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一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

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DOI：

10.3791/61866

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2021年5月19日

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1Department of Physiology, Shiga University of Medical Science

本文内容

摘要

我们开发了一种简化方法e 通过顺行灌注技术分离高质量单个鼠心细胞的方法。该方法无需兰格多夫（Langendorff）装置，适用于分离心室和心房心肌细胞或间质细胞，如心脏成纤维细胞或前体细胞。

摘要

在使用小鼠心脏的基础研究中，分离出具有活性的单个心肌细胞是一项需要克服的关键技术步骤。传统上，从兔、豚鼠或大鼠中分离心肌细胞是通过Langendorff装置对心脏进行逆行酶灌流来完成的。然而，当该方法应用于体积较小的小鼠心脏时，需要极高的操作技巧。最近有研究报道了一种不使用Langendorff装置的顺行灌流法用于小鼠心肌细胞的分离。本文报道了一种改进的顺行灌流完整方案，用于离体心脏灌流以从成年小鼠（8–108周龄）中分离单个心肌细胞。顺行灌流是在夹闭主动脉后，通过输液泵将灌流液注入离体心脏左心室心尖附近来完成的。所有操作均在预热的加热垫上显微镜下进行，便于实时观察注射和灌流过程。结果表明，可从单只成年小鼠心脏中同时良好地分离出心室肌细胞、心房肌细胞以及成纤维细胞。

引言

通常，从解剖获得的组织中分离单个细胞的第一步是将组织切割成小块，随后用酶消化结缔组织和细胞外基质。然而，心肌细胞无法通过这种切碎方法进行分离，因为心肌富含胶原纤维和弹性蛋白纤维等细胞外基质成分，导致心肌组织过于坚韧而难以切碎，同时心肌细胞对缺氧及其他微环境变化高度敏感。因此，已开发出基于兰格多夫（Langendorff）逆行灌流系统的酶消化方法，用于从心脏中分离单个心肌细胞1。2,3,4

在小鼠模型中，基于Langendorff法的逆行酶灌注也用于分离单个心肌细胞5,6,7,8。 然而，将细小的小鼠主动脉插管并安装到Langendorff装置上以进行逆行灌注需要较高的操作技巧，因为成年小鼠心脏主动脉的直径约为1.2 mm。此外，由于每次灌注下一个心脏前都需要清洗Langendorff装置，因此进行多个实验耗时较长。

作为一种替代逆行灌注的方法，我们开发了一种无需使用兰格多夫装置即可从成年小鼠心脏中分离心肌细胞的新技术。这一具有里程碑意义的方法基于冠状动脉的顺行灌注9。我们近期对该顺行灌注方案的各个步骤进行了优化，包括主动脉夹闭、针头插入和温度控制，并在显微镜下全程监测所有灌注过程10。本文详细报道了该顺行灌注方法的改进，以缩短细胞分离所需时间，并提供了补充视频。在本方法中，心脏灌注过程约需7分钟，使用10 mL酶液，较短的消化时间有助于提高细胞存活率。该方法无需添加2,3-丁二酮单肟（BDM）6,11或牛磺酸5,8等化学物质，即可简便地获得高质量的单个心肌细胞。我们相信，该方法将降低该技术的操作难度，提升小鼠心肌细胞在基础研究中的应用价值。

方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH出版号85-23，1996年修订版）发布的《实验动物护理与使用指南》，并经滋贺医科大学动物护理与使用委员会机构审查委员会批准（批准号：2019-3-7）。实验方法均按照批准的指南进行。

