方法文章

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

DOI：

10.3791/61879

⸱

2021年3月14日

 ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成人心肌细胞（CMs）、心脏成纤维细胞（CFs）和内皮细胞（ECs）为研究驱动心脏组织发育与疾病的多种心血管细胞类型之间的复杂相互作用提供了独特机遇。在心脏组织模型领域，已有多种复杂的三维（3D）方法利用诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs），结合细胞外基质和交联剂，以模拟生理相关性及天然组织微环境。然而，这些系统在缺乏微加工技术专长的情况下难以制备，且需要数周时间才能完成自组装。更为重要的是，这些系统大多缺少构成人类心脏中超过60%非心肌细胞的心脏血管细胞和心脏成纤维细胞。本文描述了从iPSCs中同时获得上述三种心脏细胞类型并构建心脏微组织的方法。这种简便的复制模塑技术可在标准多孔细胞培养板中实现心脏微组织的长期培养（数周）。该平台允许用户通过初始接种密度调控微组织尺寸，且仅需不到3天即可完成自组装并观察到心脏微组织的收缩活动。此外，心脏微组织可被轻松消化，同时保持较高的细胞活性，便于利用流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行单细胞水平的分析。我们预计该 体外 心脏微组织模型将有助于加速药物发现和疾病建模中的验证研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管研究领域的药物发现和疾病建模由于缺乏临床相关样本和转化工具不足而面临诸多挑战1高度复杂的临床前模型或过度简化的模型 体外 单细胞模型无法以可重复的方式表现出病理生理条件。因此，多种微型化组织工程平台应运而生，旨在弥合这一差距，实现在高通量应用便捷性与组织功能真实再现之间的平衡2,3随着诱导性多能干细胞（iPSC）技术的出现，组织工程技术可应用于具有或不具有基础心血管疾病状态的患者特异性细胞，以回答科研问题4,5,6此类具有与心脏组织相似细胞构成的组织工程模型，可应用于药物开发中，用于检测由一种或多种细胞类型行为的病理变化所引起的心脏毒性和功能障碍。

由人iPSCs衍生的自组装微组织或类器官是三维（3D）结构，为微型的类组织聚集体，具有与其对应组织相似的功能特性 体内 对应物。有多种不同的方法可实现类器官的形成 原位 通过iPSCs的定向分化或拟胚体的形成4由此产生的类器官是研究驱动器官发生的形态发生过程不可或缺的工具。然而，由于存在多种细胞群体以及自我组织能力的差异，不同类器官之间的实验结果可能出现变异。5或者，由具有组织特异性细胞类型的预分化细胞自组装形成的微组织，是研究局部细胞间相互作用的优良模型，尤其适用于能够分离自组装组分的情况。在人类心脏研究中，当细胞来源于不同患者细胞系或商业来源时，构建包含多种细胞成分的三维心脏微组织已被证明具有较大挑战性。

为了加深我们对细胞在生理相关且个性化的环境中行为机制的理解， 体外 模型中，理想情况下所有组成细胞类型均应来源于同一患者的细胞系。在人类心脏的背景下，一个真正具有代表性的 cardiac 体外 该模型将捕捉主要细胞类型之间的相互作用，即心肌细胞（CMs）、内皮细胞（ECs）和心脏成纤维细胞（CFs）6,7心肌组织的忠实再现不仅需要生物物理拉伸和电生理刺激，还需要来自内皮细胞（ECs）和成纤维细胞（CFs）等支持性细胞类型的细胞间信号传导。8. 心脏成纤维细胞参与细胞外基质的合成及组织结构的维持；在病理状态下，心脏成纤维细胞可诱导纤维化并改变心肌细胞的电传导9类似地，内皮细胞可通过旁分泌信号传导以及提供关键的代谢需求来调节心肌细胞的收缩特性10因此，需要由全部三种主要细胞类型组成的人类心脏微组织，以开展具有生理相关性的高通量实验。

本文介绍了一种自下而上的方法，用于构建心脏微组织，该方法通过获取人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）、诱导多能干细胞来源的内皮细胞（iPSC-ECs）以及诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞（iPSC-CFs），并在均一的心脏微组织阵列中进行三维共培养。这种简便的心脏微组织制备方法可生成自发搏动的心脏微组织，适用于心脏生理功能的疾病建模以及药物的快速功能性和机制性测试。此外，此类多细胞心脏微组织平台还可结合基因组编辑技术，在慢性或急性培养条件下模拟随时间推移的心脏疾病进展过程。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 培养基、试剂和培养板的制备

  1. 细胞培养用细胞洗涤液：使用不含钙和镁的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（HBSS）。
  2. 心肌细胞分化培养基
    1. 通过将 10 mL 补充剂（50× B27 加胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备分化培养基 #1。
    2. 通过将 10 mL 补充剂（50× B27 减胰岛素）加入 500 mL 心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备分化培养基 #2。
    3. 通过将补充剂（50× B27 加胰岛素）加入 500 mL 无葡萄糖的心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）中，制备纯化培养基 #3。
  3. 内皮细胞生长培养基及磁珠激活细胞分选（MACS）试剂
    1. 使用市售内皮细胞生长培养基补充剂试剂盒配制内皮细胞生长培养基（EGM）。
    2. 通过将牛血清白蛋白（BSA）储备液用洗涤液按 1:20 稀释，制备细胞分离分选缓冲液。
  4. 心脏成纤维细胞分化培养基：使用成纤维细胞基础培养基（DMEM 高糖）和无血清成纤维细胞生命因子试剂盒配制心脏成纤维细胞分化培养基。
  5. 心脏微组织构建与维持培养基：将心肌细胞基础培养基（RPMI 1640）与补充剂（50× B27 加胰岛素）和 EGM 按 70/30 体积比混合，过滤后制备成培养基。
  6. 小分子与生长因子储备液
    1. 为三种细胞类型的分化准备 GSK3-β 抑制剂 CHIR 99021（6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈）、Wnt 抑制剂 IWR-1-endo（4-(1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-亚甲桥-2H-异吲哚-2-基)-N-8-喹啉基-苯甲酰胺）以及转化生长因子 β（TGF-β）抑制剂 SB431542（4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺），各取 200 µL，用二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 mM 浓度的储备液。
    2. 为人类诱导多能干细胞来源内皮细胞（iPSC-EC）的分化，使用含 0.1%（w/v）BSA 的超纯蒸馏水配制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20 µg/mL）、血管内皮生长因子 165（VEGF165；50 µg/mL）和骨形态发生蛋白 4（BMP4；20 µg/mL）的储备液，每种各分装 100 µL。将分装液储存在 -20 °C；如需长期保存，可在 -80 °C 保存长达 1 年。
  7. iPSC-CM、iPSC-EC 和 iPSC-CF 维持用预包被培养板
    1. 通过将生长因子减少型（GFR）基底膜基质介质按 1:200 比例用 DMEM/F12 稀释，制备用于 iPSC-CM 重铺的基底膜基质包被 6 孔板。每孔加入 2 mL 稀释后的基底膜基质介质，静置至少 2 至 4 小时使其凝固。
    2. 使用明胶预包被 6 孔板或 10 cm 培养皿。将 2% 明胶溶液在 37 °C 水浴中液化，并根据需要以适当体积用 PBS 配制过滤后的 0.2%（v/v）明胶溶液。使用前，在 37 °C 下用 10 mL 0.2% 明胶溶液包被培养板至少 30 分钟。
      ​注意：经 MACS 分选后，明胶包被板可用于 iPSC-CF 和 iPSC-EC 的培养。
  8. 微组织模具的制备：在干燥的 100 mL 玻璃瓶中配制 2% 低熔点琼脂糖的 PBS 溶液。使用前，在 121 °C、15 psi 条件下灭菌 20 分钟。将铸造用硅胶微模具在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。
  9. 用于消化、免疫染色和流式细胞术的溶液
    1. 为微组织消化，配制含 Dispase I（1 U/mL）和 Liberase（3 U/mL）的酶消化缓冲液于 PBS 中。该溶液需置于冰上保存。
    2. 用于细胞和微组织固定的固定液，使用市售的含 4.2% 多聚甲醛（PFA）的冰冻固定试剂。
    3. 配制 PBS 中含 0.25% Triton X-100 的通透液和含 0.1% Tween-20 的洗涤液。溶液可在室温下储存。
    4. 用于荧光激活细胞分选（FACS）分析，配制 FACS 缓冲液 [含 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或 HBSS]，并储存在 4 °C。
    5. 用于免疫染色，配制 PBS 中含 2% 正常山羊/驴/兔血清的封闭液。根据抗体的宿主来源选择相应物种的血清。

