注意：此步骤旨在制备细尖注射器，用于ISME电极的反向填充。

1. 使用带有一次性针头的1 mL无针座注射器。丢弃针头，向后拉动注射器活塞至1 mL刻度处。在通风橱内打开本生灯，加热注射器塑料尖端直至其开始熔化。使用一把旧镊子小心夹住熔化的注射器尖端并向下拉伸，使其延长。
2. 使用剪刀将熔化的尖端剪至所需长度，保留足够小的直径以便插入电极内部（见示意图）。待注射器冷却后，用水测试其压力，确保无堵塞。根据所需每种反向填充溶液分别制作一支，并相应标记（图8）。

11. ISME 和 SIET 用离子选择性微电极和参比微电极的填充

注意：只要微电极仍能正常工作，便可重复使用（每次实验前需进行校准）。对于ISME，此步骤可在MTs于Ramsay实验中孵育的同时进行。

1. 要配制 Na⁺-选择性微电极，使用步骤10中制备的1 mL注射器，用100 mM NaCl溶液反向填充电极。确保填充液充满至电极尖端。若出现气泡，可轻轻敲击微电极，或吸出溶液后重新填充。操作过程应在体视显微镜下进行，以便更清晰地观察。
2. 在体视显微镜下，将10 µL移液器吸头浸入Na⁺选择性离子载体溶液。将电极垂直对准移液管，用戴手套的手指堵住尖端底部以产生压力，挤出少量离子载体液滴。在显微镜高倍物镜下观察，小心地将离子载体液滴接触微电极尖端，避免损坏尖端。通常，微电极采用正向填充法，填充离子载体混合液的柱长为150–300 µm，直至离子载体与后充溶液的界面呈平坦状态。
   警告：该离子载体具有毒性，安全操作请参阅材料安全数据表（MSDS）。
3. 在小烧杯中加入100 mM NaCl溶液至半满，并在烧杯内壁顶部放置一些模型黏土。待Na⁺ 离子载体被充分吸收后，将电极尖端朝下放置于烧杯壁上，使尖端浸入100 mM NaCl溶液中，并将ISME保留在烧杯内直至使用。
4. 制备ISME参比电极时，用500 mM KCl溶液填充电极，确保溶液充满至尖端（操作步骤同上）。将KCl溶液储存在烧杯中。

12. ISME 电极的校准

注意：此步骤应在测量分泌液之前立即进行（约在测量前 10–15 分钟）。为确保斜率一致，应每进行约 5–6 次测量后进行一次校准。

1. 使用约3.5%（w/v）聚氯乙烯溶于四氢呋喃的溶液涂覆电极尖端，以防止电极浸入石蜡油时离子载体发生位移。
   注意：该溶液易燃，请参阅材料安全数据表（MSDS）以获取安全操作说明。
2. 校准Na⁺电极时，将以下NaCl标准溶液各10 µL滴加到含有孵育后马氏管的Ramsay培养皿边缘：200 mM NaCl，以及20 mM NaCl + 180 mM LiCl。将标准液滴间隔约2 cm放置，浓度较高者置于上方。
3. 将参比电极和离子选择性电极分别插入氯化银丝中，并使用连接在显微操作器上的电极夹具牢固固定。利用显微操作器将两个电极移至200 mM NaCl液滴上方，确保电极尖端不接触培养皿底部。开启静电计开始记录，并等待读数稳定。
4. 记录读数后，继续测量下一个标准液（20 mM NaCl + 180 mM LiCl）。计算电极斜率，若读数稳定且斜率在正常范围内，则可使用该电极进行分泌液滴的测量。若读数不稳定、无法获得有效记录或斜率异常，或平衡时间过长，可更换新的离子选择性电极，或用纸巾轻轻擦拭参比电极尖端以去除最末端的堵塞物。Na⁺电极的理论斜率应约为58–60 mV³⁸，可接受范围为50–60 mV。

13. ISME 记录与计算

1. 在测量液体分泌速率后（见步骤 7.7），使用显微操作器小心地将参比电极和离子选择性电极移入分泌的液滴中。开启记录，待读数稳定后记录数值。对其他液滴重复此步骤（每约 5–6 次测量后重复一次校准）。
2. 阳离子浓度的计算采用先前描述的公式^22,38：[ion] = [C] × 10^ΔV/m，其中 [C] 为用于校准 ISME 的校准溶液浓度（单位：mmol L^-1），ΔV 为分泌液滴测得电压与同一校准溶液电压之间的差值，m 为两次标准校准之间的电压差，即校准曲线的斜率。

