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长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

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DOI：

10.3791/61868

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2020年11月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案描述了小鼠器官型外植体的制备方法 神经视网膜，与视网膜色素上皮（RPE）共同培养于R16定义培养基中，该培养基不含血清和抗生素。与传统方法相比，该方法操作相对简便、成本较低且耗时较少。 体内 实验，并可适用于多种实验应用。

摘要

在眼科研究中，迫切需要 体外 神经视网膜的模型。本文中，我们提供了一种小鼠眼球组织器官型培养的详细方案 神经视网膜 保留完整的视网膜色素上皮（RPE）。根据研究问题的不同，视网膜可取自野生型动物或疾病模型动物，用于研究糖尿病性视网膜病变或遗传性视网膜变性等疾病。取出生后第2至第9天幼鼠的眼球，在无菌条件下进行摘除。用蛋白酶K对眼球进行部分消化，以使脉络膜与RPE分离。在体视显微镜下，于角膜处做一小切口，形成两个边缘，由此可轻柔剥离脉络膜和巩膜，使其与RPE及神经视网膜分离。随后移除晶状体，并在眼杯上做四个切口，使其呈四叶状，形似三叶草。最后将组织转移至悬滴中，放入含有聚碳酸酯培养膜的细胞培养插入式培养器中。培养物在无血清、无抗生素的R16培养基中维持培养，所有条件均为明确限定，每两天更换一次培养基。

所述方法能够分离视网膜并维持其正常的生理和组织学特征，用于至少2周的培养。这些特点使得视网膜器官型外植体培养成为研究视网膜发育、疾病机制和电生理学的优良模型，具有高度的预测价值，同时也可用于药理学筛选。

引言

在眼科研究中，有多种模型可用于视网膜研究，包括原代视网膜细胞培养、视网膜来源的细胞系、视网膜类器官以及 体内 动物模型1,2,3,4,5然而，这些模型各自都存在缺陷。例如，细胞在孤立环境中生长，而视网膜是一个具有大量细胞间相互作用的复杂网络。因此，与整个组织中观察到的情况相比，孤立细胞培养的行为可能具有人为性。这一问题可通过部分使用 体外 分化的视网膜类器官，可用于研究发育过程和基础生物学6然而，截至目前，视网膜类器官的生成仍然耗时较长、劳动强度大，且存在可重复性差的问题，因此在将其应用于转化性视网膜研究之前，仍需进行大量进一步的开发工作。最后，尽管活体动物研究在某种程度上是最接近眼科研究需求的模型，但其伴随有强烈的伦理争议。在细胞培养系统的效率与真实生理情境之间，一个良好的折中方案是 体内 动物模型为视网膜器官型外植体培养。此类培养还可减少动物痛苦，因为无需 体内 进行干预。

已有多种方法用于培养来自不同物种的视网膜外植体5,7,8。本实验方案描述了一种从小鼠中分离神经视网膜及其视网膜色素上皮（RPE）的技术。该技术同样适用于大鼠视网膜的培养9。将神经视网膜 与其RPE共同培养对实验成功至关重要。RPE为视网膜执行多种重要功能：营养物质、离子和水的转运，光吸收以及对光氧化的防护；将全反式视黄醛重新异构化为11-顺式视黄醛（对视觉循环至关重要）；吞噬脱落的光感受器膜片；以及分泌维持视网膜结构完整性的关键因子10。 保留RPE可促进光感受器外节和内节的成功发育，使视网膜保持更长时间的活性11。下述操作程序可在至少两周内维持视网膜的组织特性和生理特性12。此外，在无血清、无抗生素的培养基中培养这种器官型视网膜外植体，可避免未知物质的干扰，从而更清晰地解释实验结果12。

器官型视网膜外植体培养对于增进我们对视网膜发育和退行性病变的认识至关重要7,13,14。本文表明，这类培养体系也可作为药理学筛选的有效工具，并可用于模拟多种视网膜疾病，包括糖尿病性视网膜病变。

方案

动物实验方案符合德国动物保护法第4条，经图宾根大学动物保护委员会（Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde；注册编号：AK02/19M）审查并批准。本研究中视网膜组织来源于野生型（WT）和rd1小鼠，后者是遗传性视网膜变性的经典模型15。小鼠在标准的明暗循环光照条件下饲养，自由饮水进食，实验使用时不区分性别。

