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基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用

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DOI：

10.3791/61881

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2020年10月20日

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于质谱蛋白质组学的方法，用于在感染过程中分析宿主与病原体之间的相互作用。该方法通过非标记定量技术，在单次实验中同时检测宿主（例如巨噬细胞）和病原体（例如Cryptococcus neoformans）蛋白质丰度的变化。

摘要

基于质谱（MS）的定量蛋白质组学技术成就为分析生物体在不同条件下的全局蛋白质组开辟了诸多尚未探索的途径。将这一强大策略应用于微生物病原体与宿主之间的相互作用，可全面表征感染过程中的双方动态。本文所述工作流程描述了在永生化巨噬细胞存在下，对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）感染体进行无标记定量（LFQ）分析。新型隐球菌是一种真菌性兼性胞内病原体，可引发致命的隐球菌病。该实验方案详细说明了在同一实验中对病原体和哺乳动物细胞进行适当蛋白质制备的技术，从而为液相色谱（LC）-MS/MS分析提供合适的肽段样本。LFQ方法具有高通量和通用性，能够实现广泛动态范围的蛋白质鉴定与定量，并可推广至任何宿主-病原体感染体系，同时保持极高的灵敏度。该方法经过优化，可用于在模拟感染条件下系统性地记录病原体无偏倚的蛋白质丰度谱。具体而言，本文所展示的方法为研究C. neoformans的致病机制提供了关键信息，例如与毒力相关的蛋白质表达，并鉴定出宿主在应对微生物入侵时发生响应的关键蛋白质。

引言

侵袭性真菌感染的发病率正在急剧上升，且与极高的死亡率相关，这种情况最常出现在具有免疫缺陷倾向的个体中1。Cryptococcus neoformans 是一种臭名昭著的机会性真菌病原体，能够在宿主巨噬细胞内生存。抗真菌治疗不足会导致真菌播散，并引发危及生命的隐球菌性脑膜炎和脑膜脑炎2,3。全球免疫功能低下人群的增加，导致抗真菌药物的使用需求同步上升，而包括 C. neoformans 在内的许多真菌物种对此类药物的耐药性也日益增强4,5,6。因此，迫切需要采用强大且高效的技術手段，以回答有关宿主防御反应和微生物致病机制的关键生物学问题。

质谱技术（MS）的新时代技术进步，包括强大的计算和生物信息学分析流程的建立，为大规模宿主-病原体研究的整合分析提供了基础7,8。传统的以致病过程为导向的蛋白质组学分析通常仅从宿主或病原体单一方面来描述感染过程，所采用的方法包括蛋白质相关性分析、亲和层析联合蛋白质组学以及相互作用组学等全面的技术手段9。在宿主系统中研究危险病原体的毒力具有重要的临床意义；然而，过去在单次实验中同时实现双重视角分析被认为是难以实现的。例如，病原体在感染过程中的蛋白质信号常常被大量存在的宿主蛋白所掩盖，导致低丰度真菌蛋白的检测灵敏度降低7。此外，样本的高度复杂性使得单个实验体系中存在大量待研究靶点，因而难以阐明特定病原体蛋白的作用机制。

自下而上的蛋白质组学是一种常用的质谱技术，可实现便捷的样品制备，其中通过序列特异性的酶解反应生成肽段，随后经液相色谱分离，并利用质谱进行鉴定和定量10,11。本文介绍一种基于数据依赖性采集策略的方法，旨在实现对基于感染的蛋白质组（即“感染体”）的无偏覆盖。具体而言，非标记定量（LFQ）摆脱了对化学或代谢标记物的依赖，能够在多个蛋白质组之间稳健且准确地识别蛋白质水平的变化，同时减少样品处理和操作步骤12,13。该通用方法可在特定时间点检测细胞内产生的全部蛋白质，而无需预设任何蛋白质表达情况，从而可能发现对感染过程至关重要的新机制。