14. SIET 设置

注意：SIET 系统此前已有描述^27,39。为降低背景噪声，在光学显微镜和前置放大器周围安装了法拉第笼。本文所展示的实验使用自动扫描电极技术（ASET）2.0 软件的以下设置：微电极移动后，设置 4 秒等待时间以使离子梯度充分恢复，随后记录 0.5 秒的电压，偏移距离为 100 µm，每次记录重复三次。根据需要，ASET 中的某些设置可由用户自行修改。

1. 开启 IPA-2 离子/极谱放大器、配备视频摄像机的光学显微镜，以及连接这些设备并运行 ASET 和 cellSens 软件的计算机。
2. 制备步骤 9.1–9.3、9.5、10 和 11.1–11.3 中所述的微电极和参比电极。钠离子选择性微电极内含 Na⁺ 离子载体，并以 100 mM NaCl 溶液反向填充；参比电极（带琼脂桥）始终填充 3 M KCl 溶液。
3. 将 Na⁺ 选择性微电极安装至含有银/氯化银（AgCl）导线的电极夹持器上，并将其连接至母接头插座。使用注射器将新鲜的 3 M KCl 溶液注入参比电极夹持器中（该溶液可在实验前配制并室温保存）。
   注意：实验结束后，需用 ddH₂O 清洗参比电极夹持器。
4. 从盛有全部参比电极并浸没于 3 M KCl 溶液的烧杯中取出一支参比电极，用一根手指抵住一端，并将玻璃毛细管向该端倾斜，以防止琼脂滑出。小心地将一端插入夹持器中，确保无气泡产生。若出现气泡，应取出参比电极，向夹持器中补充更多 3 M KCl 溶液后重复操作。将电极夹持器插入母接头插座中。

15. SIET电极的校准

1. 进行 Na⁺ 测定时，使用 150 mM NaCl 溶液和 15 mM NaCl + 135 mM LiCl 溶液²⁴。两种溶液之间的 Na⁺ 浓度应相差 10 倍，涵盖生理盐水中 Na⁺（20 mM）的浓度范围（表 2）。
2. 将校准液在室温下储存于 50 mL 离心管中，实验时分装至培养皿中使用。当日实验结束后弃去剩余校准液。若发现储备液存在污染迹象，应立即丢弃并重新配制新鲜溶液。
3. 校准操作时，将两种校准液（步骤 15.1）分别分装至独立的 35 mm 培养皿中，并置于显微镜载物台上。通过计算机运动控制单元选择“禁用”状态后，使用手动调节旋钮控制步进电机，确保微电极尖端置于校准液中。注意不要将电极尖端浸入过深，以免折断。若尖端断裂，需重新制备离子选择性微电极并重新校准。
   1. 在连接放大器的计算机上打开 ASET 软件，进入校准设置界面。选择校准类型为 能斯特斜率，设置采样时间为 3 秒，并输入两种校准液的浓度。例如，进行 Na⁺ 测定时，在溶液 1 中输入 150 mM，将 Na⁺ 选择性微电极尖端和参比电极浸入该校准液中。此时放大器上的电压读数应保持稳定。点击 溶液 1，等待电压（单位：mV）被记录。随后，将微电极和参比电极移入 15 mM NaCl + 135 mM LiCl 溶液中，在溶液 2 中输入 15 mM，点击 溶液 2 以获取电压读数。软件将自动计算这两个电压之间的差值作为校准斜率。完成校准后，点击 确定。
   2. 对于 Na⁺ 选择性微电极，在离子浓度变化十倍时，其斜率应约为 59.0 ± 1.6²⁴。若测得的能斯特斜率显著偏离此范围，应重新制备微电极或更换新的标准溶液（可能已受污染）。每次测定前需对每 2–3 个样品进行一次校准，具体频率取决于电压稳定性。若电压变得不稳定并出现波动，应重新制备离子选择性微电极。