1. 仪器与溶液

注意：实验流程概要以流程图形式展示（补充图1）。心脏顺行灌注应使用输液泵（或注射泵）实现单向流动，不推荐使用产生脉动流的蠕动泵。

  1. 实验前准备
    1. 用指甲油在注射针尖端约3 mm处做标记。待其自然干燥后，将针置于室温下的容器中保存。建议使用红色或亮色标记，以便在灌注过程中确认针头插入心肌的深度。
    2. 通过剪去1.5 mL、0.5 mL和0.2 mL样品管的管盖，并使用双面胶或粘合剂将这些管盖固定在60 mm培养皿底部，制成心脏支架。在一个培养皿中固定三种不同尺寸的管盖，可根据小鼠心脏的大小选择合适的支架。该心脏支架在清洗后可重复使用。
    3. 按表1所示配制储备液。将储备液储存于4 °C条件下。
  2. 实验当天
    注意：细胞分离缓冲液（CIB）的成分为（单位：mM）130 NaCl、5.4 KCl、0.5 MgCl2、0.33 NaH2PO4、22 葡萄糖、40 单位/mL 胰岛素和25 HEPES（用NaOH调节pH至7.4）；Tyrode溶液的成分为（单位：mM）140 NaCl、5.4 KCl、1.8 CaCl2、0.5 MgCl2、0.33 NaH2PO4,、5.5 葡萄糖和5.0 HEPES（用NaOH调节pH至7.4）。
    1. 配制CIB。将160 mL去离子水（DW）用微波炉加热至约32 °C，然后加入20 mL 10X CIB。加入0.79 g葡萄糖和10 µL胰岛素溶液后，用1 M NaOH调节pH，并用去离子水定容至200 mL。
    2. 配制酶混合液（enzyme mix）。将30 mg胶原酶、1.8 mg胰蛋白酶、1.8 mg蛋白酶和90 µL 100 mM CaCl2储备液加入30 mL CIB中（终浓度Ca2+为0.3 mM），混匀后置于冰上。对于<4周龄的小鼠，胰蛋白酶和蛋白酶的用量应减少至0.9 mg10。使用前在37 °C水浴中预热。
    3. 配制CIB-Ca2+-BSA溶液。将30 mg BSA和90 µL 100 mM CaCl2储备液加入15 mL CIB中（终浓度Ca2+为1.2 mM），混匀后经20 µm滤器过滤，置于冰上保存。
    4. 配制CIB-EGTA溶液。在完成步骤1.2.2和1.2.3所述溶液的配制后，将400 mM EGTA储备液按1:1000比例加入剩余的CIB中（终浓度EGTA为0.4 mM），混匀。将35 mm培养皿和心脏支架培养皿中装满CIB-EGTA溶液，并置于冰上。
      1. 将约20 mL CIB-EGTA溶液倒入30 mL玻璃烧杯中，并将塑料移液管竖直插入烧杯中，保持在冰上。
    5. 配制Tyrode溶液。将100 mL 10X Tyrode溶液加入800 mL去离子水中，用微波炉加热至约32 °C。加入0.99 g葡萄糖和1.8 mL 1 M CaCl2后，用1 M NaOH调节pH，并用去离子水定容至1000 mL。
    6. 配制细胞重悬液。将30 mg BSA和300 µL 50X 抗生素溶液加入15 mL Tyrode溶液中。
    7. 准备注射器。将连接柔性延长管并带有标记的注射针头的20 mL注射器用CIB-EGTA溶液充满。将30 mL注射器用预热的酶混合液充满。两支注射器均在使用前保持于37 °C环境中。
    8. 准备灌注板。在体视显微镜下预热加热垫。将灌注板（多孔培养板的盖子）放置在预热的加热垫上。将血管夹置于灌注板中预热，直至使用。同时将用于移液的60 mm培养皿和细胞筛也放置在预热的加热垫上。

2. 小鼠心脏的顺行灌注

注意：用于吸取心脏的塑料移液管应质地柔软，且尖端不应过度尖锐。选择带有锯齿的微型血管夹。推荐使用的器械见材料表。

  1. 小鼠心脏的切除与主动脉夹闭
    注意：应通过腹腔注射（i.p.）过量戊巴比妥钠（>300 mg/kg）联合肝素（8000 单位/kg）处死成年小鼠（>8 周龄）。
    1. 通过吸吮法快速切除小鼠心脏
      1. 迅速打开胸腔以暴露心脏。剪切塑料移液管，使其尖端大小与暴露的心脏相近或略小（通常在距 0.5 mL 刻度约 1 cm 向尖端方向处剪断，但具体位置取决于心脏大小）。
      2. 将心脏吸入移液管中，抬高移液管以留出足够空间插入剪刀，然后从背侧使用弯头剪刀切除心脏，注意避免损伤心房。
      3. 立即将切除的心脏转移至含有冰浴 CIB-EGTA 的 30 mL 玻璃烧杯中，以终止收缩。此操作通常耗时 <1 分钟。
    2. 清理主动脉周围组织
      1. 将心脏转移至盛有冰浴 CIB-EGTA 的 35 mm 培养皿中，去除肺组织及其他可见组织，然后将初步清理后的心脏转移至盛有冷 CIB-EGTA 的心脏支架中，并使心尖朝下放置。
      2. 在体视显微镜下，清除主动脉周围的脂肪和结缔组织。若切断的主动脉过长，包含头臂动脉、左颈总动脉或左锁骨下动脉，则在头臂动脉下方剪断主动脉以缩短其长度，便于进行下一步操作。此操作通常耗时约 4 分钟。
    3. 夹闭主动脉并将夹闭后的心脏置于灌流板上
      1. 在显微镜下将心脏置于心脏支架中。操作者应面对心脏的前表面，用镊子夹住主动脉末端，在轻轻下压主动脉的同时，使用小型血管夹在靠近心房处夹闭主动脉。
      2. 将夹闭后的心脏前表面朝上放置于灌流板上，然后滴加数滴 CIB-EGTA 覆盖心脏，防止其干燥。此操作通常耗时 <20 秒。
  2. 心脏顺行灌流
    注意：首先使用 CIB-EGTA 灌流心脏，以排出血液并防止凝血。
    1. 插入注射针并开始灌流以排出血液
      1. 将装有预热 CIB-EGTA 的 20 mL 注射器连接柔性延长管和标记的注射针，并安装于输液泵上。以 0.5 mL/min 的低速启动泵，小心地用 CIB-EGTA 填充针头和管道，确保无空气进入管路。
      2. 将注射针置于灌流板上，使对角线较短的一侧朝前。将针头向心尖方向滑动直至接触心脏，然后小心地将针头插入左心室心尖附近的心室腔内，避免扭转。在插入过程中切勿将针头从板上取下。
      3. 观察针头上的红色标记，以估计插入深度。当针头插入完成后，冠状动脉中流出的血液应开始被排出。
      4. 用胶带将注射针固定在板上，并将泵速提高至 1 mL/min。此操作通常耗时约 30 秒。若灌流成功，在显微镜下可观察到心外膜下方毛细血管中 CIB-EGTA 的流动。
    2. 使用酶混合液灌流心脏
      注意：在酶解灌流期间，可通过观察针头上的红色标记来监测插入深度。
      1. 在使用 2–3 mL CIB-EGTA 灌流以完全排出冠状动脉中的血液后，更换为酶混合液进行灌流。注意避免气泡进入管路。检查酶混合液的流动情况，并通过观察红色标记的位置确认注射针未移位。
      2. 当灌流体积达到 1–2 mL 后，将泵速提高至 1.5 mL/min。定期使用移液器吸除从心脏流出并积聚的含血灌流液。
        注意：随着时间推移，心肌壁某些区域将变得半透明并呈现斑驳外观，这是细胞外基质成功消化的标志。另一标志是由于酶混合液中含有 Ca2+ 而引起的心房搏动重新启动。
      3. 当酶混合液的总灌流体积达到 10 mL 时，停止灌流。

3. 分离单个心肌细胞

  1. 心肌细胞的分离
    1. 用酶混合液灌注后，将注射器中剩余的10 mL酶混合液转移至置于加热垫上的60 mm培养皿中，并加入20 mg BSA（酶混合液中含0.2% BSA）。轻轻晃动培养皿使BSA粉末迅速溶解。从心脏上移除注射针头和血管夹。
    2. 将心室和心房分离，并分别转移至加热垫上含有0.2% BSA的酶混合液中。
  2. 心室肌细胞的分离
    1. 用两把镊子夹住心外膜，在含有0.2% BSA的酶混合液中轻轻将心室左右撕拉成小块。通过轻柔吹打（约30次）使细胞分散。
    2. 将未消化的组织残渣通过100 µm孔径的细胞筛过滤，滤液转移至15 mL离心管中，在50 × g 条件下离心3 min。将沉淀的心肌细胞重悬于预温的CIB-Ca2+-BSA溶液中，37 °C孵育5 min，随后在14 × g 条件下离心3 min。
    3. 将最终沉淀的心肌细胞重悬于细胞重悬液（成分见表2）中，并于37 °C保存。
  3. 心房肌细胞的分离
    1. 在步骤3.2中心室肌细胞组分进行最终离心的同时，开始分离心房肌细胞。将按步骤3.1保存的心房组织转移至预温的CIB-Ca2+-BSA溶液中，将其撕成小块，并在加热垫上使用10 µL枪头通过吹打法解离细胞。
    2. 将细胞混合液在14 × g 条件下离心3 min，将沉淀的心房细胞用细胞重悬液重悬。
  4. 心脏成纤维细胞的分离与培养
    1. 将步骤3.2中第一次离心后的上清液转移至另一支15 mL离心管中，在190 × g 条件下离心5 min。将沉淀的细胞用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）洗涤两次（每次均离心），然后用含10%胎牛白蛋白（FBS）和抗生素的DMEM重悬细胞。
    2. 将最终的细胞组分接种于培养瓶（25 cm2）中，在95%空气和5% CO2的湿化环境中培养，使细胞贴壁。孵育90 min后，弃去未贴壁细胞，加入新鲜培养基。细胞约在4天后接近融合状态，此时应通过胰酶消化进行扩增，并接种至新的培养皿中。

