无标签定量蛋白经济学工作流程，用于发现驱动的宿主-病原体交互

Summary

在这里，我们提出了一个协议，以分析宿主和病原体之间的相互作用，在感染基于质谱学的蛋白组学。此协议使用无标签量化来测量宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如 新福尔曼隐球菌）的蛋白质丰度变化。

Abstract

基于质谱学（MS）的定量蛋白质组学的技术成就为分析生物体在不同条件下的全球蛋白质组开辟了许多未被发现的途径。这种强大的策略应用于微生物病原体与所需宿主的相互作用，全面地描绘了两种感染视角。在此，工作流描述了 密码球菌新福尔曼的 感染物的无标签量化（LFQ），这是一种真菌诱发性细胞内病原体，是致命疾病隐科病的致病剂，存在不朽的巨噬细胞。该协议在单个实验中详细说明了病原体和哺乳动物细胞的适当蛋白质制备技术，从而为液相色谱 （LC） -MS/MS 分析提交了适当的肽。LFQ 的高通量通用性允许广泛的蛋白质识别和量化动态范围，以及可转移到任何宿主病原体感染设置，保持极端敏感性。该方法进行了优化，以编目感染模仿条件下病原体的广泛、公正的蛋白质丰度配置文件。具体来说，这里演示的方法提供了关于 C.新福尔曼病 原体的基本信息，例如毒性所需的蛋白质生产，并识别出对微生物入侵作出反应的关键宿主蛋白。

Introduction

侵入性真菌感染的流行率正在大大增加，与不可接受的高死亡率有关，最常见的报告在有免疫缺陷倾向¹的个人。隐球菌是一种臭名昭著的机会性真菌病原体，能够在宿主巨噬细胞内细胞内细胞内存活。抗真菌干预不足导致真菌传播和危及生命的隐球菌脑膜炎和脑膜炎^2，3。全球免疫功能化地位的提高要求同时增加抗真菌剂的使用，其中许多真菌物种，包括C.新福曼，已经逐渐进化到^4，5，6的抗药性。因此，必须实施有力和有效的技术，以回答有关宿主防御反应和微生物发病机制的重要生物问题。

质谱学技术进步的新时代，包括强大的计算和生物信息管道的产生，为大规模分析宿主病原体研究^{提供了基础。}传统的发病机制驱动的蛋白质组分析通常从宿主或病原体的角度描述感染的观点，包括综合方法，如蛋白质相关性分析，亲和色谱结合蛋白质组学，和相互作用经济学^9。对宿主系统中危险病原体毒性的调查具有巨大的临床意义:然而，在单个实验中应用双重透视分析以前被认为是无法实现的。例如，病原体对感染的看法往往被高度丰富的宿主蛋白所淹没，导致检测低富真菌蛋白⁷的敏感性降低。此外，高样本复杂性邀请许多目标在单个实验系统中进行调查，并证明很难阐明特定病原体蛋白的行动机制。

自下而上的蛋白组学是一种流行的MS技术，它使可管理的样品制备，其中肽产生序列特异性酶消化，然后液体色谱分离，识别和量化MS^10，11。在这里，我们演示了一种基于数据的获取策略的方法，旨在实现基于感染的蛋白质组或"感染体"的公正覆盖。具体来说，无标签量化（LFQ）可以摆脱对化学或代谢标签的依赖，从而对多个蛋白质组的蛋白质水平变化进行可靠和准确的识别，从而减少样品处理和处理步骤^12、13。这种普遍应用在细胞内的某一时刻询问产生的蛋白质，而该细胞独立于任何预期的蛋白质生产:因此，可能会发现对感染至关重要的新见解。

此处描述的工作流程进行了优化，以探索 C.新福尔曼在与 宿主免疫细胞的感染模仿条件下的蛋白质水平变化（图1）。这种方法不是依靠细胞类型的分离和分离，而是将宿主和病原体蛋白质组分离在一起，并利用生物信息分离利用两个生物特定的数据库来区分特定物种的蛋白质生产。这种方法为无限数量的样品处理提供了优势，无需同位素标签研究或分数所需的额外成本高昂的制备步骤。此外，此工作流程支持可转移到各种真菌和细菌病原体的优化蛋白质提取方案，这些病原体能够瞄准和感染宿主免疫细胞。总体而言，该协议概述了完成高分辨率MS的公正蛋白质提取和样品处理的步骤，然后是数据和统计分析，能够提供大量对感染具有重要意义的真菌蛋白知识，并结合对宿主防御反应的全面分析。

Results

上述协议允许在单个实验中识别和量化来自真菌病原体C.新福尔曼和宿主巨噬细胞的蛋白质。在共同培养之后，细胞被收集和处理在一起，并根据每个物种特有的肽谱进行生物信息分离。这是定义感染期间宿主-病原体关系相互作用的有力方法。从实验中识别出的蛋白质数量取决于启动材料、样品准备、梯度长度、MS 仪器和生物信息工作流程。使用此处描述的协议，我们通常从实验中识别出大约 8，000 种蛋白质，其中含有 1，500种 C. neoformans蛋白质和 6，500 种宿主蛋白。在处理数据集后，我们生成一个主要组件分析 （PCA） 图，以观察推动我们分析的关键因素 （图 2A）。在这里，我们观察到数据之间最大的分离成分是受感染的样品与未受感染的样本，正如我们从实验设计中预测的那样（组件 1，79.8%），样本的第二个显著特征是生物变异性（组件 2，5.7%）。接下来，Pearson 相关性与欧几里德距离的分层聚类相结合，对样本进行分组，并能够量化复制品之间的变异性（图 2B）。在我们的分析中，我们观察到...

