用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

摘要

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。

摘要

复杂的疾病模型需要前沿工具，以提供具有生理和病理相关性的可操作见解，并揭示原本无法观察到的生物学过程。能够紧密模拟体内环境的先进细胞检测技术正成为可视化和量化影响癌症进展的肿瘤-宿主双向相互作用的新方法。本文中，我们描述了两种多功能实验方案，可在微流控装置中重建高度可控的二维（2D）和三维（3D）共培养体系，以模拟在自然状态及治疗诱导的免疫监视条件下肿瘤微环境（TME）的复杂性。在第一部分中，我们提供了一种实验设置，通过明场延时显微镜监测贴壁肿瘤细胞与悬浮免疫细胞群体之间的相互作用。作为应用示例，我们分析了抗癌治疗（如所谓的免疫原性肿瘤细胞死亡诱导剂）对免疫细胞募集和活化的影响。在第二部分中，构建了具有竞争性布局的三维肿瘤-免疫微环境，并通过荧光静态成像监测长达72小时的差异性免疫细胞浸润，以评估联合治疗策略的效果。在这两种实验体系中，均展示了图像处理步骤，用于提取多种免疫细胞参数（例如免疫细胞迁移与相互作用、对治疗药物的响应等）。这些简单而强大的方法可进一步优化，以模拟包含肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞亚群的异质性与可塑性，以及它们之间作为癌症演化驱动力的相互作用所构成的TME复杂性。这些快速发展的技术与活细胞高内涵成像的兼容性，将产生大量信息丰富的数据集，同时也带来新的挑战。事实上，“共培养/显微成像/高级数据分析”三者结合，为精确的问题参数化指明了方向，有助于制定个性化的治疗方案。我们预期，未来将芯片上的肿瘤-免疫系统与人工智能相结合，用于高通量数据处理，将协同推动其作为精准医学和个体化肿瘤学中预测性与临床前工具的能力迈上新台阶。

引言

不同医学分支发展为实验性学科，依赖于在受控条件下操控细胞群体和器官功能的能力¹。这种能力的基础在于是否存在可测量的模型，以重现人体内发生的生理过程。

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代²，癌症生物学需要借助新兴的体外和计算模型，在恰当的时空背景下研究肿瘤与免疫系统的相互作用界面^2,3。

肿瘤微环境⁴（TME）是一种复杂的组织，其中肿瘤细胞持续与其它细胞成分（免疫细胞、基质细胞和内皮细胞）以及非细胞成分（细胞外基质，ECM）相互作用并动态共进化。这一复杂环境的动态特性决定了免疫细胞是作为恶性细胞的“朋友”还是“敌人”，从而显著影响疾病进展及对治疗的反应。目前，肿瘤免疫学家、生物信息学家和系统生物学专家正共同努力，以阐明肿瘤异质性^5,6在空间（即不同肿瘤区域）和时间（即肿瘤进展的不同阶段）上的临床意义^5,6，并在单细胞水平上表征肿瘤细胞....

方案

1. 用于贴壁细胞与悬浮细胞二维共培养的芯片设计

注意：二维共培养布局（图1A-C）包含三个腔室（高100 µm），通过两组微通道阵列（500 × 12 × 10 µm³，L×W×H）相互连接。中间腔室形成两个封闭的盲端区室，在加样步骤2.5期间可阻止悬浮的免疫细胞溢出至肿瘤区域。此类装置适用于对单个细胞（贴壁或悬浮）的运动性以及细胞间相互作用进行实时二维测量^{16,27,28,30,31}。典型的细胞迁移研究（持续数小时至数天）结合活细胞显微镜与图像处理算法⁴⁵，将获取的图像序列转化为数值特征²⁵。根据迁移模式，可估算多种生物物理指标，例如细胞的位移与速度，以及免疫细胞与靶细胞相互作用的持续时间