16. SIET 测量

注意：除通过 ASET 使用计算机按键操控电极或进行测量记录时（此时应将开关切换至启用状态）外，计算机运动控制单元上的电机开关应始终保持在禁用状态。

1. 校准完成后，解剖器官（参见步骤 6.6）。将含有已解剖样本的多聚-L-赖氨酸培养皿置于显微镜载物台上，并将参比电极的尖端插入生理盐水中。小心地将离子选择性微电极的尖端浸入生理盐水中，注意不要损坏尖端。
2. 在光学显微镜下观察，使用手动调节旋钮调整微电极的位置。调节微电极的垂直位置，使其尖端与器官或组织处于同一平面。到达理想位置后，将电机开关切换至启用状态。此时，步进电机只能通过计算机软件进行操作。
3. 使用计算机方向键将微电极水平移动至距离组织 3 mm 的位置，以测量背景信号。按下F2键添加注释。准备就绪后，开始记录（按下F5键）。获取五次背景活性的测量值。每个样本的平均背景电压值将从该样本沿组织测得的电压梯度中扣除。
4. 将微电极尖端移回靠近组织的位置，注意不要刺穿器官。降低按键灵敏度，将微电极尖端精确移至距离组织右侧垂直方向 2 µm 处。沿直肠垫的每个位点获取三次记录，以确定离子活性最强的位点。在显示最大活性的位点（即“热点”位点）获取基础生理盐水测量值。
5. 将电机切换至禁用状态，并向培养皿中加入适当的处理试剂，以达到最终所需剂量。施加处理后，创建新的注释（例如处理名称和剂量），将电机重新切换至启用状态，并使用F5键进行电压记录。若目标是观察随时间的变化，应继续在特定时间间隔进行测量。研究人员可根据研究目的，利用SIET建立多种不同的实验方案。
6. 观察ASET软件记录组织位点处的电压，并减去距离组织 100 µm 处（图7）的电压值。由于第一次记录位于组织表面，若电压差为正值，表明上皮（组织）处的电压高于远离上皮的位置（图7A 与 图7B），即阳离子正在被吸收；而负电压梯度则表明阳离子正在分泌。
7. 处理后再次获取背景记录（距离 3 mm），并在计算处理后的离子流时使用这些数据。分别在“基线”状态和处理后各获取一组背景记录。当不使用计算机按键调节微电极或不进行电压记录时，应将电机切换至禁用状态。将数据导出为文本文件，并使用 Excel 打开以进行所有计算。
8. 使用先前所述的公式^24,26计算离子流。每种处理的净离子流可表示为相对于基线离子流测量值的绝对变化量。为验证结果的显著性，可设置溶剂对照组（即仅向培养皿中加入生理盐水而不加处理试剂）。激素处理后离子转运的变化应与该对照组引起的反应变化进行比较评估。

17. 后肠收缩实验

1. 用已知体积的 Aedes 生理盐水（步骤 5.1）填充步骤 4.1 中所述培养皿的一个孔。解剖完成后（步骤 6.7），小心地将附着于中肠的解剖后后肠转移至另一培养皿的孔中，注意不要夹住待观察的器官（回肠）。将肠道完全浸入孔内的生理盐水中，并用钟表镊针固定中肠和直肠。如此操作可确保回肠不受张力，应能观察到从前部回肠的幽门瓣起始的自发性收缩。
2. 将视频相机连接至体视显微镜，并使用视频采集软件（例如 Luminera 的 INFINITY CAPTURE）进行录像。将含有解剖后器官的培养皿置于显微镜下，录制 2 分钟视频。此为“基线”条件。
3. 向孔中加入已知体积的 1X Aedes 生理盐水（步骤 5.1），以排除因孔内液体体积增加而对回肠运动性造成的影响。加样后等待 1 分钟，再次录制 2 分钟视频。此为“生理盐水”条件。
4. 加入已知体积的处理液（由 10 倍储备液稀释至孔中达到所需终浓度）。加样后等待 1 分钟，再次录制 2 分钟视频。此为“处理”条件。
5. 保存所有视频并转换为 MP4 格式。进行分析时，统计 2 分钟时间段内的收缩次数（定义为始于幽门瓣并沿整个回肠传播的蠕动波），将该数值除以 2 分钟，得到收缩频率。也可评估其他参数，如收缩或舒张持续时间。原始数据收集完成后，将每个样本的各项参数相对于其“基线”条件下的数值进行归一化处理。绘制“生理盐水”和“处理”条件相对于“基线”的倍数变化图。

结果

将DH₃₁作用于未受刺激的马氏管（MTs）可显著提高液体分泌速率，证实了其在伊蚊（Aedes）中作为利尿激素的作用（图1A）。当马氏管经AedaeCAPA-1处理后，在DH₃₁刺激的马氏管中观察到分泌速率下降。图1B展示了使用离子选择性电极测定分泌液滴中Na⁺浓度的方法。对马氏管施加DH₃₁处理后，分泌液滴中的Na⁺浓度未发生改变；然而，加入AedaeCAPA-1后，分泌液中的Na⁺浓度显著升高。此外，与未受刺激的对照组相比，DH₃₁显著提高了Na⁺的转运速率，而AedaeCAPA-1则消除了DH₃₁刺激马氏管中该速率的升高（图1C）。综上所述，这些示例结果展示了如何测定利尿激素和抗利尿激素作用...