Discussion

协议中的关键步骤包括制备巨噬细胞和收集用于蛋白质加工的共同培养样本，尽量减少对细胞的干扰。重要的是要执行步骤，清洗，接种，并删除粘附的巨噬细胞轻轻地和仔细，以防止不必要的裂解细胞之前收集。建立正确的实验MOI也至关重要，因为接种过高的MOI会导致快速的巨噬细胞死亡和MS的收集和处理样本的困难。 相反，低MOI数量将导致噬菌体真菌细胞减少，生物系统中真菌蛋白的检测有限。为了克服这些限制，我们建议在细胞死亡检测（例如 LDH 量化）的支持下，用不同的 MOI 进行测试实验，以定义启动宿主响应但不会在收集前杀死宿主细胞的真菌细胞数量。在实验中，我们的目标是识别与感染相关的真菌蛋白，需要高MOI（100:1）才能在大量宿主蛋白中充分检测真菌蛋白。在进行整个实验之前，我们定期进行巨噬细胞毒性检测，以评估MOI对宿主细胞死亡的影响。用巨噬细胞孵育C.新福尔曼细胞的时间也至关重要，因为真菌细胞可能含有大型多糖胶囊，因此，巨噬细胞需要更多的时间进行吞没。我们选择使用3小时的共同培养孵化时间进行概述的实验，因为我们发现此时真菌蛋白质组覆盖良好，并提供宿主响应的"快照":然而，研究人员可能希望探索早期和以后的时间点，并观察时间如何影响真菌...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl，pH 值 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	维持在 4°C;C
60 x 15 mm 培养皿，Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6 孔细胞培养板	ThermoFisher Scientific	140675
乙腈，MS 级	Pierce	TS-51101
乙酸	Sigma Aldrich	1099510001
丙酮	Sigma Aldrich	34850-1L
铵碳酸氢盐 （ABC）	ThermoFisher Scientific	A643-500	制备 50 mM ABC 原液，在室温下可稳定保存长达一个月。
Bel-Art™HiFlow 真空吸液器采集系统	Fisher Scientific	13-717-300	非必需，血清移液器可用于去除培养基。
C18 树脂	3M Empore	3M2215
细胞刮刀	VWR	10062-906	非必需，可以使用其他方法释放巨噬细胞。
离心真空浓缩器	Eppendorf	07-748-15
完整过滤装置	VWR	10040-436
锥形猎鹰管 （15 mL）	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II 自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	不是必需的，血细胞计数器可用作替代品。
CytoTox 96 非放射性细胞毒性测定	Promega	G1780
二硫苏糖醇 （DTT）	ThermoFisher Scientific	R0861	制备 1 M DTT 的散装储备溶液，快速冷冻并储存在 -20 °C;C 直到使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX补充剂	ThermoFisher Scientific	10566016
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher Scientific	12483020	60°C孵育来热灭活;C 30 分钟。准备 50 ml 等分试样并快速冷冻。培养基制备前解冻
血细胞计数器	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	在散装储备溶液中制备 40 mM HEPES/8 M 尿素，快速冷冻，储存在 -20°;C 直到使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。
高效液相色谱系统	ThermoFisher Scientific	LC140	梯度长度基于样品复杂性，建议感染组样品的梯度为 120 分钟。
高分辨率质谱仪	ThermoFisher Scientific	726042
碘乙酰胺 （IAA）	Sigma Aldrich	I6125	制备 0.55 M 散装储备溶液，快速冷冻，在 -20°C 下储存;C 直到使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。
L-谷氨酰胺	ThermoFisher Scientific	25030081	可以分装并冷冻储存。在培养基制备之前解冻。
LoBind 微量离心管	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant 是一个公共平台，提供教程，例如 MaxQuant 暑期学校，概述了大型 MS 数据集的计算分析步骤
离心机	Eppendorf	13864457
青霉素 ： 链霉素 10k/10k	VWR	CA12001-692	可以分装并冷冻储存。在培养基制备之前解冻。
肽分离柱	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus 软件	http://maxquant.net/perseus/
磷酸盐缓冲盐水	VWR	CA12001-676	无需购买。也可以制备 PBS，但使用前必须进行无菌过滤。
Pierce BCA 蛋白检测	ThermoFisher Scientific	23225
移液器，一次性血清学 （10 mL）	Fisher Scientific	13-678-11E
移液器，一次性血清学 （25 mL） Basix	Fisher Scientific	14955235
探针超声器	ThermoFisher Scientific	100-132-894
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片	Roche	4693159001
烷基硫酸钠	ThermoFisher Scientific	28364	20% （w/v）
分光光度计 （Nanodrop）	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE 倾翻离心机	Sonation	STC-V2
热摇床	VWR	NO89232-908
三氟乙酸	ThermoFisher Scientific	85183
胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶混合物，MS 级	Pierce	A40007	保持在 -20 °C。
超声波浴	Bransonic	A89375-450	储存在冷藏室 （4C）
尿素	Sigma Aldrich	U1250-1KG	在散装储备溶液中制备 40 mM HEPES/8 M 尿素，快速冷冻，储存在 -20 °C;C 直到使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。
酵母提取物蛋白胨葡萄糖汤	BD Difco	BM20