4. 从心房和心室中收获蛋白质

  1. 灌注后，分离心房和心室，将组织置于裂解缓冲液中，按每10 mg组织加入100 µL缓冲液的比例，在1.5 mL样品管中使用小型研磨器进行匀浆。
  2. 将匀浆液置于冰上孵育40分钟，每隔10分钟涡旋混匀一次，以提取蛋白质；然后在4 °C条件下以15000 × g 离心20分钟，将上清液分装并储存在-80 °C作为蛋白样品。

5. 分离心肌细胞的免疫染色

注意：使用生物胶将非贴壁心肌细胞固定在细胞成像培养皿底部是必要的。

  1. 分离的心肌细胞在玻璃底培养皿上的贴附
    1. 在开始细胞分离前，根据制造商说明用生物胶（例如 Cell-Tak）包被玻璃底培养皿，用去离子水（DW）冲洗，并在室温下风干。
    2. 将分离后的心肌细胞重悬于含钙离子和牛血清白蛋白的细胞缓冲液（CIB-Ca2+-BSA）中，滴加细胞悬液至已包被胶的培养皿底部，在室温下静置孵育20分钟，避免振荡。
  2. 免疫荧光染色
    1. 将分离的心肌细胞接种于预先用生物胶包被的玻璃底培养皿中，在室温下放置40分钟，使细胞充分贴附。将心脏成纤维细胞培养于玻璃底培养皿中。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，随后加入4%多聚甲醛（PFA）在摇床上固定5分钟。用PBS洗涤固定后的细胞，每次10分钟，共洗三次，然后在封闭-透化溶液中室温摇床上孵育60分钟。
    3. 将一抗用封闭-透化溶液稀释后，在室温下孵育细胞60分钟，或在4 °C下孵育过夜。用PBS洗涤细胞三次，每次10分钟，随后加入荧光标记的二抗，在室温下孵育60分钟。
    4. 用PBS洗涤三次，每次10分钟，然后用DAPI（PBS中1:10000稀释）对细胞核进行染色。使用共聚焦激光扫描显微镜分析荧光信号。

6. 全细胞膜片钳记录

  1. 使用水平显微电极拉制仪从玻璃毛细管制备膜片电极。当电极内充满富含 K+ 的移液管溶液时（表2），其电阻范围为 2 至 4 MΩ。将一份分离的心肌细胞转移至记录室，记录室安装在倒置显微镜载物台上，并以每分钟 1 mL 的流速持续灌注 Tyrode 溶液，温度维持在 36–37 °C 。
  2. 采用穿孔膜片钳技术记录动作电位，移液管溶液为含 30 mg/mL 两性霉素 B 的富 K+ 溶液，通过膜片电极施加持续时间为 5–10 ms、频率为 1 Hz 的电流脉冲。

7. 蛋白质印迹分析

  1. 本研究中，对小分子量蛋白质（如心房标志物心房利钠肽 ANP）进行蛋白质印迹分析。
  2. 将蛋白质样品溶解于终浓度为 1× 上样缓冲液、2% 2-巯基乙醇的溶液中，在 37 °C 下变性 60 分钟。每孔上样 20 µg 蛋白质，以每块凝胶 20 mA 的电流在电泳缓冲液中电泳 120 分钟。
  3. 在转移缓冲液中以 10 V 电压将蛋白质转移至 PVDF 膜上，持续 40 分钟。转移后，用 TBST 洗涤膜 2 次，每次 5 分钟，随后在室温下用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 封闭 60 分钟，并在 4 °C 下用 TBST 稀释的一抗溶液孵育过夜。
  4. 用 TBST 洗涤膜 5 次，每次 7 分钟，然后在室温下与 TBST 稀释的二抗孵育 120 分钟。
  5. 再次用 TBST 洗涤膜 5 次，每次 7 分钟，随后使用化学发光法显影信号，并用化学发光成像分析仪进行分析。

结果

该方法的原理很简单：灌流液从左侧腔室流出，主动脉瓣打开，灌流液沿与血流相同的方向进入冠状动脉；由于主动脉被夹闭，灌流液得以深入心肌组织进行灌注，从而消化细胞外基质。