讨论

吸血昆虫在摄取血液餐后，面临血淋巴中溶质和水分过量的挑战²。为应对这一问题，它们具有特化的排泄系统，该系统受到激素因子的严密调控，使昆虫能够迅速启动餐后利尿。拉姆齐（Ramsay）测定法结合离子选择性微电极技术，可用于测量离体昆虫马氏管中的液体分泌速率、离子浓度及离子转运速率。这些方法中的关键步骤包括确保昆虫马氏管的正确解剖。从昆虫体内逐一取出每根马氏管时必须小心操作，因为任何对马氏管的损伤都可能导致液体从破裂处漏出，或导致制备物功能丧失。Aedes 马氏管在未受刺激的对照组中不易分泌液体，因此可施加激素或药物以刺激分泌。然而，即使使用利尿剂处理或精细解剖，部分马氏管仍可能因损伤（即使肉眼无法察觉）而无法分泌，因此可能需要重复多次实验。在离子选择性微电极（ISME）和扫描离子电极技术（SIET）测量过程中，为正确使用离子选择性电极，应确保标准曲线的斜率处于该离子载体所报道的正常范围内，以获得最准确的读数。若读数不稳定，应在显微镜下检查电极，确认离子载体已充分填充且无泄漏。若电极中存在气泡、尖端破损或离子载体未正确填充，则应重新制备新电极。若离子载体与回填液界面呈凸形，则表...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Fisher Scientific	14955456
35 mm 培养皿	Corning Falcon (Fisher Scientific)	C351008
硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝） （外径 1 mm，内径 0.58 mm，长度 100 mm）	World Precision Instruments	1B100F-4	用于 ISME 参比电极
硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝） （外径 2 mm，内径 1.12 mm，长度 102 mm）	World Precision Instruments	1B200F-4	用于 SIET 参比电极
硼硅酸盐玻璃毛细管（无丝） （外径 1.5 mm，内径 1.12 mm，长度 100 mm）	World Precision Instruments	TW150-4	用于 ISME 和 SIET 电极
CO2 垫片	Diamed	GEN59-114
二甲基三甲基硅烷溶液	Sigma-Aldrich	41716
法拉第屏蔽笼	定制		可由本地机械加工车间制作
氯化铁	Sigma-Aldrich	157740
镊子（Dumont #5）	Fine Science Tools	91150-20
玻璃培养皿	Fisher Scientific	08-748A
水合矿物油	Fisher Scientific	8042-47-5	具体品牌不重要
INFINITY1-2CB 视频摄像机	Luminera	INFINITY1-2CB
显微操作器（左、右手型）	World Precision Instruments	MMJL 和 MMJR	只要为高质量操作器，具体品牌不重要
轻质矿物油	Fisher Scientific	0121-4
微型钉针（0.1 mm 不锈钢）	Fine Science Tools	26002-10
非硬化型油泥	Sargent Art		具体品牌不重要
奥林巴斯光学显微镜（用于 SIET）	Olympus	定制系统
塑料巴斯德（转移）移液管	Fisher Scientific	13-711-7M
聚-L-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL）	Sigma-Aldrich	A-005-M	84 kDa
聚氯乙烯（PVC）	Sigma-Aldrich	81395
手术刀片	Fine Science Tools	10050-00
手术刀柄	Fine Science Tools	10053-09
Schneider's 果蝇培养基	Sigma-Aldrich	S0146
SIET 系统	Applicable Electronics	定制系统	详情请见：http://www.applicableelectronics.com/overview
银丝	World Precision Instruments	AGW1010
钠离子载体 II 混合液 A	Fluka	99357
标准聚苯乙烯培养皿（细胞培养用）	Fisherbrand	FB012921	任何尺寸均可使用，但 60 mm 培养皿适用于解剖和检测
带目镜测微尺的体视显微镜	Nikon	SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown 毛细管拉制仪	Sutter Instruments	FGPN7
Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒	Dow Chemical Company	NC9285739
四氢呋喃	Sigma-Aldrich	401757
VWR 高级铝制加热磁力搅拌器	VWR	9578	具体品牌不重要