本文所述的工作流程经过优化，旨在研究在模拟感染宿主免疫细胞条件下 C. neoformans 的蛋白质水平变化（图1）。该方法无需依赖细胞类型的分离与纯化，而是同时提取宿主和病原体的蛋白质组，并利用两种生物体特异性的数据库通过生物信息学手段区分物种特异性的蛋白质表达。此方法的优势在于可对任意数量的样本进行处理，而无需同位素标记研究或组分分离所必需的额外且昂贵的制备步骤。此外，该工作流程支持经过优化的蛋白质提取方案，可推广应用于多种能够靶向并感染宿主免疫细胞的真菌和细菌病原体。总体而言，本实验方案详细阐述了完成无偏倚蛋白质提取及样本处理以进行高分辨率质谱分析的步骤，继而进行数据与统计分析，从而全面揭示在感染过程中具有重要意义的真菌蛋白质，并同时系统性地描绘宿主防御反应的特征。

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方案

采用源自BALB/c小鼠的永生化巨噬细胞系进行以下实验方案，该方案已获圭尔夫大学动物使用方案4193号批准。值得注意的是，其他品系小鼠或其他来源的永生化细胞也可应用于本方案，但需经过充分测试以优化各项具体参数。以下方案将从一管冷冻保存的巨噬细胞开始，逐步介绍操作流程。细胞保存于含10% FBS（胎牛血清）、1% L-谷氨酰胺、5% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）混合液的DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）以及20% DMSO（二甲基亚砜）中。

1. 培养 C. neoformans

  1. 使用甘油保存菌种，将野生型 C. neoformans 菌株（H99）划线接种于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上，以分离单菌落。
  2. 在37 °C静置培养箱中培养16小时。
  3. 挑取一个野生型 C. neoformans 菌株的单菌落，接种于5 mL YPD液体培养基中，使用松盖的10 mL试管进行培养。设置四个重复。
  4. 在37 °C摇床培养箱中以200 rpm振荡培养16小时。
  5. 次日，将每份过夜培养物按1:100比例转接至3 mL YPD液体培养基中进行二次培养。
  6. 测定真菌培养物的光密度（OD600nm）值，以确定其是否达到对数中期。根据分光光度计的不同，野生型 C. neoformans 菌株通常在YPD培养基中培养6至8小时后进入对数中期，此时OD600nm值一般在1.0至1.5之间。
  7. 当细胞达到对数中期时，取10 µL真菌细胞悬液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释100倍，使用血细胞计数板计数细胞数量。