采用本方法 freshly 分离的心室肌细胞如图1A所示。图1B展示了心室肌细胞和心房肌细胞的放大图像。该分离方法从成年小鼠（8–10周龄）获得了高产率（70%–80%）的杆状静息心室肌细胞，分离后约5小时内即可用于实验（图1C），与传统的Langendorff灌流法所需时间相近7。然而，在年龄超过>2年的小鼠中，新鲜分离的活细胞比例较低（图1C）。使用本方案从每只成年小鼠心脏获得的心室肌细胞总数约为3 × 106个，与先前报道的数值相似7,12。在心室肌细胞和心房肌细胞中记录到的动作电位（图1D）与采用Langendorff法获得的细胞相似10。免疫荧光染色分析证实，心室肌细胞的肌节结构排列良好，细胞膜清晰可见（图2A）。采用本方法分离的单个心肌细胞可直接用于电生理分析10或免疫荧光染色等实验。

心肌成纤维细胞存在于间质空间中。充分消化细胞外基质可实现这些细胞的分离。分离得到的心肌成纤维细胞在培养条件下能够增殖，可传代数次，或在适当的细胞保存溶液中冻存于液氮中。图2B显示，在传代培养过程中，大多数培养的心肌成纤维细胞已转化为肌成纤维细胞，这通过α-平滑肌肌动蛋白表达的增加得以证实13,14。此外，利用本方法还可分离心脏前体细胞，并在适当的培养基中进行培养，这些细胞可自发搏动10,15。

心肌组织较为坚韧，其匀浆处理并不容易，尤其是来自老龄小鼠的心脏组织，含有大量细胞外纤维。经过顺行灌流后，利用较轻的机械力即可在裂解缓冲液中轻松将心房和心室组织中的蛋白质充分匀浆以提取蛋白。Western blot 分析显示，在成年（20 周龄）和老龄（108 周龄）小鼠的心房中特异性表达 ANP，而在心室中则无表达（图 3）。

细胞生物学研究；细胞的显微镜图像；存活率图；电压-时间图。
图 1. 小鼠分离的心肌细胞。A. 通过顺行灌注法新鲜分离的心室肌细胞，图像以低倍镜采集。最终洗涤后，将心肌细胞重悬于 2 mL 细胞重悬液中，取 100 µL 滴加至玻璃底培养皿，静置使细胞沉降。标尺，100 µm。B. 分离的心室肌细胞（上）和心房肌细胞（下）的放大图像。标尺，100 µm。C. 将分离的细胞悬浮于细胞重悬液中，并在 37°C 下保存所需时间，随后在显微镜下计数 10–15 个视野中的存活心室肌细胞数量。形态呈圆形的细胞被视为不可逆损伤或死亡16。绿色、蓝色和红色符号数据来自 8–10 周龄的 3 只小鼠，黑色符号来自 106 周龄小鼠。黄色符号表示各组均值。D. 从 8–10 周龄小鼠的心室肌细胞（黑色）和心房肌细胞（红色）记录的代表性动作电位。数据取自分离后约 3 小时的细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

α-肌动蛋白和α-平滑肌肌动蛋白荧光与微分干涉对比显微镜比较，细胞结构分析。
图 2. 分离的小鼠心室肌细胞中α-肌动蛋白和培养的小鼠心脏成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的免疫荧光染色。A. 对通过顺行灌注法从小鼠心脏分离的心室肌细胞进行α-肌动蛋白（绿色）免疫荧光染色、DAPI 核染色（蓝色）以及微分干涉对比（DIC）成像。比例尺：50 µm。B. 对通过顺行灌注法从小鼠心脏分离的心脏成纤维细胞进行α-平滑肌肌动蛋白（绿色）免疫荧光染色、DAPI 核染色（蓝色）以及 DIC 成像。心脏成纤维细胞已培养四天。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

Western blot 分析；大鼠心脏组织中 ANP、GAPDH 的表达；心房与心室比较
图 3. 心房和心室中 ANP 的 Western blot 分析。对来自成年（20 周）和老年（108 周）大鼠心脏的心房（A）和心室（V）组织进行心房利钠肽（ANP）这一心房标志物的 Western blot 分析。ANP 存在于心房中，但在心室中缺失。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参管家蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

分离心肌细胞用储存液
10X CIB（500 mL）
NaCl37.99 g
KCI2.01 g
1 M MgCl22.5 mL
NaH2PO40.23 g
HEPES 29.79 g
DW加水至 500 mL
100 mM CaCl2 储存液
CaCl2 100 mM
400 mM EGTA 储存液
EGTA400 mM
胰岛素溶液
胰岛素1 单位/mL，溶于 0.1 M HCl
50X 抗生素储存液（20 mL）
青霉素100 mg
链霉素100 mg
酚红1.5 g
DW20 mL，过滤除菌
10X 台氏液（1000 mL）
NaCl81.82 g
KCl4.03 g
1 M MgCl25 mL
NaH2PO40.47 g
HEPES 11.92 g
NaOH0.8 g
DW加水至 1000 mL
免疫染色用储存液
DAPI 储存液
DAPI2 mg/mL，溶于甲醇
Western blot 用储存液
HEPES 缓冲液（100 mL）
NaCl0.88 g
400 mM EGTA0.25 mL
HEPES 0.24 g
1M NaOH调 pH 至 7.4
DW加水至 500 mL
蛋白酶抑制剂混合液
Complete mini1 片
DW0.4 mL

表1. 储存液的配制说明。将储存液保存在4 °C。将蛋白酶抑制剂混合液分装后于-20 °C保存。

用于分离心肌细胞的溶液
CIB（200 mL）
10X CIB20 mL
胰岛素溶液0.01 mL
葡萄糖0.79 g
1 M NaOHpH 调至 7.4
DW加至 200 mL
酶混合液（30 mL）
II型胶原酶30 mg
胰蛋白酶1.8 mg
蛋白酶1.8 mg
100 mM CaCl2 储备液0.09 mL
CIB30 mL
CIB-Ca2+-BSA（15 mL）
BSA30 mg
100 mM CaCl2 储备液0.18 mL
CIB15 mL
CIB-EGTA（150 mL）
400 mM EGTA 储存液0.150 mL
CIB150 mL
Tyrode 溶液（1000 mL）
10X 台氏液储存液100 mL
葡萄糖 0.99 g
1M CaCl₂21.8 mL
1M NaOHpH 调至 7.4
DW加至 1000 mL
细胞重悬液（15 mL）
BSA30 mg
50X 抗生素储备液0.3 mL
Tyrode 溶液15 mL
免疫染色溶液
细胞贴壁溶液（0.3 mL）
Cell-Tak0.01 mL
0.1 M NaHCO₃3 (pH 8.0)0.285 mL
0.1 M NaOH0.005 mL
封闭-通透溶液（10 mL）
胎牛血清1 mL
Triton X-1001 mL
10X PBS1 mL
DW7 mL
K+ 富含离子的移液管溶液
天冬氨酸钾70 mM
KCl50 mM
KH2PO410 mM
MgSO₄41 mM
ATP二钠盐3 mM
GTP 锂盐0.1 mM
EGTA5 mM
HEPES5 mM
KOHpH 调至 7.2
Western blot 溶液
裂解缓冲液（1 mL）
HEPES缓冲液0.86 mL
Nonidet-P400.1 mL
蛋白酶抑制剂混合物0.04 mL
运行缓冲液（1000 mL）
10X TG（0.25 M Tris 和 1.92 M 甘氨酸）100 mL
SDS1 g
DW900 mL
转移缓冲液（1000 mL）
10X TG100 mL
甲醇200 mL
DW700 mL
印迹缓冲液（TBST）（1000 mL）
5M NaCl20 mL
2M Tris-HCl (pH 7.5)5 mL
10% Tween 2010 mL
DW965 mL

表2. 用于分离心肌细胞、免疫染色和蛋白质印迹的现用溶液的配制说明。所有现用溶液均需在实验前新鲜配制。

补充图 1. 细胞分离流程示意图。从单个心脏中分离心室肌细胞、心房肌细胞和心脏成纤维细胞的流程图。 请点击此处下载该图。

讨论

由于心脏对缺血高度敏感，因此从心脏离体到将其浸入冰冻的CIB-EGTA溶液以终止收缩的整个过程应尽可能迅速（<1 分钟）。这是本方法的第一个关键步骤。第二个关键步骤涉及心脏的方向。在步骤 2.1.2 中对离体心脏进行特定方位的放置，有助于更清晰地观察并去除主动脉周围的脂肪和结缔组织。在清理主动脉周围组织后，将夹住的心脏前表面朝上放置于灌注板上。最后一个关键步骤是注射针头的插入。推进针头时，不应将针头从灌注板上取下，以保持与板面之间的距离恒定。针头插入位置应靠近左心室心尖。插入针头时应小心操作，避免旋转，因为旋转可能导致穿刺孔扩大。可通过观察针头上的红色标记来估计插入深度。若针头插入过深，其尖端可能穿透室间隔进入右心室，或穿过二尖瓣进入左心房。在确认冠状动脉内血液完全消失后，应用胶带将针头固定于灌注板上。