1. 检查清单

  1. 为确保无菌条件并避免污染，使用70%乙醇清洁并消毒超净工作台。务必让乙醇完全挥发，以防止对视网膜培养物造成毒性影响。
  2. 使用前对器械（如剪刀、镊子和眼科显微镜刮匙）进行高压灭菌。
  3. 在超净工作台内无菌条件下预先配制以下培养基：基础R16培养基（BM）（可在4 °C保存4周）、含20%胎牛血清（FCS）的BM（当日配制使用）、含0.12%蛋白酶K（44 mAnson U/mg）溶液的BM（当日配制使用），以及按照Romijn16所述添加补充物的完全R16培养基（CM）（可在4 °C保存3周）（参见表S1、S2和S3）。
  4. 在37 °C预热蛋白酶K溶液以激活，并在步骤2.5中使用。

2. 准备

  1. 在出生后第5天（P5）通过断头法处死 rd1/WT 动物。对于P11以后的动物，根据当地动物保护法规，使用 CO2 和/或颈椎脱位法。
  2. 根据动物年龄，在摘除眼球前如需要，可用镊子轻轻打开眼睑，并小心分离眼睑，避免接触或刮伤下方的眼球。
  3. 在体视显微镜下使用弯头镊迅速摘除眼球。
  4. 将眼球在BM中室温（RT）孵育5分钟。
  5. 将眼球在预热的含0.12%蛋白酶K的BM中37 °C孵育15分钟。
  6. 以下步骤均需在层流洁净工作台内进行，以确保无菌条件。为灭活蛋白酶K，将眼球转移至含20% FCS的BM中，室温孵育5分钟。
  7. 在体视显微镜下，于含新鲜BM的培养皿中无菌解剖眼球。摘除眼球后应尽快开始解剖；延迟时间越长，视网膜越难解剖，眼球组织也会变得非常柔软。
    1. 用镊子从视神经处夹住眼球。使用精细剪刀在角膜上做一小切口，形成两个边缘，然后用两把精细镊子轻轻剥离角膜、脉络膜和巩膜（图1 步骤A–C）。或者，也可使用细针头在角膜上先做初始切口，再将剪刀的一侧刀片插入开口中。
    2. 用精细镊子夹住晶状体。将第二把镊子垂直于第一把，使第一把镊子位于第二把镊子的两个臂之间，拉动以将晶状体从眼球杯中取出。若玻璃体和睫状体仍附着于视网膜，需小心将其去除（图1 步骤D）。
      注意：步骤2.7.1和2.7.2需要熟练操作，务必小心以免损伤视网膜。
    3. 在视网膜边缘垂直方向的四个点进行切割，形成四叶草形状（图1 步骤E–F）。
    4. 使用底部切口较宽的1 mL吸头制成的移液器，将视网膜置于一滴悬滴培养基中，并转移至放置于6孔板中的培养皿滤膜插入物上。色素上皮层（RPE）应朝向滤膜（图1 步骤G）。
    5. 用移液器小心吸除插入物中的多余培养基。
    6. 从孔板侧边每孔加入1 mL CM，并在37 °C、5% CO2的无菌培养箱中孵育。切勿将视网膜完全浸入培养基中，以免降低氧供应并导致组织退化。外植体应保持在液体与空气交界面，仅由水的表面张力形成的薄液膜覆盖。
  8. 视网膜外植体在最初48小时内保持静置，以促进移植后组织恢复。
  9. 每48小时更换一次培养基。从每个孔中弃去700 µL培养基，并加入900 µL新鲜CM。此方法可补充因蒸发损失的培养基量，同时使视网膜外植体保留前48小时内产生的部分神经保护因子。
  10. 将弃去的培养基置于单独且封闭的微量离心管中，与培养物一同孵育，用于监测和评估可能的污染（如培养基颜色变化）。
    注意：视网膜外植体可在培养中维持至少2周12。

3. 培养后

注意：外植体可用于不同的实验应用（蛋白质印迹、组织学、整体封片、基因分析、电生理学）。根据具体应用，视网膜器官型外植体可进行速冻、裂解或制备用于冷冻切片。以下步骤描述了组织学样品的制备方法。

  1. 使用4%多聚甲醛（PFA）固定45分钟，随后进行梯度蔗糖冷冻保护（室温下10%蔗糖处理10分钟，20%蔗糖处理20分钟，30%蔗糖处理2小时，或4 °C过夜）。将这些缓冲液直接加入孔中。
  2. 在视网膜外植体周围切开膜。
  3. 将膜和视网膜组织共同包埋于冷冻组织包埋介质中。

眼球解剖示意图，显示角膜、巩膜去除、视网膜色素上皮（RPE）暴露，并置于Transwell中进行培养。
图 1：类器官视网膜外植体培养的逐步操作流程。（A）摘除小鼠眼球并转移至蛋白酶K溶液中，以使巩膜和脉络膜与视网膜及视网膜色素上皮（RPE）分离。在巩膜/脉络膜层上做一小切口。（B）使用两把镊子剥离巩膜/脉络膜层。（C）剥离过程中可见黑色的脉络膜层。下方深色的视网膜色素上皮（RPE）仍附着于眼球。将巩膜和脉络膜连同视神经一并去除。（D）用镊子取出晶状体和玻璃体，去除残留的睫状体。（E）视网膜保持碗状结构。（F）为使视网膜在培养皿中展平，用剪刀在视网膜周围等距做四个切口，使其呈三叶草形状。使用剪去尖端的1 mL移液器吸头将视网膜培养物转移至6孔板中的膜培养插入物上。此时视网膜仍保留部分碗状结构，但在去除视网膜周围多余液体后，会自然展开为平面结构。（G）在膜培养体系中，视网膜培养物置于多孔聚碳酸酯（PC）膜上，膜下方为完全R16培养基溶液。为维持细胞活性，培养物需置于37 °C、5% CO2的湿化无菌培养箱中，培养基每48小时更换一次。请点击此处查看该图的放大版本

结果

按照本方案操作后，分离并培养的视网膜组织外植体可保持其正常的组织结构，从视网膜色素上皮层（RPE）到神经节细胞层（GCL）均具有清晰的分层结构，如图2所示。外核层（ONL）和内核层（INL）的厚度在2至3周内基本保持稳定，但随着培养时间延长至4周及以上，细胞逐渐丢失，这些层次的变薄现象会变得越来越明显。相比之下，由于视神经被切断（轴突损伤），神经节细胞层（GCL）通常在培养的最初4天内即出现显著变薄。此后，GCL中残存的细胞群体（主要是异位的无长突细胞）仍可维持活性达额外3至4周17,18,19。

视网膜层次结构示意图；DAPI染色，视杆细胞，穆勒细胞；显微镜图像，组织结构分析
图2视网膜外植体培养中发现的细胞类型 P11 来源的视网膜外植体培养 rd1 突变体 (A) 和野生型动物（WT）B) 显示DAPI染色的细胞核（左，蓝色）、视杆细胞（中，红色）和Müller细胞（右，绿色）。细胞核染色可清晰呈现视网膜各主要细胞层，包括视网膜色素上皮层（RPE）、外核层（ONL）、内核层（INL）和神经节细胞层（GCL）。核层中的特定细胞类型（如视杆细胞和Müller细胞）通过α-arrestin进行免疫标记。26 和谷氨酰胺合成酶27 抗体。C显示整个全长切片部分 rd1 小鼠视网膜，DAPI染色显示视网膜结构的一致性、整合性及发育情况。这些视网膜已培养6天。操作描述：来源于视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的组织 rd1 或在 P5 分离野生型动物，按本方案所述方法培养至 P11，每 48 小时更换一次培养基。于 P11 用 4% PFA 固定培养物并进行冷冻切片。 请点击此处以查看此图的放大版本

无血清培养基和持续的体外环境使得实验条件能够得到完全控制。在此，我们提供该方案两个具体应用的示例。
第一个示例说明了利用视网膜外植体进行药物测试或筛选的可能性。实验采用野生型（WT）和rd1小鼠模型制备了视网膜组织外植体培养物。后者是一种已被充分表征的视网膜变性模型15。在rd1小鼠视网膜中，外核层（ONL）的变性由视杆细胞中异常升高的cGMP水平引发6,20。过量的cGMP导致环核苷酸门控离子通道（CNGCs）和cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）活性增加，从而引起细胞死亡21。本研究测试了使用一种cGMP的结构类似物（环核苷酸#3；CN003）处理rd1小鼠视网膜，该化合物可同时作用于PKG和CNGC。在出生后第5天（P5）进行外植操作后，按照图3A所示的处理方案进行。在P11时，用4%多聚甲醛（PFA）固定外植体培养物，并制备冰冻切片（图3A）。为评估经处理、未处理（NT）及WT样本组织切片中的细胞死亡情况，进行了末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测22。TUNEL标记细胞的分析显示，在未处理的rd1样本ONL中，死亡细胞比例很高；而当CN003以50 µM浓度施用时，可保护rd1小鼠的光感受器细胞23（图3B）。