2. 巨噬细胞的培养

注意：细胞培养操作前，务必确保工作环境已灭菌。

  1. 细胞培养基的制备
    1. 添加抗生素的培养基：向DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中加入10% FBS（胎牛血清）、1% L-谷氨酰胺和5%青霉素-链霉素（Pen/Strep）混合液。使用0.2 µm完整滤器系统过滤培养基，并于4 °C保存。
    2. 无抗生素培养基：操作步骤相同，但省略Pen/Strep混合液。
  2. 接种巨噬细胞
    注意：进行细胞培养操作前，应将含抗生素的培养基（2.1.1）预热至37°C。
    1. 将巨噬细胞冻存管迅速置于37 °C水浴中解冻。
    2. 用1 mL含抗生素的培养基重悬细胞，以洗去冻存液。
      注意：需格外小心，避免因剧烈吹打导致细胞裂解。
    3. 将重悬的细胞转移至无菌的15 mL离心管中。
    4. 在室温下以400 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。
    5. 用移液管或真空抽吸装置小心去除上清液。
    6. 用10 mL含抗生素的培养基轻柔重悬细胞沉淀。
    7. 将重悬的细胞轻柔吹打后加入60 × 15 mm细胞培养处理皿中。
    8. 将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
  3. 巨噬细胞的初次传代
    注意：冻存细胞通常每管含有约500万至1000万个细胞（约1 mL）。次日，成功存活并完成接种的巨噬细胞将贴附于培养皿底部，可进行传代操作。
    1. 在进行细胞培养操作前，将含抗生素的培养基（步骤2.1.1）预热至37 °C。确保操作环境已灭菌。使用光学显微镜观察细胞，确认细胞已贴壁且状态良好。
    2. 用移液管或真空抽吸装置从培养皿中移除培养基。
    3. 向60 × 15 mm培养皿中轻柔加入5–7 mL无菌室温PBS（磷酸盐缓冲液）。
    4. 轻柔倾斜培养皿，清洗贴壁细胞。
    5. 用移液管或真空抽吸装置移除PBS。
    6. 向细胞中加入1 mL冷PBS（4 °C保存），倾斜培养皿使PBS均匀覆盖所有细胞，室温静置1分钟。
    7. 通过轻敲培养皿、用冷PBS吹打细胞或使用细胞刮刀，使细胞脱离皿底。
    8. 向培养皿中加入9 mL含抗生素的培养基。
    9. 在新的60 × 15 mm培养皿中加入9 mL新鲜含抗生素的培养基，并从原培养皿中加入1 mL重悬的细胞。
    10. 当所需传代的培养皿均已完成接种后，可弃去原培养皿中剩余的重悬细胞。
    11. 将新培养皿置于上述条件（步骤2.2.8）下培养。
    12. 当细胞达到70–80%汇合度时进行后续传代（根据细胞系和培养基不同，约每2天一次）。
      注意：感染实验前，巨噬细胞至少应传代五次。根据细胞系不同，感染实验应在第25至30代之间完成。超过25至30代后，细胞应冻存或弃用。可根据实验计划选择第2.4或2.5节的操作流程。后续部分将采用第2.4节的方法。
  4. 感染前接种巨噬细胞
    1. 执行传代操作步骤2.3.1至2.3.7。
    2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度（细胞数/mL）。
    3. 将0.3 × 106个巨噬细胞接种至6孔细胞培养板的单个孔中。
    4. 用含抗生素的培养基（步骤2.1.1）调整每孔总体积至1 mL。
    5. 重复步骤2.4.3和2.4.4，直至完成8个孔的接种（两个独立的6孔板中各接种4孔）。
    6. 可选：向剩余的两个孔中各加入1 mL室温PBS，以维持培养过程中的湿度。
    7. 将细胞置于步骤2.2.8所述的培养条件下培养2天，再进行感染操作。
  5. 感染当天接种巨噬细胞
    1. 执行传代操作步骤2.3.1至2.3.7。
    2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度（细胞数/mL）。
    3. 将1.2 × 106个巨噬细胞接种至6孔细胞培养板的单个孔中。
    4. 用含抗生素的培养基（2.1.1）调整每孔总体积至1 mL。
    5. 重复步骤2.4.3和2.4.4，直至完成8个孔的接种（两个独立的6孔板中各接种4孔）。
    6. 可选：向剩余的两个孔中各加入1 mL室温PBS，以维持培养过程中的湿度。
    7. 将细胞置于步骤2.2.8所述条件下培养3小时，使细胞充分贴壁。

3. 巨噬细胞的感染 C. neoformans

注意：当细胞融合度达到70-80%时，每孔约有1.2 × 106个巨噬细胞。为达到100:1的感染复数（MOI），每个反应需加入1.2 × 108个真菌细胞。实验需设置四个生物学重复。

免责声明：在我们的研究团队中，感染复数（MOI）为100:1已获得理想结果，此数值仅供读者参考。对于感染性更强的C. neoformans菌株或抗性较弱的巨噬细胞系，可能需要采用更低的MOI。可通过感染验证（第3.5节）来确定特定C. neoformans与巨噬细胞组合的最佳MOI。