主动脉过长会导致难以在正确位置夹闭主动脉。如果夹闭位置距离心房过远，在灌注液注入后心脏可能发生旋转。为防止此情况，可在夹闭前于无名动脉下方剪断主动脉，以缩短主动脉长度。

如果以初始速度0.5 mL/min灌流后血液仍未开始流出，可将速度增加至1 mL/min。若仍无改善，可能是注射针位置不当，例如位于右心室、室间隔或左心肌壁。此时应立即拔出针头，并尝试在左心室心尖附近重新穿刺。多次穿刺时，消化后的细胞可能从切口处流出。需注意，这种情况通常不会严重影响细胞的分离效果。

操作人员可使用体视显微镜监测心脏顺行灌注的整个过程，观察颜色和透明度的变化以及心房在消化过程中重新开始搏动的情况。即使对于较老的心脏，酶混合液的总量最多也只需10 mL。对于较年轻的心脏（5至7周龄），我们将酶液用量减少至9 mL，这与采用相同酶混合液进行逆行灌注的方法类似。

最终离心后的上清液含有碎片、血细胞和非心肌细胞，而沉淀物主要包含心肌细胞以及污染性的非心肌细胞（如成纤维细胞和内皮细胞）。为了纯化心肌细胞，还需要进行更多步骤。通常情况下，应将沉淀物重悬于适当的细胞培养基中，在37°C条件下接种于组织培养皿中预培养2小时，然后通过移液轻轻收集心肌细胞，并进行再次预培养。

酶混合液中含有低浓度的 Ca2+（0.3 mM）。因此，在最终用细胞重悬液（1.8 mM Ca2+）重悬之前，我们将消化后的细胞在含 Ca2+ 的 CIB-BSA 溶液（1.2 mM Ca2+）中孵育，逐步增加 Ca2+ 浓度以避免造成细胞损伤7。只要分离得到的心肌细胞保持完整（静息状态、无收缩），这种 Ca2+ 适应性处理就不会影响小鼠细胞的活力。由于受损细胞在孵育过程中逐渐死亡，我们因而能够获得一群健康的细胞。类似地，分离得到的完整心房肌细胞（无自发不规则收缩的静息细胞）也可保存在相同的细胞重悬液中。然而，与心室肌细胞相比，心房肌细胞通常更为脆弱，不易保存。

在实验室中，除非针头插入左心室失败，否则该分离方法几乎总是成功的。我们还成功地从通过手术横向主动脉缩窄法构建的肥厚心脏中分离出了细胞。然而，在老年小鼠中，由于常伴有小面积心肌梗死，灌注在某些区域会停止，导致消化不完全，从而获得的细胞数量较低（图1C），这与基于Langendorff系统的逆向灌流方法类似。在这种情况下，即使在灌注开始时也能观察到心脏形态的扭曲。

这种顺行灌流方法适用于分离不同年龄小鼠的心脏细胞，但不适用于较大的动物，如兔子和豚鼠。在断奶前，该方法可能可用于新生或幼年大鼠。

这种顺行灌注方法的优点之一是降低了使用基于Langendorff的逆行灌注方法处理小鼠小心脏时所面临的技术障碍。使用10 mL酶液进行灌注所需时间约为7分钟，较短的消化时间提高了细胞的存活率。此外，即使在主动脉瓣已被消化后，该方法仍可通过心脏的冠状循环进行灌注。心房肌细胞的分离通常需要基于Langendorff的逆行灌注，并进一步与酶孵育17。然而，这种顺行灌注方法能够将酶充分灌注至组织深部，从而实现心房肌细胞的分离。

在使用多只小鼠的实验中，灌注下一颗心脏前应清洁兰格多夫装置。然而，在当前的顺行灌注方法中，只要预先准备好所需数量的仪器套装（例如注射器、针头和灌注板），即可连续进行灌注。