结果

肿瘤免疫浸润是宿主抗肿瘤反应的一个参数。肿瘤中浸润性白细胞的组成、密度、位置和功能状态具有异质性，这些白细胞与癌细胞之间的相互作用可能蕴含可用于预测疾病进程和治疗反应的临床相关信息。在此背景下，微流控技术可作为互补且具有优势的体外工具，用于探索肿瘤的免疫微环境，以及监测对抗癌治疗的反应。将微流控检测、活细胞成像与追踪软件相结合，可能建立可靠的定量方法，以量化免疫细胞在不同环境下如何调整其迁移模式。在本章节中，我们报告了在通过标准软光刻工艺制备的定制微流控装置中，建立免疫细胞与靶向癌细胞的多功能二维（2D）或三维（3D）共培养体系的操作步骤。在第1节中，使用微流控装置使贴壁细胞（MDA-MB-231癌细胞）与非贴壁细胞（外周血单个核细胞，PBMCs）之间实现化学和物理接触。某些化疗药物（如蒽环类药物等）可诱导恶性细胞发生“免疫原性”凋亡，从而增强其在免疫活性宿主中的可识别性。癌症免疫原性细胞死亡（ICD）的特征是濒死细胞释放膜结合型和可溶性信号分子，这些分子作为警报素激活免疫细胞。为了对ICD反应进行定量验证，我们利用微流控平台收集的数据，其中白细胞可通过特制的微通道桥向其靶细胞移动。在将来自健康供体的PBMCs（WT，野生型）与经或未经.......

讨论

所述方法旨在以可调节的复杂程度，建立一种通用方法，以重现肿瘤免疫学领域的两个重要方面，从而受益于采用更具生理相关性的体外模型。第一个方面涉及肿瘤细胞群体本身，研究单个细胞的特性有助于更准确地描述其异质性以及相关的生物学和临床意义，包括对治疗的耐药性、转移倾向、干细胞特性及分化程度。另一方面则是肿瘤微环境（TME），包括非癌性组分（免疫细胞和基质细胞、血管）以及化学/物理环境（细胞外基质成分、趋化因子及其他释放的可溶性因子），这些因素可深刻影响疾病特征及个体对治疗——尤其是免疫治疗——的反应⁶³。值得注意的是，将上述方法拓展至其他研究领域时，需充分理解新模型在开发与应用过程中所带来的一系列局限性与挑战。