糖尿病的一种常见并发症是糖尿病性视网膜病变，这是一种致盲性疾病，难以在动物模型中真实再现5第二个例子强调了利用视网膜器官型外植体培养来表征模拟2型糖尿病（T2DM）条件下视网膜细胞存活能力的方法。24. 此处，我们使用了20 mM的糖酵解抑制剂2-脱氧-葡萄糖（2-DG）25 并将其加入培养基中，从P10至P11持续处理24小时。我们证明，将野生型视网膜外植体置于此类 体外 模拟糖尿病条件下会导致视网膜神经元细胞广泛死亡（图3C这一范式随后可用于研究变性机制，或在糖尿病背景下测试视网膜保护性治疗。

小鼠视网膜外植实验装置、TUNEL 检测结果、示意图、凋亡分析。
图 3：类器官型视网膜外植培养的两个应用实例。（A）实验流程说明：rd1 或野生型（WT）动物来源的视网膜和视网膜色素上皮（RPE）于出生后第 5 天（P5）分离，并按前述方法进行培养，每 48 小时更换一次培养基。在 P7 和 P9 时，弃去旧培养基，并向培养板中加入含有活性化合物（浓度为 50 µM）的新鲜条件培养基（CM）。在 P11 时用 4% 多聚甲醛（PFA）固定样本，随后进行冷冻切片。（B）在 rd1 视网膜上进行化合物测试。切片样本来自野生型（WT）、经化合物 003 处理（003）及未处理（NT）的类器官型视网膜外植培养物。采用 TUNEL 检测（红色）作为细胞死亡的标记，DAPI 染色显示细胞核（蓝色）。柱状图展示了 WT、rd1 NT 和 rd1 003 条件下死亡细胞所占百分比。结果显示，化合物 003 处理显著减少了 rd1 视网膜光感受器细胞的死亡。（C）使用 2-脱氧-葡萄糖（2-DG）处理在野生型视网膜上模拟 2 型糖尿病（T2DM）。对未处理（NT）和 T2DM 样本进行 TUNEL 检测。定量分析表明，细胞死亡显著增加。请点击此处查看该图的放大版本

表 S1.  请点击此处下载表格

表 S2.  请点击此处下载表格

表 S3.  请点击此处下载表格

讨论

本方案描述了在无血清、无抗生素的确定性R16培养基中，对小鼠视网膜进行保留完整视网膜色素上皮（RPE）的器官型外植体培养。该方案最初始于20世纪80年代后期7,28 ，此后不断得到优化6,11,12。其重要应用包括遗传性视网膜变性机制的研究以及视网膜保护药物的筛选23,29,30。

为了确保实验成功，需要考虑一些重要因素。以下是一些重要的故障排除要点，有助于提高培养物的质量。首先，视网膜培养物可能出现过度折叠和/或玫瑰花环样结构形成31。这可能是由于在分离操作过程中镊子接触到了视网膜所致。此外，必须将睫状体从外植体上完全去除，因为残留的睫状体会在培养过程中加剧视网膜折叠。其次，在将视网膜转移至培养板形成悬滴时，如果视网膜贴附于膜的朝向错误（即背面朝下），可保持悬滴悬挂于移液枪头末端，并非常轻柔地将液体反复吸入和推出枪头（不使悬滴脱落），以使视网膜翻转至正确方向。最后，如果视网膜色素上皮（RPE）仍附着在巩膜上而与视网膜分离，则很可能是由于巩膜预消化不充分所致。该问题在使用较年老动物或非啮齿类物种（例如猪）的眼组织时尤为突出，可通过提高蛋白酶K浓度来解决。