本文报告了使用与基于兰格多夫（Langendorff）的逆向灌注方法相同的灌注液、且不添加额外化学物质的小鼠心脏顺向灌注基本方法。可根据实验目的调整灌注液的成分，例如使用含EGTA的去垢剂替代酶以制备脱细胞心脏18。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢T. Yamamoto和Y. Mori在形态学实验中提供的帮助。本研究由日本促进科学基金（Japan Society for the Promotion of Science）科学研究费补助金（C类）资助（项目编号18K06871，授予M.O.K.；项目编号17K08536，授予H.M.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素BWako Pure Chemical Industries, Japan
Alexa Fluor 488 抗小鼠IgG抗体Molecular Probes, USAA11001荧光标记的二抗。（免疫染色时1:400稀释）
抗-α-肌动蛋白（ACTN）Sigma-Aldrich, USAA7811小鼠单克隆抗体（克隆号EA-53）。（免疫染色时1:400稀释）
抗心房利钠肽（ANP）Merck-Millipore, USAAB5490-I兔多克隆抗体（Western印迹时1:2000稀释）
抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）Cell Signaling Technology, USA2118小鼠单克隆抗体（Western印迹时1:10000稀释）
抗平滑肌肌动蛋白（SMA）Dako, DenmarkM0851小鼠单克隆抗体（克隆号1A4）（免疫染色时1:400稀释）
抗兔IgG抗体Amersham, GE Healthcare, USANA934二抗（Western印迹时1:10000稀释）
三磷酸腺苷二钠盐Sigma-Aldrich, USAA26209
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, USAA9418
Cell-TakCorning354240用于细胞或组织粘附的生物材料
Chemi-Lumi One Super Nacalai Tesque, Japan02230-14用于Western印迹的化学发光试剂。
II型胶原酶Worthington Biochemicals, USALS004176选择活性大于300单位/毫克的产品。
Complete MiniRoche, Germany11836153001多种蛋白酶抑制剂的混合物。
4'6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Nacalai Tesque, Japan11034-56用于细胞膜不透性核染色 
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Nacalai Tesque, Japan08458-45含4.5 g/L葡萄糖
延长管Top, JapanX1-50用于连接注射器和注射针进行顺行灌注。 
EPC-8 膜片钳放大器HEKA, Germany
胎牛血清（FBS）Sigma-Aldrich, USAF7524-500ML
玻璃毛细管Narishige Scientific Instrument Lab., Japan外径1.5 mm，内径0.9 mm
三磷酸鸟苷锂盐Sigma-Aldrich, USAG5884
水平微电极拉制仪 Germany)P-97
加热垫Natsume Seisakusho, JapanKN-475-3-40用于加热灌注板的设备。
输液泵TERUMO, JapanTE-311用于顺行灌注的注射器输液泵。
注射针（27号）TERUMO, JapanNN-2719S用于插入左心室的针头。
胰岛素（来自牛胰腺）Sigma-Aldrich, USAI5500溶于0.1 M HCl中。
小型无线研磨机Funakoshi, JapancG-4A用于在1.5 mL样品管中匀浆组织的小型研磨机。
4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（4% PFA）Nacalai Tesque, Japan09154-85
青霉素G钾盐Nacalai Tesque, Japan26239-84
酚红Nacalai Tesque, Japan26807-21
10倍磷酸盐缓冲液（pH 7.4）（10X PBS）Nacalai Tesque, Japan27575-31
塑料多孔培养板Falcon, USA353226使用多孔培养板的盖子作为灌注板。
塑料注射器（20 mL）TERUMO, JapanSS-20ES用于灌注CIB-EGTA。
塑料注射器（30 mL）TERUMO, JapanSS-30ES用于灌注酶混合液。
塑料移液管Sarstedt, Germany86.1171在吸取小鼠心脏前剪去管尖。
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜Merck-Millipore, USAIPVH00010Immobilin-P膜（蛋白质印迹转移膜）
蛋白酶Sigma-Aldrich, USAP5147包含细胞外丝氨酸蛋白酶在内的三种或以上蛋白酶的混合物。
4倍样品缓冲液Fuji Film, Japan198-13282含0.25 M Tris-HCl（pH 6.8）、8 w/v% SDS、40 w/v%甘油和0.02 w/v%溴酚蓝
SDS聚丙烯酰胺凝胶 （15%）Fuji Film, Japan193-14991
硫酸链霉素Nacalai Tesque, Japan32237-14
10倍Tris-甘氨酸缓冲液（10X TG）Nacalai Tesque, Japan09422-81含0.25 M Tris和1.92 M甘氨酸（pH 8.3） 
胰蛋白酶Sigma-Aldrich, USAT8003来自牛的I型胰蛋白酶。 
血管夹Karl Hammacher GmbH, GermanyHSE 004-35用于夹闭主动脉的小型直血管夹。
其他所有试剂Nacalai Tesque, Japan

参考文献

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