引用工程建模中的一条准则（“对问题建模，而非对系统建模”），必须优化确定在芯片模型中所需的最少（细胞、物理和化学）组分与条件，以确保模型在整个实验过程中具有生物学相关性和稳定性。因此，每种细胞类型、微环境和实验设置的组合都必须经过仔细选择、评估，并在单次实验以及不同实验批次之间持续监测。这些检查包括如实验方案部分所述，严格控制微流控装置.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养材料
50 mL 离心管	Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯	CLS430828	离心管
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma；St. Louis，MO	A3656	DNA去甲基化剂
6孔板	Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯	CLS3506	培养皿
75 cm² 细胞培养处理过的培养瓶	康宁，纽约州，纽约	430641U	培养瓶
A365M	美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，弗吉尼亚州马纳萨斯	CVCL_B222	人黑色素瘤细胞系
盐酸多柔比星	Millipore-Sigma；St. Louis，MO	D1515	蒽环类抗生素
Dulbecco改良Eagle培养基 DMEM	EuroClone Spa，意大利米兰	ECM0728L	SK-MEL-28 细胞培养基  细胞
不含钙不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液	EuroClone Spa，意大利米兰	ECB4004L	生理盐水缓冲液
胎牛血清	EuroClone Spa，意大利米兰	ECS0180L	细胞培养辅助设备
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	从人血中分离单个核细胞
血细胞计数板	Neubauer		细胞计数器
肝素化小瓶	赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆		静脉血采集管
干扰素α-2b	Millipore-Sigma；St. Louis，MO	SRP4595	重组人细胞因子
L-谷氨酰胺 100X	EuroClone Spa，意大利米兰	ECB3000D	细胞培养辅助设备
液氮
Lympholyte 细胞分离培养基	Cedarlane Labs，Burlington，加拿大		通过密度梯度离心法分离淋巴细胞
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS，挪威奥斯陆
Matrigel	康宁，纽约州，纽约	354230	生长因子减少型基底膜基质
MDA-MB-231	美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯	HTB-26	人乳腺癌细胞系
青霉素/链霉素 100X	EuroClone Spa，意大利米兰	ECB3001D	细胞培养辅助设备
移液器辅助器	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	液体处理
PKH26 红色荧光细胞连接剂	Millipore-Sigma；St. Louis，MO	PKH26GL	红色荧光细胞染料
PKH67 绿色荧光细胞连接剂	Millipore-Sigma；St. Louis，MO	PKH67GL	绿色荧光细胞染料
RPMI-1640	EuroClone Spa，意大利米兰	ECM2001L	MDA-MB-231 细胞培养基
血清移液管（2 mL，5 mL，10 mL，25 mL，50 mL）	Corning- Millipore-Sigma；St. Louis，MO	CLS4486；CLS4487；CLS4488；CLS4489；CLS4490	液体处理
无菌吸头（1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa，意大利米兰	ECTD00010；ECTD00020；ECTD00200；ECTD01005	移液器使用技巧
计时器
台盼蓝溶液	赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆	15250061	用于评估细胞活力的细胞染色
胰蛋白酶	EuroClone Spa，意大利米兰	ECM0920D	贴壁细胞解离试剂
细胞培养设备
EVOS-FL 荧光显微镜	赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆		活细胞荧光显微镜
人源化细胞培养孵育箱	赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆	311 型直接加热 CO₂ 培养箱；TC 230	细胞培养的孵育 37 °C，5% CO₂2
朱莉显微镜	Nanoentek
实验室冰箱（4 °C)	FDM
实验室安全柜（II级）	Steril VBH 72 MP		层流罩
光学显微镜	Zeiss
可冷藏离心机	Beckman Coulter
恒温水浴
微加工材料
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（Aptes）	Sigma Aldrich	A3648	用于将PDMS键合到塑料盖玻片的硅烷化试剂
铬石英掩模 / 4"×4"HRC / 无AZ	MB W&A,  德国		光刻用光学掩模
玻璃盖玻片，D 263 M 舒特玻璃  (170 ± 5 µm)	Ibidi，德国	10812
30%过氧化氢溶液	卡洛·埃尔巴试剂	412081	过硫酸铵溶液试剂
甲基异丁基酮	卡洛·埃尔巴试剂	461945	PMMA电子束抗蚀剂显影液
显微镜载玻片（50片装）76.2 mm × 25.4 mm	Sail Brand	7101	用于键合芯片的基底
Miltex 活检穿孔器配推杆，内径 1.0 mm	Tedpella		用于芯片储液池的皮肤活检打孔器
PMMA  950 kDa	Allresist，德国	AR-P. 679.04	用于光学掩模图案化的正性电子束光刻胶
未经处理的聚合物盖玻片	Ibidi，德国	10813	用于键合芯片的基底
Prime CZ-Si晶圆  4”，（100），硼掺杂	Gambetti Xenologia Srl，意大利	30255
丙-2-醇	卡洛·埃尔巴试剂	415238
丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 抗蚀剂显影液
SU-8 3005	Micro resist technology，德国	C1.02.003-0001	负性光刻胶
SU-8 3050	Micro resist technology，德国	C1.02.003-0005	负性光刻胶
Biopunch套件，ID 4.0 mm，6.0 mm，8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	用于芯片储液池的皮肤活检打孔器
硫酸 96%	卡洛·埃尔巴试剂	410381	过硫酸铵溶液试剂
SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	硅酮弹性体（PDMS）
三甲基氯硅烷 (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	SU-8 图案化模具的硅烷化试剂
微加工设备
100 kV 电子束光刻	Raith-Vistec EBPG 5HR
热板
光学光刻系统	EV-420 双面接触式掩模对准器
反应离子刻蚀系统	Oxford Plasmalab 80 Plus 系统
真空干燥器