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方法文章

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

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DOI：

10.3791/61895

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2021年4月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

本文内容

摘要

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。

摘要

复杂的疾病模型需要前沿工具，以提供具有生理和病理相关性的可操作见解，并揭示原本无法观察到的生物学过程。能够紧密模拟体内环境的先进细胞检测技术正成为可视化和量化影响癌症进展的肿瘤-宿主双向相互作用的新方法。本文中，我们描述了两种多功能实验方案，可在微流控装置中重建高度可控的二维（2D）和三维（3D）共培养体系，以模拟在自然状态及治疗诱导的免疫监视条件下肿瘤微环境（TME）的复杂性。在第一部分中，我们提供了一种实验设置，通过明场延时显微镜监测贴壁肿瘤细胞与悬浮免疫细胞群体之间的相互作用。作为应用示例，我们分析了抗癌治疗（如所谓的免疫原性肿瘤细胞死亡诱导剂）对免疫细胞募集和活化的影响。在第二部分中，构建了具有竞争性布局的三维肿瘤-免疫微环境，并通过荧光静态成像监测长达72小时的差异性免疫细胞浸润，以评估联合治疗策略的效果。在这两种实验体系中，均展示了图像处理步骤，用于提取多种免疫细胞参数（例如免疫细胞迁移与相互作用、对治疗药物的响应等）。这些简单而强大的方法可进一步优化，以模拟包含肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞亚群的异质性与可塑性，以及它们之间作为癌症演化驱动力的相互作用所构成的TME复杂性。这些快速发展的技术与活细胞高内涵成像的兼容性，将产生大量信息丰富的数据集，同时也带来新的挑战。事实上，“共培养/显微成像/高级数据分析”三者结合，为精确的问题参数化指明了方向，有助于制定个性化的治疗方案。我们预期，未来将芯片上的肿瘤-免疫系统与人工智能相结合，用于高通量数据处理，将协同推动其作为精准医学和个体化肿瘤学中预测性与临床前工具的能力迈上新台阶。

引言

不同医学分支发展为实验性学科，依赖于在受控条件下操控细胞群体和器官功能的能力1。这种能力的基础在于是否存在可测量的模型，以重现人体内发生的生理过程。

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代2，癌症生物学需要借助新兴的体外和计算模型，在恰当的时空背景下研究肿瘤与免疫系统的相互作用界面2,3。

肿瘤微环境4（TME）是一种复杂的组织，其中肿瘤细胞持续与其它细胞成分（免疫细胞、基质细胞和内皮细胞）以及非细胞成分（细胞外基质，ECM）相互作用并动态共进化。这一复杂环境的动态特性决定了免疫细胞是作为恶性细胞的“朋友”还是“敌人”，从而显著影响疾病进展及对治疗的反应。目前，肿瘤免疫学家、生物信息学家和系统生物学专家正共同努力，以阐明肿瘤异质性5,6在空间（即不同肿瘤区域）和时间（即肿瘤进展的不同阶段）上的临床意义5,6，并在单细胞水平上表征肿瘤细胞和免疫细胞的表型与功能。作为这种协同研究的一个范例，先进的计算机视觉技术目前已被常规用于对组织学样本中免疫浸润进行空间定位分析7,8。

在实验模型领域，微流控技术和共培养技术的发展架起了动物实验与传统体外方法之间的桥梁，使得研究人员能够构建多种微工程细胞模型，例如类器官、微生理系统9,10,11（MPS）以及器官芯片12,13,14（OOC）。这些模型的共同特点是能够聚焦细胞生态系统的“宏观图景”，在利用高内涵显微镜15和图像处理方法的同时，拓展体外控制微环境因素的能力。

如今，先进的微生理系统（MPS）和器官芯片（OOC）系统已开始纳入免疫学因素，通过在现有组织和共培养体系中引入不同亚型的免疫细胞，以探索和测量多种生理病理过程，如炎症性疾病、伤口愈合、黏膜免疫以及对毒素或日常食品成分的反应16肿瘤微环境芯片模型10,11,12,13,14,15,16,17，还可与可灌注的微血管集成18,19,20,21，已开发用于研究细胞类型依赖性相互作用、物理和化学扰动以及浸润性淋巴细胞的细胞毒性活性22，以及具有临床相关性的免疫调节剂23.