  1. 真菌细胞的制备
    1. 按照步骤1培养C. neoformans至对数中期。
    2. 在1,500 × g条件下离心10分钟收集细胞，用无菌室温PBS轻柔洗涤沉淀，并重复洗涤共三次。
    3. 将细胞重悬于无抗生素的细胞培养基（步骤2.1.2）中，调整浓度至1.2 × 108 个细胞/mL。
  2. 巨噬细胞的制备
    1. 观察6孔板中每孔细胞，确保细胞融合度达到70–80%。或者，也可通过计数使每孔含有约1.2 × 106个巨噬细胞。
    2. 执行步骤2.3.1至2.3.4。
  3. C. neoformans与巨噬细胞的共培养
    1. 将1 mL重悬的C. neoformans细胞（步骤3.1.3）加入含有已制备巨噬细胞的4个孔中。
      注：实验开始前需预先计算所需板数。向空孔中加入1 mL无抗生素培养基（步骤2.1.2）。
    2. 将细胞置于步骤2.2.8所列条件下孵育3小时。
    3. 使用移液管或真空抽吸装置移除孔板中的细胞培养基。
    4. 轻柔加入1 mL无菌室温PBS。
    5. 轻轻倾斜孔板，以洗涤未贴附或未被吞噬的胞外C. neoformans细胞。
    6. 使用移液管或真空抽吸装置移除PBS，共洗涤三次。重复步骤3.3.4至3.3.5两次。
  4. 未感染的巨噬细胞
    1. 同样，使用6孔板中的4个孔作为仅含巨噬细胞的对照样本。向这些孔中加入1 mL无抗生素培养基（步骤2.1.2）。
    2. 重复步骤3.3.2至3.3.6。
  5. 感染验证
    注：可通过细胞毒性检测评估感染效率。以下方案将重点介绍使用细胞毒性检测试剂检测乳酸脱氢酶（LDH）释放的方法，也可使用其他细胞毒性检测试剂。
    1. C. neoformans感染巨噬细胞的制备
      1. 重复步骤1、2和3（至步骤3.5）。如需要，LDH检测可设三个重复。
      2. 完成步骤3.3.6后，向6孔板中每孔加入1 mL无抗生素培养基（2.1.2）。
      3. 重复步骤2.4.3和2.4.4，直至填满3个孔加3n个孔（其中n为检测的时间点数量）。
      4. 将细胞置于步骤2.2.8所列条件下孵育。
      5. 在选定的时间点（例如1、3、6、12和24小时），根据试剂盒说明书收集上清液以检测LDH释放量。
      6. 在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞，以测定最大细胞毒性值。
      7. 按以下公式计算细胞毒性：
        细胞毒性公式：%细胞毒性 = 实验组LDH释放量 / 最大LDH释放量。

4. 样本采集

  1. 共培养与未感染巨噬细胞的收集
    1. 向细胞（来自步骤 3.3.6 和 3.4.2）中加入 1 mL 冷 PBS，室温静置 1 分钟。
    2. 通过轻轻敲击培养板或用冷 PBS 轻柔吹打细胞，使细胞从培养板上脱落。
      注意：应避免使用细胞刮刀，因其可能导致细胞裂解。
    3. 将重悬的细胞转移至 15 mL 离心管中。
    4. 室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    5. 立即进行后续细胞处理（详见步骤 5），或在液氮中速冻后于 -80 °C 保存以备后续处理。