2. 心脏分化与纯化

注意：所有诱导多能干细胞（iPSCs）在进行心肌细胞分化前应维持在约75%至80%的融合度。本方案所用的iPSCs系通过塞内加尔病毒重编程技术，由斯坦福心血管研究所（SCVI）生物样本库的外周血单个核细胞（PBMCs）衍生而来。

  1. 分化前，将iPSC集落培养至第20代（P20）。
  2. 从6孔板中移除iPSC培养基，并用2 mL PBS洗涤细胞一次。
  3. 第0天，通过在每孔中加入含CHIR（终浓度6 µM）的2 mL分化培养基#1开始中胚层诱导。不同iPSC细胞系所需的CHIR终浓度可能在6至9 µM之间有所差异，因此建议在6孔板中测试不同CHIR浓度，以确定最佳的心脏中胚层诱导条件。
  4. 第2天，每孔更换为新鲜的2 mL培养基#1，以恢复细胞生长。
  5. 第3天，每孔更换为含Wnt抑制剂IWR-1-endo（5 µM）的2 mL分化培养基#1，以诱导心脏谱系特化。
  6. 第5天，每孔更换为新鲜的2 mL培养基#1，以恢复细胞。
  7. 第7天，每孔更换为2 mL培养基#2。心肌细胞的自发搏动最早可在第8–9天观察到；某些细胞系中，搏动细胞可能晚至第11天才出现。
  8. 为纯化分化培养物，于第10天在每孔中更换为2 mL无葡萄糖的培养基#3。
  9. 第13天，每孔更换为含葡萄糖的2 mL培养基#2，以恢复细胞。
  10. 第16天，使用每孔2 mL的培养基#3进行第二轮纯化。
  11. 第19天，用含葡萄糖的2 mL培养基#2恢复细胞。
  12. 第20天，用1 mL PBS洗涤各孔一次，并在37 °C下使用1 mL 10倍胰蛋白酶消化6分钟以解离细胞。孵育后，细胞在少于15秒内从孔底脱落成为单细胞，立即加入等体积的培养基#2至15 mL锥形管中以中和酶活性。将细胞悬液在270 × g 条件下离心3分钟。
  13. 将细胞沉淀重悬于3 mL培养基#3中。计数细胞后，加入适量培养基#3，将总计约300万个细胞接种至新的基底膜基质包被的6孔板中，每孔接种一等份。传代后第二天，更换为新鲜的2 mL培养基#2，并每隔一天补充2 mL培养基#2，直至进行心肌细胞胰酶消化用于冻存或后续实验。

3. 内皮细胞分化与磁珠分选

  1. 当iPSC融合度达到75%至80%时，用PBS洗涤培养板，每孔2 mL。
  2. 在第0天开始分化，更换为含6 µM CHIR的2 mL分化培养基#1。
  3. 在第2天，更换为含2 µM CHIR的2 mL分化培养基#1。
  4. 在第4天，更换为2 mL EGM培养基，并补充20 ng bFGF-2、50 ng VEGF165和20 ng BMP4。
  5. 从第6天到第10天，每2天更换一次2 mL添加了生长因子的EGM培养基。可选择性加入8 µM浓度的TGFβ抑制剂（SB431542），以促进内皮细胞扩增并抑制其他间充质来源细胞类型的分化。
  6. 在第12天，开始进行MACS 操作：每孔加入1 mL PBS冲洗，随后在37 °C条件下，每孔加入1 mL 10倍浓度胰蛋白酶消化8分钟。
  7. 在50 mL锥形管中准备等体积的EGM培养基以中和消化酶。将40 µm细胞筛置于50 mL锥形管上，使消化后的细胞悬液通过筛网过滤。每消化2至3个孔更换一次滤网。
  8. 使用0.4%台盼蓝染色，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定总活细胞数。
  9. 在预冷至4 °C的离心机中，以300 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。
  10. 弃去上清液，根据步骤3.8中的总细胞数，用适量体积的分选缓冲液重悬细胞沉淀。
    注：每107个总细胞加入80 µL分选缓冲液。
  11. 进行磁珠标记时，每107个细胞加入20 µL FcR阻断试剂，孵育5分钟。
  12. 每107个细胞加入20 µL CD144或CD31微珠，充分混匀。将细胞悬液在4 °C避光孵育15分钟。
  13. 加入20 mL分选缓冲液洗涤标记后的细胞，并在4 °C预冷的离心机中以300 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。
  14. 用3 mL分选缓冲液重悬细胞沉淀，并置于冰上保存。
  15. 将分选柱插入磁力分离架的卡槽中，完成磁性分离柱的准备。
  16. 用3 mL分选缓冲液冲洗分选柱进行平衡，流出液收集至废液锥形管中。
  17. 待冲洗缓冲液完全流尽后，充分重悬细胞悬液以打散任何团块，然后将细胞悬液加至分选柱中。
  18. 待细胞悬液完全流过分选柱后，用3 mL分选缓冲液洗涤三次，以去除未标记的细胞。
  19. 将分选柱从磁力架上取下，转移至15 mL锥形管中，用于收集CD144+/CD31+细胞。
  20. 向分选柱中加入5 mL分选缓冲液，并立即用推杆冲洗出磁性标记的细胞。
  21. 使用0.4%台盼蓝染色，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定活细胞数量。
  22. 在预冷至4 °C的离心机中，以300 x g离心3分钟，收集细胞沉淀。
  23. 根据步骤3.21中的总细胞数，用适量体积的EGM培养基（含5–8 µM TGFβ抑制剂SB431542）重悬细胞沉淀。
  24. 将此第0代（P0）细胞以适当密度（4 x 104 细胞/cm2） 接种于预先包被0.2%明胶的培养板上。
  25. 对于P0和P1代细胞，继续每2天更换一次含TGFβ抑制剂的新鲜EGM培养基。从P2代开始，细胞可在不含TGFβ抑制剂的内皮细胞生长培养基中培养。

4. 心脏成纤维细胞分化

  1. 让iPSCs生长至90%至95%汇合度；每孔用1 mL PBS洗涤一次。
  2. 在第0天开始分化，每孔加入2 mL分化培养基#1，并添加11 µM CHIR。对于敏感的iPSC细胞系，CHIR浓度可在9–10 µM之间调整。
  3. 在第1天观察培养板。此时出现明显的细胞死亡是正常现象，约有30%至40%的细胞仍贴壁。
  4. 在第3天，每孔加入2 mL分化培养基#1，并添加5 µM IWR-1-endo，以促进心脏前体细胞的扩增。
  5. 在第4天，将培养基更换为2 mL心脏成纤维细胞分化培养基。此后每2天更换一次新鲜培养基，直至第16天。
  6. 在第18天，每6孔板的每孔中加入1 mL 10倍浓度的胰蛋白酶，在37 °C孵育10分钟以消化细胞。
  7. 充分吹打使细胞层完全解离，并将细胞悬液转移至含有等体积DMEM/F12培养基（补充5% FBS）的50 mL锥形管中，经70 µm细胞筛过滤。
  8. 使用0.4%台盼蓝染色，通过血细胞计数板或自动细胞计数仪测定活细胞数量。
  9. 将细胞悬液以300 x g 离心5分钟，收集细胞沉淀。
  10. 首次传代时，将细胞沉淀重悬于适量分化培养基中，按6 x 104 cells/cm2的密度接种至0.2%明胶包被的培养板，培养至90%汇合度。
  11. 进行传代后，将心脏成纤维细胞维持在含10%血清的常规DMEM/F12培养基中，并接种于明胶包被的培养板上培养。

