हम विशेष रूप से व्यवहार के दौरान और उत्तेजनाओं के जवाब में वयस्क ड्रोसोफिला के पूरे मस्तिष्क की छवि के अनुरूप एक विधि प्रस्तुत करते हैं। सिर पूरे मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देने के लिए तैनात है, जबकि मक्खी अपने पैरों और एंटीना, सूंड की नोक, और आंखों संवेदी उत्तेजनाओं प्राप्त कर सकते हैं स्थानांतरित कर सकते हैं ।
हम चलने जैसे चल रहे व्यवहार के दौरान पूरे ड्रोसोफिला मस्तिष्क को छवि देने के लिए विशेष रूप से विकसित एक विधि पेश करते हैं। सिर निर्धारण और विच्छेदन व्यवहार पर उनके प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। यह पहली बार एक धारक है कि आंदोलन बाधाओं को कम करने का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है । फ्लाई के सिर के पीछे एक कोण पर इस धारक से चिपका हुआ है जो फ्लाई की चलने, दूल्हे, गंध, स्वाद और देखने की क्षमता को बनाए रखते हुए पूरे मस्तिष्क तक ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति देता है। सिर के पीछे ऑप्टिकल पथ और सिर आंदोलन कलाकृतियों के लिए जिम्मेदार मांसपेशियों में ऊतकों को हटाने के लिए विच्छेदित किया जाता है। फ्लाई ब्रेन को बाद में मस्तिष्क गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए इमेज किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कैल्शियम या वोल्टेज संकेतकों का उपयोग करके, चलने या संवारने जैसे विशिष्ट व्यवहारों के दौरान, और विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में। एक बार चुनौतीपूर्ण विच्छेदन, जो काफी अभ्यास की आवश्यकता है, महारत हासिल किया गया है, इस तकनीक के व्यवहार और उत्तेजना प्रतिक्रियाओं के लिए पूरे मस्तिष्क गतिविधि से संबंधित अमीर डेटा सेट रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है ।
विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मस्तिष्क गतिविधि इमेजिंग मस्तिष्क समारोह की समझ गहरा गया है। मनुष्यों में, मस्तिष्क इमेजिंग तकनीकों की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं: जबकि कार्यात्मक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एफएमआरआई) एक न्यूरॉन संकल्प से काफी नीचे स्थानिक-लौकिक संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रोएंसेफलोग्राफी (ईईजी) जैसी तेज तकनीकें केवल मस्तिष्क तक अप्रत्यक्ष और आंशिक पहुंच की अनुमति देती हैं1। कृंतक जैसे पर्याप्त बड़े पशु मॉडलों में, सिर पर चढ़कर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट गतिविधि सेंसर (जैसे, जीसीएएमपी) की रिकॉर्डिंग मस्तिष्क गतिविधि का निरीक्षण करने की अनुमति देती है, जबकि जानवर अपने पर्यावरण2में आगे बढ़ रहा है। फिर भी, ये तकनीक वर्तमान में केवल मस्तिष्क के एक छोटे से हिस्से तक पहुंच देती है। हेड-फिक्स्ड जानवरों को अधिक व्यापक रूप से चित्रित किया जा सकता है, लेकिन कवरेज अभी भी आंशिक है (उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स सतह3)। यह केवल छोटे जानवरों में होता है, जैसे जेब्राफिश लार्वा, सी एलिगेंस और ड्रोसोफिला कि पूरे मस्तिष्क को एकल न्यूरॉन्स4के स्तर पर या उसके करीब लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ चित्रित किया जा सकता है।
D. मेलनोगैस्टर विशेष रूप से आशाजनक है क्योंकि इसे लंबे समय से आनुवंशिक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जाता रहा है5 और शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण विकसित किए गए हैं6। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी7से प्राप्त नए बड़े पैमाने पर शारीरिक नेटवर्क से पूरित यह फ्लाई बड़े पैमाने पर नेटवर्क8पर उत्पन्न जटिल मस्तिष्क गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान कर सकती है । हालांकि क्यूटिकल पारदर्शी नहीं है, और इस प्रकार मस्तिष्क की छवि के लिए हटा दिया जाना चाहिए, वीवो कार्यात्मक इमेजिंग में 20029 में पहले अध्ययन के बाद से अधिक से अधिक आम जगह बन गई है और कई प्रोटोकॉल पहले ही प्रकाशित किए जा चुके हैं। हालांकि, इन तरीकों में या तो मक्खी के सिर को शरीर से10से अलग करना, फ्लाई के आंदोलनों को गंभीर रूप से प्रतिबंधित करना और/या उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएं11,12,13,14,15,या केवल एक छोटे की अनुमति शामिल है मस्तिष्क का कुछ हिस्सा9 ,16,25,26,27,17,18,19,20 ,21,22,23,24 इन फिर भी शक्तिशाली दृष्टिकोणों को पूरक करने के लिए, हमने हाल ही में विभिन्न उत्तेजनाओं28के व्यवहार और प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क को छवि देने की तैयारी विकसित की है।
यहां, हम इस अध्ययन पर विशेष रूप से पूरे मस्तिष्क की छवि के लिए विकसित एक विधि पेश करने के लिए निर्माण करते हैं, जबकि फ्लाई अर्ध-प्राकृतिक व्यवहार (यानी चलने और संवारने) का जवाब देती है और संवेदी उत्तेजनाओं का जवाब देती है। यह एक अवलोकन धारक का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है जो पृष्ठीय-पीछे की ओर से पूरे मस्तिष्क तक पहुंच देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि एंटीना और सूंड को बरकरार छोड़ रहा है, और फ्लाई को चलने के लिए अपने पैरों को स्थानांतरित करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, हवा से तकिया गेंद पर)। सिर के पीछे विच्छेदन के लिए कदम गति, प्रजनन क्षमता के लिए परिष्कृत किया गया है, और व्यवहार्यता और मक्खी की गतिशीलता पर उनके प्रभाव को कम करने के लिए ।
ड्रोसोफिला दुर्लभ वयस्क जानवरों में से एक है जहां जटिल व्यवहार के दौरान पूरे मस्तिष्क को चित्रित किया जा सकता है। यहां, हम मक्खी को तैयार करने और अपने पूरे मस्तिष्क को चालू पूरे मस्तिष्क गतिविधि की छवि के लिए बेनकाब करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए ।
डी मेलनोगास्टर जैसे छोटे जानवर को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार विधि को इसमें महारत हासिल करने के लिए बहुत अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रशिक्षण के बाद, प्रक्रिया में 30 मिनट से भी कम समय लगता है और प्रजनन योग्य परिणाम पैदा होता है।
हमारे द्वारा प्रस्तुत विधि में अतिरिक्त सीमाएं हैं। सबसे पहले, अपनी प्राकृतिक स्थिति से मक्खी सिर झुकाव गर्दन जो संयोजी ऊतक, नसों या मांसपेशियों के लिए हानिकारक हो सकता है खींच की ओर जाता है । दूसरा, हालांकि वेंट्रल सब्सोफेगल जोन (एसईजेड) ऑप्टिकल रूप से सुलभ है, यह अर्ध-पारदर्शी घेघा से नीचे है, जो इस क्षेत्र में तीव्रता और संकल्प को कम करता है। अंत में, हालांकि धारक अधिकांश दिशाओं में पहुंच से बाहर है, मक्खी अभी भी कभी-कभी अपनी उपस्थिति का एहसास करती है और बचने की कोशिश करने के लिए उस पर धक्का देती है।
इन सीमाओं के बावजूद, व्यवहार और उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं के दौरान पूरे मस्तिष्क इमेजिंग से प्राप्त व्यापक डेटा पूरे नेटवर्क के स्तर पर मस्तिष्क समारोह को समझना संभव बना देगा जब जानवर जटिल, प्रकृतिवादी वातावरण के साथ बातचीत करता है और नेविगेट करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी मदद के लिए हीदी मिलर-मोमर्सकम्प और पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए इवथ मेलिसा गुआटिबोन्ज़ा अरेवालो का शुक्रिया अदा करते हैं। प्रोटोकॉल के प्रारंभिक संस्करण राल्फ ग्रीनस्पैन की प्रयोगशाला में विकसित किए गए थे। इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा विशेष रूप से आईजीके को अनुदान FOR2705 (TP3) के माध्यम से, और सिमंस फाउंडेशन (एमऑन – 414701) और कावली इंस्टीट्यूट फॉर ब्रेन एंड माइंड (अनुदान संख्या #2017-954) द्वारा एसए द्वारा प्राप्त किया गया था।
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |