本方案介绍了一种利用去细胞化大鼠肾脏制备支架的方法。该方案包括去细胞化和再细胞化过程，以验证其生物可利用性。去细胞化过程使用Triton X-100和十二烷基硫酸钠进行。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
组织工程是生物医学领域的一门前沿学科。细胞培养技术可用于再生功能性组织和器官，以替代病变或受损的器官。在体内利用分化干细胞构建三维器官或组织时，需要支架材料来提供支持。本研究中，我们描述了一种利用去细胞化大鼠肾脏开发血管化支架的新方法。实验选用8周龄的Sprague-Dawley大鼠，向心脏注射肝素以促进其流入肾血管，使肝素灌注至肾血管系统。打开腹腔后，采集左肾。采集的肾脏使用Triton X-100和十二烷基硫酸钠等去污剂灌注处理9小时，以实现组织去细胞化。随后，用1%青霉素/链霉素溶液和肝素轻柔冲洗去细胞化肾脏支架，以清除细胞碎片和化学残留物。将干细胞移植至去细胞化血管支架有望促进新器官的形成。因此，这种血管化支架未来可能为器官移植物的组织工程提供重要基础。
引言
细胞培养技术可用于再生功能性组织和器官，以替代病变或受损的器官。目前，同种异体器官移植是治疗不可逆器官损伤最常用的方法；然而，该方法需要使用免疫抑制剂来防止移植器官被排斥。此外，尽管移植免疫学已取得进展，但在移植后5年内，约20%的移植受者可能出现急性排斥反应，而在移植后10年内，约40%的受者可能失去移植器官或死亡1。
组织工程技术的进步催生了一种新的器官移植范式，即利用分化后的干细胞实现无免疫排斥的器官移植。干细胞分化后，需要一种称为合成细胞外基质的支架，以促进三维器官的形成，并使新生组织在受体体内得以存活和生长。来源于脱细胞天然器官的支架具有优势，包括为细胞定植提供更有效的微环境，并促进干细胞增殖，尽管这些机制尚未完全阐明2。特别是肾脏，因其具有丰富的血液循环和适合干细胞定植的微环境，是制备支架的理想器官。此外，由于肾脏结构复杂，人工再生用于器官移植的肾脏仍面临巨大挑战。
本报告中，我们介绍了一种利用大鼠模型中的脱细胞器官构建血管化支架的方法，以促进未来用于组织工程研究的动物实验。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究经釜山国立大学医学院管理部门批准，并遵循动物使用与护理的伦理指南进行（证书编号：2017-119）。在开展任何动物实验之前，应获得机构审批。
注意：成功进行腹部器官手术展示和成像所需的所有外科及麻醉器械/设备和试剂详见表1。
1. 大鼠肾脏采集的制备步骤
- 手术准备阶段，将8周龄的Sprague-Dawley大鼠（体重200–250 g）置于加热垫上，并将直肠温度探头插入直肠以监测核心体温。
- 使用5%异氟烷气体进行麻醉（诱导浓度：5%，维持浓度：3%）。
- 麻醉给药后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，并用胶带固定四肢以开始手术。
- 使用杀菌皂剃净并清洁供体大鼠的腹部皮肤；涂抹2%碘伏至少1–2分钟，再用70%乙醇溶液擦拭，重复该过程三次。
- 用无菌带孔洞巾覆盖手术区域。
- 作垂直腹壁切口，暴露左侧肾脏、输尿管、腹主动脉和下腔静脉。
- 在切断肾蒂之前，辨认并游离左侧肾脏、输尿管、腹主动脉和下腔静脉。
2. 经心灌注
- 手术前，准备灌注液。
- 每只大鼠准备 50 mL 灌注液。
- 将 1× PBS 与约 10 U/mL 肝素混合（1 瓶 25 kU 肝素可配制 2.5 L PBS+Hep）。
- 将等体积的 8% 多聚甲醛与 1× PBS 混合，配制成 4% PFA/1×PBS 溶液。
注意：以水配制的 8% 多聚甲醛可在 4 °C 下保存长达 2 个月。然而，用 PBS 稀释后的 4% 多聚甲醛在 4 °C 下仅可稳定保存 1 周。请现用现配。
- 将腹部正中切口向头侧延伸。剪开时务必使剪刀尖端远离器官，以避免损伤内脏器官。
- 继续切开肋骨区域，然后通过提起胸骨剪开膈肌。
- 将松动的皮瓣用针固定至一侧，用镊子撕开周围结缔组织以暴露心脏。
警告：切勿使用剪刀分离心脏，否则可能导致不必要的出血。 - 打开磷酸盐缓冲盐水（PBS）管路，并在将针头插入左心室前确认液体流通。用钝头镊子轻轻夹持心脏，使用止血钳控制针头。针头插入深度不应超过 1/4 英寸。
注意：若插入深度超过 1/4 英寸，可能导致组织对侧穿孔。 - 在用针头和止血钳固定心脏的同时，定位右心房，并用虹膜剪将其剪开。将止血钳置于大鼠体表，确保针头仍位于心脏内部。
注意：若切口充分，随着 PBS 流入大鼠体内压力释放，体腔内应可见血液流出。 - 小心取下前肢和皮肤瓣的固定针。
- 继续灌注 PBS 4 分钟，或根据肾脏和肝脏中是否仍有可见血液决定延长灌注时间。
3. 肾脏获取与脱细胞
- 取左侧肾脏，连同腹主动脉和下腔静脉。
- 结扎输尿管、胸主动脉、上腔静脉以及腹主动脉的分支。
- 将器官置于10 cm培养皿中的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中以保持湿润。
- 使用23号导管插管腹主动脉和下腔静脉。为清除残留血液，将导管连接至蠕动泵，在37 °C条件下以5 rpm流速用DPBS（500 mL）和16 U/mL肝素灌注90分钟。
- 为对肾脏进行脱细胞处理，先以1% Triton X-100溶液（1 L）灌注3小时，随后在恒定压力40 mmHg下用0.75%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（2 L）灌注6小时。
注意：肾脏在8小时后将变为透明。 - 为去除残留的SDS，先用含1%青霉素的蒸馏水（6 L）灌注18小时（过夜），再用无菌DPBS（500 mL）和16 U/mL肝素灌注90分钟。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
大鼠肾脏的大体形态呈深红色（图1A）。脱细胞处理后，肾脏变为浅色且半透明（图1D）。根据试剂盒制造商的说明，使用商用试剂盒检测脱细胞肾脏支架中的残留基因组DNA，并与天然肾脏（对照组）进行比较。定量分析证实，脱细胞处理后组织中的基因组DNA几乎被完全去除。在14个样本中，对照组的平均DNA含量为115.05 ng/µL，脱细胞支架的平均DNA含量为1.96 ng/µL。总体而言，98.3%的DNA被清除（图2），同时三维结构得以保持，皮质实质内的无细胞肾小球结构也被保留（图3）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
已采用多种方案对器官及其他组织进行脱细胞处理。理想的脱细胞方案应能保留细胞外基质（ECM）的三维结构。通常，此类方案包括通过物理处理或离子溶液裂解细胞膜，通过酶处理或去垢剂将细胞质和细胞核从ECM中解离，随后清除组织中的细胞碎片3。物理处理方法包括刮除、溶液震荡、压力梯度、速冻、非热永久性电穿孔以及超临界流体2。位于组织或器官外表面的细胞（如皮肤或小肠）可通过机械处理联合酶法高效去除4。离子型或非离子型去垢剂可溶解DNA/蛋白质相互作用、脂质和脂蛋白，但可能损伤ECM结构5。酶法可去除解离的细胞质和核物质，但可能使这些物质残留在ECM中，从而引发免疫反应6。脱细胞所需的最佳试剂取决于组织的厚度、密度或脱细胞组织的临床用途。
在脱细胞过程中，我们联合使用了非离子型和离子型去垢剂：Triton X-100 和 SDS。Triton X-100 作为非...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由釜山国立大学医院生物医学研究所基金资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 cc 注射器（用于注入探针和载体溶液） | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 Ethilon 缝线（用于血管吻合） | Ethicon | 9032G | |
| 25 号导引针（用于血管导管） | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS 缝线（大鼠切口缝合） | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene 缝线（大鼠切口缝合） | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 丝线卷（大鼠血管通路/结扎用） | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS 缝线（小鼠切口缝合） | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene 缝线（小鼠切口缝合） | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 丝线卷（小鼠血管通路/结扎用） | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| 精细剪刀（用于剪开筋膜/结缔组织） | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey 持针器 | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly 止血钳（用于大鼠：肌肉夹闭以减少切割时出血） | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| 聚乙烯 50 号导管，导管管路，100 英尺长 | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz 微型精细血管夹 | Fine Science Tools | 18052-01 (直型) | |
| 18052-03 (弯型) | |||
| 手术剪刀（用于剪开皮肤） | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen 弹簧剪刀（用于动脉切开） | Fine Science Tools | 15003-08 |
参考文献
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933(2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