5. 心脏微组织模具的制备与细胞接种

  1. 将琼脂糖放入100 mL玻璃瓶中，用微波炉加热至沸腾。喷洒琼脂糖瓶表面，并将其置于生物安全柜中，静置冷却约3分钟。
  2. 用移液器吸取700 µL熔融琼脂糖，加入9 × 9阵列的硅胶微模具中。移液时避免产生气泡。
  3. 将模具小心放置于预冷的冰块上，以加速琼脂糖凝胶化。
  4. 确保琼脂糖完全凝胶后变得半透明。轻轻弯曲微模具边缘，使琼脂糖复制品松动，然后从四周轻轻剥离，将琼脂糖复制品从硅胶微模具中分离。
  5. 将含有81个圆形凹孔（直径800 µm，深度800 µm）的琼脂糖微组织培养板转移至无菌的12孔板中。
  6. 向琼脂糖微组织培养板中加入2 mL PBS，并在显微镜下检查是否存在滞留气泡或形状不规则的孔穴。
  7. 将琼脂糖培养板浸入2 mL 70%乙醇中过夜，随后在生物安全柜中进行紫外线照射处理1小时。
  8. 使用前，移除70%乙醇，用蒸馏水洗涤两次，最后用2 mL PBS洗涤一次。
  9. 对iPSC-CMs、iPSC-ECs和iPSC-CFs进行胰酶消化、中和并计数，将细胞悬液置于冰上保存。
  10. 小心移除孔内PBS及细胞接种室中的液体，避免触碰凹孔区域。
  11. 在新离心管中，按7:2:1的比例混合iPSC-CMs、iPSC-ECs和iPSC-CFs，使最终细胞密度达到106 cells/mL。更高的细胞密度将形成更大的微组织。
    注意：细胞密度不得超过2 × 106 cells/mL。
  12. 小心地将200 µL细胞悬液逐滴加入接种室中。
  13. 将细胞置于37 °C、CO2培养箱中静置沉降2小时。
  14. 在琼脂糖模具周围加入微组织制备培养基，液面刚好覆盖内室表面即可。
  15. 24小时后，细胞在圆形凹孔中自发组装并显著收缩。此后每2天更换一次新鲜培养基以维持培养。

6. 免疫染色用细胞和心脏微组织的固定与通透处理

  1. 针对每种特定细胞类型，将细胞分别培养于基底膜基质培养基或明胶包被的腔室载玻片上（约 2.5–3 x 105 个细胞/mL）。可通过轻柔冲洗圆形凹槽，将心肌微组织收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
  2. 吸除培养基，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞或微组织；随后在室温下，使用含 4.2% 多聚甲醛（PFA）的固定液固定，腔室载玻片固定 20 分钟，微组织固定 1 小时。
  3. 吸除 PFA 溶液，向腔室载玻片中加入 1 mL 通透液（含 0.25% Triton X-100 的 PBS），通透 5 至 7 分钟；对于微组织，在 15 mL 圆锥形离心管中通透 20 分钟。
    注意：从本步骤开始，样品可在台式摇床上轻轻振荡处理。
  4. 吸除通透液，用 2 至 3 mL PBS 轻柔冲洗一次。
  5. 将细胞与 500–1,000 µL 封闭液（含 2% 至 5% 正常山羊血清或驴血清）孵育，腔室载玻片至少 1 小时，微组织则需 3 至 4 小时。
  6. 将细胞或心肌微组织与用封闭液配制的偶联抗体共同孵育，抗体用量应足以覆盖样品。腔室载玻片使用抗心肌肌钙蛋白 T（cTnT2）（1:50）、抗 CD31（1:75）及抗 DDR2/波形蛋白（Vimentin）（1:50）抗体孵育 1 小时；心肌微组织则于 4 °C 过夜孵育。
  7. 腔室载玻片用 500 µL 含 0.1% Tween-20 的 PBS 洗涤三次，每次间隔 5 分钟，最后用 PBS 进行终末洗涤。
  8. 对于心肌微组织，使用 2 mL 含 0.1% Tween-20 的 PBS 洗涤五次，每次间隔 20 分钟，并额外进行一次 20 分钟的终末洗涤。
  9. 在进行共聚焦显微镜观察前，将细胞或微组织与 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1 µg/mL）孵育。
  10. 对于心肌微组织，小心转移至 35 mm 玻璃底培养皿中，并加入 PBS 浸没微组织。
  11. 进行三维成像时，使用 20 倍或 40 倍油镜物镜获取微组织中心焦点，并针对每种荧光染料调整曝光参数。
  12. 为获取 Z 轴层扫图像，在 Live 模式下设定起始与终止坐标，总成像深度为 100–200 µm，层间切片间隔为 5–10 µm。

7. 心脏微组织的消化及流式细胞术用细胞的制备

  1. 为消化微组织，使用宽口1 mL移液器吸头将微组织轻轻从圆形凹槽中冲洗至15 mL锥形管中，所用液体为培养基#1。
  2. 让微组织自然沉降，小心吸除上清液，用1 mL PBS洗涤细胞或微组织一次，随后加入200–300 µL酶消化缓冲液，在37 °C孵育20分钟。孵育至10分钟时，轻柔吹打混合微组织1分钟，然后继续在37 °C孵育至设定时间结束。
  3. 孵育结束后，使用常规1 mL移液器吸头剧烈吹打混合微组织，以获得浑浊的单细胞悬液。
  4. 当微组织充分消化为单细胞后，立即加入含5% FBS的5 mL培养基中和消化反应，并通过40 µm细胞滤网过滤细胞悬液。计数总细胞数后，将单细胞悬液在4 °C下以300 x g 离心 5分钟。
  5. 吸除上清液，将1 × 105–1 × 106个细胞重悬于100 µL Annexin结合缓冲液中，加入FITC标记的Annexin V和100 µg/mL碘化丙啶（PI）或To-Pro3死细胞排除染料，在冰上避光孵育10分钟。
  6. 孵育结束后，向细胞悬液中加入300 µL Annexin结合缓冲液，转移至圆底FACS管中进行流式细胞术分析。根据所选荧光染料，使用相应的激光器和发射滤光片。
  7. 若需使用固定细胞定量细胞表面标志物，请按照步骤6.2和6.3所述方法对细胞沉淀进行固定和通透处理。
  8. 通透处理后，用4 mL FACS缓冲液（含2% FBS的PBS）洗涤细胞沉淀一次，然后加入相应偶联抗体，4 °C避光孵育1小时。孵育后用4 mL FACS缓冲液洗涤细胞沉淀，并在300 x g下离心3分钟。重复洗涤步骤两次。
  9. 将细胞重悬于200–300 µL FACS缓冲液中，用于流式细胞术分析。
  10. 使用未染色样本调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数，并建议为每种荧光染料设置同型对照，以优化激光电压设置。每份样本至少采集20,000个事件用于数据分析。

8. 自发性搏动心肌微组织收缩分析的实施

  1. 录制心脏微组织的视频，以捕捉至少三个搏动周期。将录制分辨率设置为至少 1280 x 720 像素，帧率>30 帧/秒，并将视频保存为 .AVI 格式。
  2. 在 MATLAB 环境中运行 MotionGUI 脚本11，以启动用户界面。
  3. 在文件夹中找到 .AVI 文件的位置以加载视频，然后在输入面板中输入视频拍摄时的帧率。
  4. 在高级输入面板中，可根据分辨率和成像放大倍数设定像素尺寸。
  5. 可指定合适的宏块像素大小（默认值为 16），并根据微组织收缩强度设定可检测的像素运动范围。
  6. 调整参数后，点击Get Motion Vectors 开始分析。
  7. 使用Choose AOI单选按钮选择感兴趣区域，以排除圆形凹槽内单个微组织周围区域。
  8. 使用Map Time Ave功能生成基于 X 和 Y 轴方向运动检测结果的平均收缩热图。
  9. 对于峰值追踪数据，使用Get Contraction Data功能自动测量收缩和舒张峰值。
  10. 当信噪比较低时，可设置峰值高度和距离阈值，以准确标注最大收缩速度（蓝色圆点）和最大舒张速度（红色三角形）。
  11. 设置合适的阈值后，选择Analyze Peaks，以获得收缩值、舒张值、搏动频率和搏动间期。
  12. 对至少 25 个独立的微组织进行测量，用于统计分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诱导多能干细胞来源的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的免疫染色与流式细胞术表征
为了构建由iPSC-CMs、iPSC-ECs和iPSC-CFs组成的 cardiac microtissues（心脏微组织），需对这三种细胞类型分别进行分化与表征。体外将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为iPSC-CMs的技术在过去数年中已显著改进。然而，不同细胞系之间iPSC-CMs的产量和纯度仍存在差异。本方案所获得的iPSC-CMs纯度超过75%，并在分化第9天左右开始自发搏动（图1A）。通过在第9至第14天之间进一步纯化，可将iPSC-CMs的纯度提升至80%以上，具体方法如先前所述12。类似地，采用已发表的方案13,14，通过在分化第4–5天添加多种血管生长因子，可诱导来自中胚层的内皮前体细胞极化，从而获得高纯度的iPSC-ECs，并形成表型明确的内皮细胞（

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讨论

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为了从预先分化的心肌细胞（iPSC-CMs）、内皮细胞（iPSC-ECs）和成纤维细胞（iPSC-CFs）生成心脏微组织，必须获得高纯度的细胞培养物，以便在心脏微组织内细胞接触抑制性压缩后更精确地控制细胞数量。最近，Giacomelli 等人18已展示了利用 iPSC-CMs、iPSC-ECs 和 iPSC-CFs 制备心脏微组织的方法。采用所述方法生成的心脏微组织包含约 5,000 个细胞（70% iPSC-CMs、15% iPSC-ECs 和 15% iPSC-CFs）。在该方法中，心肌细胞和内皮细胞被共分化，随后利用 CD34+ 标记物分离内皮祖细胞。本文所述的现有方案中，每个微组织包含 12,000 个细胞（70% iPSC-CMs、20% iPSC-ECs 和 10% iPSC-CFs），从而为后续的单细胞分析提供了更高数量的细胞。此外，由于这三种细胞类型均为独立分化，细胞群体的异质性较低，有助于特异性地研究不同细胞对处理的响应。

在心肌细胞分化方面，我们及其他研究者此前已证明，可在化学成分明确的培养条件下获得纯化的心肌细胞...

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披露

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J.C.W. 是 Khloris Biosciences 的联合创始人，但不存在竞争利益，因为本文所展示的工作完全独立。其他作者报告无利益冲突。

致谢

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感谢Amanda Chase博士对本文手稿提供的有益反馈。本研究获得了加州大学烟草相关疾病研究项目（TRDRP）的资助，项目编号为T29FT0380（D.T.）和27IR-0012（J.C.W.）；美国心脏协会资助编号20POST35210896（H.K.）和17MERIT33610009（J.C.W.）；以及美国国立卫生研究院（NIH）资助编号R01 HL126527、R01 HL123968、R01 HL150693、R01 HL141851，以及NIH UH3 TR002588（J.C.W.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Fisher Scientific08-772-29
3D 微型模具微组织12-81 格式
6孔板Fisher Scientific08-772-1B
AutoMACS 冲洗液赛默飞世尔科技NC9104697
B27 补充剂（不含胰岛素）Life TechnologiesA1895601
B27 补充剂加胰岛素Life Technologies17504-044
BD CytofixBD 生物科学554655
BD Matrigel，hESC认证基质BD 生物科学354277
心肌肌钙蛋白T抗体Miltenyi130-120-403
CD144（VE-钙黏蛋白）MicroBeadsMiltenyi130-097-857
CD31 抗体Miltenyi130-110-670
CD31 微珠Miltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Annexin V FITC/PI 凋亡与死细胞检测试剂盒赛默飞世尔科技V13242
Dispase I默克生命科学4942086001
DMEM，高糖（4.5 g/L），无谷氨酰胺培养基11960044
DMEM/F-12 基础培养基Gibco11320033
不含钙、镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）Life Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
胎牛血清Life Technologies10437
FibroLife 无血清成纤维细胞培养基套装LifeLIne 细胞技术LS-1010
无葡萄糖 RPMI 培养基Life Technologies11879-020
山羊血清Life Technologies16210-064
人碱性成纤维细胞生长因子赛默飞世尔科技13256029
人 VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS 分选柱Miltenyi130-042-401
MACS BSA 储存液Miltenyi130-091-376
MACS 洗涤缓冲液Miltenyi130-091-222
MidiMACS 分离器Miltenyi130-042-302
RPMI 培养基Life Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3赛默飞世尔科技R37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10X赛默飞世尔科技红色
Vimentin Alexa Fluor® 488标记抗体R&D SystemsIC2105G

参考文献

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