本文提供了多种通用实验方案，涵盖从细胞加载到芯片到图像处理工具的全过程，可用于开展二维（第1部分）和三维（第2部分）条件下的先进肿瘤-免疫微流控共培养16，并兼容对细胞功能的动态、多参数24监测与可视化。通过采用Fiji免费软件及其工具箱25,26，本方法在样本处理和数据分析方面均保持了操作简便性和灵活性。

第1节中描述的微流控装置旨在进行贴壁癌细胞与悬浮免疫细胞的二维共培养。该平台已验证可用于体外检测存在基因突变27和/或免疫缺陷28情况下免疫细胞的行为。本文介绍了利用基于Trackmate（Fiji软件中的一个插件）的半自动方法，在明场延时图像中追踪免疫细胞的步骤。该方法可提取免疫细胞迁移的动力学参数29以及其对靶向癌细胞的响应参数（即相互作用时间），无论这些癌细胞是否经过免疫原性细胞死亡诱导剂处理27。

重要的是，这些从时间序列图像中提取的参数可以通过先进的数学方法进行处理。作为该方法潜力的一个示例，我们课题组近期发表了一项分析，该分析基于随机过程和统计力学的数学方法，用于建模细胞网络特性，并对免疫细胞行为提供参数化描述（例如，有偏或无相关性的随机游走、高度协调或非协调性运动30,31）。

第二部分提供的3D实验体系基于一种共培养方案，通过竞争性方式在两个凝胶区域中嵌入不同类型细胞和药物的组合，以重建更为复杂的具有免疫活性的肿瘤微环境（TME）。本文描述了图像处理步骤，用于在不同时间点定量分析标记的免疫细胞向Matrigel中培养的人A375M黑色素瘤细胞的浸润情况，以评估抗肿瘤药物组合的效果32。A375M细胞系是由A375P衍生而来的细胞系，具有高度转移表型，被选用于评估其在免疫细胞存在下的转移能力32。

所述模型可完全兼容多种细胞来源（包括小鼠和人类的永生化细胞系或原代细胞系、类器官、异种移植瘤等）。在本实验室近期的研究中，通过结合高内涵视频显微镜与图像分析技术，将竞争性3D布局应用于以下研究：i）在HER2+乳腺癌芯片模型中，分析抗肿瘤免疫反应（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC），并解析成纤维细胞在曲妥珠单抗治疗耐药中的作用33；ii）研究髓系细胞（即肿瘤相关巨噬细胞）在肿瘤逃逸机制及T细胞募集过程中的作用34；iii）评估基于干扰素-α诱导的树突状细胞（IFN-DCs）的免疫治疗方案的疗效，具体方法是在胶原基质中将经药物处理的结肠癌细胞与IFN-DCs共培养，并分析其有效运动及随后的吞噬事件35；iv）研究骨髓来源嗜酸性粒细胞向经IL-33处理或未处理的黑色素瘤细胞进行趋化迁移的过程36。

这些先进模型可作为观察窗口，用于理解免疫微环境在癌症转移和耐药机制中的作用，但需要进一步努力将研究成果转化为临床应用，以弥合基础研究与临床之间的差距37。

作为一种新兴趋势，将自动化高内涵显微镜技术与更符合生理特征的微系统相结合，正在为处理、分析和解读单次实验可能产生的数百甚至数千吉字节多参数数据带来全新的挑战。这直接推动了器官芯片（OOC）实验与基于人工智能38,39,40,41,42（AI）算法的结合，不仅可用于高级自动化分析，还可提取特征参数，进而输入癌症-免疫相互作用的计算机模型43，在预测性药物筛选实验的开发等方面展现出令人期待的新应用前景44。

越来越多的研究致力于疾病模型的设计，同时优化大规模扰动筛选策略，并结合单细胞多组学检测手段。这无疑将推动系统性“癌症免疫芯片”方法的发展，并有望实现其在临床上的应用，同时伴随适当程度的方法标准化，从而深入揭示免疫紊乱和癌症扩散机制的新见解。

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方案

1. 用于贴壁细胞与悬浮细胞二维共培养的芯片设计

注意：二维共培养布局（图1A-C）包含三个腔室（高100 µm），通过两组微通道阵列（500 × 12 × 10 µm3，L×W×H）相互连接。中间腔室形成两个封闭的盲端区室，在加样步骤2.5期间可阻止悬浮的免疫细胞溢出至肿瘤区域。此类装置适用于对单个细胞（贴壁或悬浮）的运动性以及细胞间相互作用进行实时二维测量16,27,28,30,31。典型的细胞迁移研究（持续数小时至数天）结合活细胞显微镜与图像处理算法45，将获取的图像序列转化为数值特征25。根据迁移模式，可估算多种生物物理指标，例如细胞的位移与速度，以及免疫细胞与靶细胞相互作用的持续时间24。

  1. 癌细胞和外周血单个核细胞的制备
    1. 癌细胞培养
      注意：MDA-MB-231 三阴性［雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性、人表皮生长因子受体 2（HER2）阴性］人乳腺腺癌细胞常规培养于添加了 10%（v/v）胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU mL⁻¹ 青霉素和 100 μg mL⁻¹ 链霉素的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基中。−1 青霉素G钠盐和 100 µg mL−1 硫酸链霉素（生长培养基），在标准培养条件下（37 °C 和 5% CO₂2).
      1. 为优化细胞培养生长，将 MDA-MB-231 细胞接种于 75 cm² 培养瓶中2 密度为 1 的培养瓶 × 106 细胞 mL-1 在12至15 mL的生长培养基中。
      2. 当细胞达到 75–80% 汇合度时，弃去培养基，用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞以彻底去除胎牛血清（FBS），随后用预热的胰蛋白酶消化 1 至 2 分钟 37 °C).
      3. 加入生长培养基以灭活胰蛋白酶的酶活性，并收集脱落的细胞。在1,100 × g条件下离心洗涤细胞两次，每次5分钟。 g 在室温（RT）下。
      4. 使用台盼蓝染色排除法通过细胞计数板对细胞进行计数，随后将其重新接种，用于常规培养（解冻后传代不超过6代）或实验操作。
      5. 对于微流控实验，接种 1 × 106 6 孔板中的细胞加入 3 mL 生长培养基，并进行相应处理 25 µM 阿霉素（DOXO）或等体积的 DOXO 溶剂（PBS）作为对照。
      6. 处理后4至6小时，用预热的PBS洗涤DOXO处理的细胞，每次5分钟，共洗涤两次，离心条件为1,100 x g 在室温下
      7. 计数经DOXO处理和PBS处理的对照细胞，方法同上（见步骤1.1.1.5），并在微流控装置中与外周血单个核细胞（PBMCs）建立共培养体系。
    2. PBMC 分离
      1. 从健康志愿者体内采集静脉全血（约10 mL）至含肝素的采血管中，轻轻颠倒混匀2至4次47.
      2. 将血液与PBS按1:1比例稀释，然后在50 mL离心管中缓慢铺置于10 mL密度梯度介质Lymphoprep上层。
        ​注意：进行分层操作时务必轻柔缓慢，以使血液与Lymphoprep形成两个清晰分明的层。
      3. 400 × g 条件下离心 30 分钟 g 在 4 °C 在无刹车的摆动转子离心机中离心。将形成四个 distinct 层：（i）顶部的血浆层，（ii）含有 PBMCs 的白色浑浊层，（iii）Lymphoprep 层，以及（iv）红细胞和粒细胞沉淀层。
      4. 用2 mL移液器轻柔吸出PBMCs，并立即用预热的生长培养基（与步骤1.1.1中所用相同）重悬，随后在1,100 x g条件下离心洗涤两次，每次5分钟。 g 室温下
      5. 按上述方法计数离心后的PBMCs（参见步骤1.1.1.5），并用于实验操作或冻存以长期保存。
  2. 在二维芯片中接种细胞
    注意：本方案中未对PBMCs进行染色。为在芯片上表征特定表型，可通过免疫磁珠分选分离免疫细胞亚群，使用荧光细胞示踪剂染色后，与未标记的剩余组分重新混合，再与靶向癌细胞共培养，如Vacchelli等报道的芯片实验所述。27，以及 Racioppi 等人34.
    1. 在开始共培养实验之前，为便于添加试剂，需将储存的芯片进行数秒的氧等离子体处理以激活表面。处理后立即向储液池中加入去离子水或磷酸盐缓冲液（PBS），以维持聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的亲水性，直至接种细胞步骤。
      注意：聚二甲基硅氧烷（PDMS）本质上具有疏水性，可能导致操作困难以及微通道中空气泡的滞留。有关氧等离子体活化的详细信息，请参见补充文件中的步骤7。