5. 细胞蛋白质组

注意：充分裂解需根据所分析的细胞类型进行优化（即循环次数和振幅取决于细胞沉淀量以及探头式超声破碎仪型号的功率百分比）。

  1. 感染巨噬细胞裂解
    1. 将已收集的细胞沉淀（步骤 4.1.5）重悬于 300 µL 含新鲜溶解的蛋白酶抑制剂混合片的 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）中。
      注意：实验开始前，将一片蛋白酶抑制剂混合片加入 10 mL 冰冷的 100 mM Tris-HCl（pH 8.5）中溶解。
    2. 将细胞置于冰浴中进行探头超声处理，共 15 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭，以裂解细胞。
    3. 将样品短暂离心 30 秒，400 × g，注意不要形成紧密沉淀，仅去除管壁上的液体，随后将样品转移至 2 mL 低吸附微量离心管中。
    4. 加入 1/10 体积的 20% SDS，使终浓度为 2%。
    5. 加入 1/100 体积的 1 M 二硫苏糖醇（DTT），使终浓度为 10 mM，并通过移液充分混匀，随后在 95 °C 热循环仪中以 800 rpm 振荡孵育 10 分钟。接着冷却至室温（可在冰上冷却）。
    6. 加入 1/10 体积的 0.55 M 碘乙酰胺（IAA），使终浓度为 55 mM，并通过移液充分混匀。室温避光孵育 20 分钟。
    7. 加入 100% 丙酮，使终浓度为 80% 丙酮，样品于 -20°C 过夜保存，以沉淀蛋白质。
  2. 蛋白质消化
    1. 次日，将样品在 10,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，收集沉淀；弃去上清液，用 500 µL 80% 丙酮洗涤沉淀，共洗涤两次。洗涤后在室温下空气干燥沉淀。
    2. 将蛋白质沉淀重溶于 100 µL 8 M 尿素/40 mM HEPES 溶液中，为确保完全溶解，可在冰水浴中涡旋或超声处理 15 个循环，每个循环 30 秒开启、30 秒关闭。
      注意：尿素/HEPES 体积的调整应根据沉淀细胞量确定；若体积有变动，所有后续试剂体积均需相应调整。
    3. 根据制造商说明书使用蛋白定量试剂盒（如 BCA 蛋白定量法）测定蛋白浓度，并以 8 M 尿素/40 mM HEPES 作为空白对照进行背景校正。
    4. 加入 300 µL 50 mM 碳酸氢铵，使尿素终浓度为 2 M。
      注意：可在此步骤统一蛋白浓度以利于后续分析；建议消化 100 µg 蛋白质，未消化的剩余样品可通过液氮速冻后短期储存于 -20 °C 或长期储存于 -80 °C。
    5. 在冰上按 2:50（体积/重量）的比例加入胰蛋白酶/赖氨酰内切酶（trypsin/Lys-C）混合酶液，轻轻敲击管壁混匀，室温孵育过夜。
    6. 孵育结束后，加入 1/10 体积的终止液（20% 乙腈，6% 三氟乙酸）终止消化反应，并在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟。
    7. 收集上清液（含已消化的肽段），弃去任何沉淀杂质或残渣。
  3. 肽段脱盐
    1. 向 C18 Stop And Go Extraction（STAGE）小柱（200 µL 移液枪头内含三层 C18 树脂）中加入 100 µL 100% 乙腈以活化，1,000 × g 离心 2 分钟。
    2. 加入 50 µL 缓冲液 B（80%（v/v）乙腈，0.5%（v/v）乙酸），平衡 C18 STAGE 小柱，1,000 × g 离心 2 分钟。
    3. 加入 200 µL 缓冲液 A（2%（v/v）乙腈，0.1%（v/v）三氟乙酸，0.5%（v/v）乙酸），进一步平衡 C18 STAGE 小柱，1,000 × g 离心 3–5 分钟。
    4. 将约 50 µg 已消化的样品加至 C18 STAGE 小柱，1,000 × g 离心 3–5 分钟，或直至样品完全通过小柱。剩余已消化样品用液氮速冻，储存于 -20°C，待后续使用。
    5. 用 200 µL 缓冲液 A 洗涤 C18 STAGE 小柱，1,000 × g 离心 3–5 分钟。
    6. 向 C18 STAGE 小柱中加入 50 µL 缓冲液 B，500 × g 离心 2 分钟，将洗脱的肽段收集至 0.2 mL PCR 管中。
    7. 将洗脱的肽段在真空离心浓缩仪中干燥 30–40 分钟（最高速度）。完全干燥的样品可于室温或 -20 °C 保存，直至后续处理。
      注意：干燥且脱盐后的肽段适用于质谱分析平台的样品提交，可常温运输。

6. 质谱分析

  1. 用缓冲液A重悬肽段，测定注入约1.5至3 µg肽段至质谱柱所需的浓度。样品用量取决于仪器型号。
  2. 使用预先确定的乙腈梯度（在0.5%乙酸中，约5%-60%），在设定的时间内（例如2小时）通过高效液相色谱分离肽段，随后进行电喷雾电离进入质谱仪。
  3. 采用高分辨率质谱仪以数据依赖性采集模式（m/z 300 至 1650）获取质谱扫描数据。
    注意：梯度的百分比和时长由实验设计和使用者决定。精确的质谱仪参数设置取决于仪器类型、实验条件及用户偏好。

7. 数据分析

注意：质谱数据可通过多种生物信息学流程进行处理。在本方案中，我们描述了使用公开可用的 MaxQuant 和 Perseus 平台进行数据处理的方法，但建议各用户根据分析需求、个人偏好和使用习惯，评估选择适合的生物信息学工具。