进行视网膜器官型外植体培养是一项复杂的技术，需要充分的培训和经验。缺乏培训可能导致视网膜外植体质量的不一致。因此，监测并验证其存活率和可重复性非常重要，例如可通过TUNEL染色法检测细胞死亡率。使用无抗生素培养基会使视网膜外植体容易受到细菌和真菌污染。为尽量降低这一风险，我们建议务必在真正无菌的条件下进行操作。体外in vitro 视网膜培养的另一局限性在于其理化环境与体内in vivo视网膜存在差异（例如脉络膜和视网膜的血液供应、氧和葡萄糖水平、眼内压以及玻璃体成分）。采用连续灌注系统，或许结合专用生物反应器32 ，可使该模型更接近体内in vivo 状态。此外，在视网膜分离过程中视神经的轴切会导致节细胞死亡，可能引发应激反应8。因此，建议在对视网膜外植体进行特定干预或处理之前，先使其在体外in vitro 条件下适应至少2天。

所述方法通常用于未成熟的视网膜组织，这些组织在体外可良好存活长达4周in vitro7,33。然而，该操作可根据多种应用进行调整，包括成年视网膜的培养。尽管已有不同的发表方法描述了不带视网膜色素上皮（RPE）的成年视网膜分离技术34,35，但在解剖前于37 °C条件下用木瓜蛋白酶溶液孵育长达1小时，可使RPE保持附着于视网膜，即使该组织来源于成年小鼠36。

无血清培养基和化学成分明确的体外环境使得实验条件能够被完全定义并可重复地操控。因此，类器官视网膜外植体培养是眼科和神经科学领域的重要工具，已被用于研究视网膜疾病37、视网膜发育38,39、视网膜干细胞治疗40、基因修饰41以及药理学筛选。作为药物测试的一个具体示例，本文中我们使用视网膜外植体培养来检测一种cGMP类似物（CN003），该化合物已知可在遗传性视网膜疾病的动物模型中减少感光细胞的死亡23 （图3B）。该技术的另一个可能应用见于 图3C，该图展示了如何利用对组织环境的精确控制来模拟糖尿病条件24。由于在整个培养期间组织结构得以保持，类器官视网膜外植体培养也适用于电生理学研究。已有研究通过膜片钳记录42 和多电极阵列（MEA）记录33,43来检测视网膜外植体上的神经元功能。后者可同时记录神经元群体的电活动，已被用于表征培养条件下感光细胞和节细胞的功能特性。从更广泛的角度来看，类器官外植体培养系统也可应用于临床前研究，例如曾利用外植体培养来测试低温治疗的疗效44。

类器官外植体培养技术操作相对简单，与相应的体内实验相比，成本更低、耗时更短，且避免了活体动物研究相关的伦理问题。对实验条件的精确控制以及对视网膜色素上皮（RPE）和组织复杂性的保留，使该方法成为增进我们对视网膜生理学和病理生理学认知的有力工具，并可支持多种实验应用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了欧盟（transMed；H2020-MSCA-765441）、德国研究基金会（DFG；PA1751/8-1，10-1）以及中国国家留学基金管理委员会的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物素SigmaB4639
(±)-α-硫辛酸（=硫辛酸）SigmaT1395
BSASigmaB4639
CDP-胆碱钠盐Sigma30290
皮质酮SigmaC2505
CuSO4 × 5H2OSigmaC8027
DL-生育酚SigmaT1539
乙醇胺SigmaE0135
FCSSigmaF7524
Filtropur BT100，1L，0.2µmSARSTEDT83.3942.101用于基础培养基
镊子 F.S.T15003-08
谷氨酰胺SigmaG8540
谷胱甘肽SigmaG6013
胰岛素 SigmaI6634
L-半胱氨酸盐酸盐SigmaC7477
亚油酸SigmaL1012
α-亚麻酸SigmaL2376
MnCl2 × 4H2OSigmaM5005
丙酮酸钠SigmaP3662
NaSeO3 × 5H2OSigmaS5261
眼科显微刮匙F.S.T.10360-13
孕酮SigmaP8783
蛋白酶K MP Biomedicals2193502544 mAnson U/mg
R16Gibco07491252A
视黄醇SigmaR7632
醋酸视黄酯 SigmaR7882
剪刀F.S.T15004-08
无菌滤器 0.22µmMILLEX GPSLGP033RS用于添加物
T3 SigmaT6397
醋酸生育酚SigmaT1157
转铁蛋白SigmaT1283
Transwell 可渗透支持物Corning3412
维生素B1SigmaT1270
维生素B12SigmaV6629
维生素CSigmaA4034

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