  1. 使用 MaxQuant 软件加载未经处理的数据文件（直接来自质谱仪）。在修改后的 MaxQuant 搜索参数下鉴定蛋白质；采用目标-诱饵方法进行蛋白质鉴定，要求至少两个唯一肽段，错误发现率设为 1%；使用 Andromeda 搜索引擎结合来自 UniProt 数据库的生物体 FASTA 文件（例如 Cryptococcus neoformans H99、Mus musculus）实现肽段的鉴定与定量，并启用运行间匹配的非标记定量（label-free quantification）。有关详细教程，请参考公开的 MaxQuant 在线工具（见材料表）。
  2. 将 MaxQuant 输出文件（“proteingroups.txt”）上传至 Perseus 软件。
  3. 使用“基于分类列筛选行”功能，过滤掉可能的假阳性、污染物以及仅由修饰位点肽段组成的行。
  4. 将数据值转换为 log2 尺度。
  5. 通过为各行提供分类注释，创建数据集分组。
  6. 根据有效值对数据集进行过滤，以确定蛋白质检测的阈值。
    注：为实现严格且稳健的分析，建议选择>50% 的鉴定率。例如，若处理了四个重复样本，则至少选择三个有效值。
  7. 如需要，可通过正态分布填补缺失值。
    注：填补值基于正态分布优化，为“NaN”占位符随机分配一个 LFQ 强度值，以模拟典型的丰度测量值。该填补方法为后续需要可量化数据的统计分析提供了基础。
  8. 为蛋白质行添加注释（如蛋白质名称、基因本体术语）。
    注：至此生成的 Perseus 工作流程已成为一个稳健的框架，可用于进一步的生物信息学处理、统计分析和数据可视化；有关详细教程，请参考公开的 Perseus 在线工具（见材料表）。

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结果

上述方案能够在单次实验中同时鉴定并定量来自真菌病原体C. neoformans和宿主巨噬细胞的蛋白质。共培养后，细胞被一同收集并处理，随后基于各物种特有的肽段谱型通过生物信息学方法进行区分。该方法在定义感染过程中宿主与病原体之间相互作用方面具有强大优势。实验中鉴定出的蛋白质数量取决于起始材料、样品制备方法、色谱梯度长度、质谱仪器以及生物信息学分析流程。采用本方案时，我们通常可鉴定出约8,000种蛋白质，其中包括约1,500种来自C. neoformans的蛋白质和约6,500种宿主蛋白质。在完成数据集处理后，我们生成主成分分析（PCA）图以观察驱动分析结果的关键因素（图2A）。在此图中，数据分离的最大组分表现为感染样本与非感染样本之间的差异，这与实验设计预期一致（第一主成分，79.8%），第二组分则反映了样本间的生物学变异（第二主成分，5.7%）。接下来，通过皮尔逊相关性分析结合欧氏距离的层次聚类对样本进行分组，并评估重复样本之间的变异程度（图2B）。在我们的分析中，感染样本与非感染...

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讨论

该实验方案的关键步骤包括巨噬细胞的制备，以及在尽可能减少细胞损伤的情况下收集共培养样品用于蛋白质处理。在洗涤、接种以及去除贴壁巨噬细胞的过程中，必须轻柔谨慎地操作，以防止细胞在收集前发生不必要的裂解。确定实验所需的正确感染复数（MOI）也至关重要，因为使用过高的MOI接种可能导致巨噬细胞迅速死亡，从而难以收集和处理质谱（MS）样品；相反，MOI过低则会导致被吞噬的真菌细胞数量减少，从而限制在生物系统中对真菌蛋白的检测。为克服这些限制，我们建议通过预实验测试不同MOI条件，并结合细胞死亡检测方法（例如LDH定量）来确定能够引发宿主反应但又不会在样品收集前导致宿主细胞死亡的真菌细胞数量。在本研究中，我们的目标是鉴定与感染相关的真菌蛋白，因此需要采用较高的MOI（100:1），以便在大量宿主蛋白背景中充分检测到真菌蛋白。我们通常在开展完整实验前常规进行巨噬细胞毒性检测，以评估MOI对宿主细胞死亡的影响。此外，C. neoformans细胞与巨噬细胞共孵育的时间点也十分关键，因为该真菌可能具有较大的多糖荚膜，巨噬细胞需要更长时间才能完成吞噬。在本实验中，我们选择3小时的共培养孵育时间，因为在此时间点我们获得了较全面的真菌蛋白质...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Bioinformatics Solutions Inc. 的 Jonathan Krieger 博士在代表性实验中操作质谱仪，同时感谢 Geddes-McAlister 课题组成员在实验设置和稿件反馈方面提供的帮助。作者部分经费来自班廷研究基金会——Jarislowsky 博士后发现奖（Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award）、新前沿研究基金——探索项目（New Frontiers Research Fund – Exploration, NFRFE-2019-00425）以及加拿大创新基金会（Canadian Foundation for Innovation, JELF 38798），上述资助授予 J.G.M.；B.B. 获得了加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金——硕士（NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters）和安大略省研究生奖学金（Ontario Graduate Scholarship）；A.S. 获得了伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mM Tris-HCl，pH 8.5Fisher ScientificBP152-14°C 保存
60 x 15 mm 培养皿，Nunclon DeltaThermoFisher Scientific174888
6 孔细胞培养板ThermoFisher Scientific140675
乙腈，质谱级PierceTS-51101
乙酸Sigma Aldrich1099510001
丙酮Sigma Aldrich34850-1L
碳酸氢铵（ABC）ThermoFisher ScientificA643-500配制 50 mM ABC 储存液，室温下可稳定保存一个月。
Bel-Art™ HiFlow 真空抽滤收集系统Fisher Scientific13-717-300非必需，可用移液管移除培养基。
C18 树脂3M Empore3M2215
细胞刮刀VWR10062-906非必需，可采用其他方法释放巨噬细胞。
离心式真空浓缩仪Eppendorf07-748-15
完整过滤装置VWR10040-436
锥形离心管（15 mL）Fisher Scientific05-539-12
Countess II 自动细胞计数仪ThermoFisher ScientificAMQAX1000非必需，可使用血细胞计数板替代。
CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒PromegaG1780
二硫苏糖醇（DTT）ThermoFisher ScientificR0861配制 1 M DTT 大量储存液，速冻后于 -20 °C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂ThermoFisher Scientific10566016
胎牛血清（FBS）ThermoFisher Scientific1248302060°C 孵育 30 分钟进行热灭活。分装为 50 mL 份量，速冻保存。使用前解冻。
血细胞计数板VWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375配制 40 mM HEPES/8 M 尿素大量储存液，速冻后于 -20°C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
高效液相色谱系统ThermoFisher ScientificLC140梯度长度根据样品复杂性确定，建议感染体样品使用 120 分钟梯度。
高分辨率质谱仪ThermoFisher Scientific726042
碘乙酰胺（IAA）Sigma AldrichI6125配制 0.55 M 大量储存液，速冻后于 -20°C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
L-谷氨酰胺ThermoFisher Scientific25030081可分装后冷冻保存。使用前解冻。
LoBind 微量离心管Eppendorf13-698-794
MaxQuanthttps://maxquant.org/MaxQuant 是一个公共平台，提供教程（如 MaxQuant 暑期学校），介绍大规模质谱数据集的计算分析步骤。
微量离心机Eppendorf13864457
青霉素:链霉素 10k/10kVWRCA12001-692可分装后冷冻保存。使用前解冻。
肽段分离柱ThermoFisher ScientificES803
Perseus 软件http://maxquant.net/perseus/
磷酸盐缓冲液VWRCA12001-676无需购买。也可自行配制，但使用前必须进行无菌过滤。
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific 23225
移液管，一次性血清移液管（10 mL）Fisher Scientific13-678-11E
移液管，一次性血清移液管（25 mL）BasixFisher Scientific14955235
探针式超声破碎仪ThermoFisher Scientific100-132-894
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693159001
十二烷基硫酸钠ThermoFisher Scientific2836420%（w/v）
分光光度计（Nanodrop）ThermoFisher ScientificND-2000
STAGE 柱离心机SonationSTC-V2
温控摇床VWRNO89232-908
三氟乙酸ThermoFisher Scientific85183
胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶混合物，质谱级PierceA40007-20 °C 保存。
超声波清洗机BransonicA89375-450存放于冷藏室（4°C）
尿素Sigma AldrichU1250-1KG配制 40 mM HEPES/8 M 尿素大量储存液，速冻后于 -20 °C 保存备用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基BD DifcoBM20

参考文献

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Benjamini Hochberg

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