    2. 在紫外灯柜中灭菌20分钟，用新鲜PBS洗涤2-3次，然后在培养基中孵育1小时。将芯片置于培养箱中保存，直至进行铺板操作。
    3. 从全部六个储液 reservoir 中吸出过量培养基，注意避免吸走主培养腔室中的培养基。
    4. 缓慢加入1 × 105 10-中重悬的癌细胞20 µL 上左端储液池中的生长培养基，然后是下部孔中的培养基（图1A，储液池1和2）。等待5分钟，使细胞贴附于肿瘤腔内。部分细胞会沉降并附着在储液池中。
      注意：将细胞悬液注入通道开口附近。本操作适用于 MDA-MB-231 癌细胞，其他细胞系需优化细胞密度。为提高癌细胞的贴壁效果，可对表面进行包被功能化处理（如聚-L-赖氨酸、纤连蛋白）。有关包被步骤，请参考先前已发表的实验方案。16, 48,49,50.
    5. 在右侧轻轻用移液器加入1 × 106 PBMCs 重悬于 50 µL 向 3 号和 4 号孔中加入生长培养基（参见 图1A，储液池 3 和 4）。
      注意：流经后，PBMC 将分布至中间腔室，形成一个 "前"，代表实验的起始点。
    6. 将全部六个储液 reservoir 注入至多 100-150 µL 生长培养基。在显微镜下检查细胞是否已如图所示正确分布于培养区域中 图1D-最终体积可能因储液池大小而异。调整各孔中的体积使其相等。
    7. 将芯片放回培养箱中，静置约1小时，以在进行延时成像记录前稳定系统。每3天更换新鲜培养基，以防因蒸发造成损失。
      ​注意：该系统适用于活细胞/死细胞分析以及从条件培养基中进行动态多重细胞因子分泌谱分析。对于趋化因子分析，最多可检测200-250 µL 每个区室的两个储液池中收集的培养基可获取上清液等分试样。传统的ELISA和Luminex细胞因子谱分析实验大约需要 50 µL 上清液。请参见 51, 52 其他实验室在器官芯片模型上进行细胞因子谱分析的研究实例。 
  3. 无标记肿瘤细胞与免疫细胞的延时成像采集 
    注意：通常，3 个芯片排列在单个显微镜载玻片上（参见 图1A 用于2D芯片和 图4B 用于3D芯片）。使用可容纳4个载玻片的载物台支架，共培养体系适用于通过自动高内涵显微镜监测大量实验条件。芯片可轻松安装于厚度为1 mm或170微米的载玻片上（塑料或玻璃盖玻片、6孔光学底多孔板），用于高分辨率共聚焦成像。
    1. 使用配备孵育系统的视频显微镜装置，记录未标记细胞的明场图像序列。
      注意：此处的时间序列数据集（时间窗口：48 h，帧率：2 min）使用配备4倍物镜和130万像素CMOS的荧光显微镜获取，并优化以适配标准细胞培养孵育箱。
    2. 将显微镜预热至少2小时以达到平衡 37 °C 和 5% CO₂2 开始采集前。
    3. 通过将微通道阵列在肿瘤与中央区室之间居中，选择观察窗口。这有助于可视化免疫细胞浸润的动力学过程，以及癌细胞接种区域内细胞间的相互作用。
    4. 调节肿瘤细胞和免疫细胞的光照强度和焦距。
    5. 为启动延时成像采集，应根据实验需求及所研究的细胞类型优化帧率和成像时间。
      注意：必须优化成像条件，以在保持良好信噪比（SNR）的同时避免过度光暴露。由于免疫细胞运动性很强，采集帧率需足够高，以追踪目标动态过程并便于后续跟踪分析。53应在追踪算法、与生成数据集大小的兼容性以及所观察细胞的活力、密度和运动性之间取得平衡。
    6. 延时成像结束后，使用该功能 导入图像序列 和 保存 作为 使用 ImageJ 软件将帧数据集转换为 25 fps 的无压缩视频文件。
      注意：生成的视频文件现已准备好用于细胞追踪分析。此处，以空间分辨率为 1.33 µm/pixe单个视野（FOV）持续24小时的视频（3.5 GB数据栈）每种条件下包含720帧。 
  4. 数据分析：通过 Trackmate 半自动提取未标记的免疫细胞轨迹
    注意：此处使用 TrackMate 对 2D 无标记延时图像进行免疫细胞运动性分析54，一个在 Fiji/ImageJ 软件包中提供的开源工具箱（https://imagej.nih.gov/ij/）。该工具箱提供多种算法，用于实现自动化的单颗粒追踪55 （SPT）对点状结构的应用。这些方法已高效应用于荧光图像，其中目标物体在暗背景上呈现明亮且具有高信噪比（例如，亚分辨率荧光点、标记的运输囊泡、细胞核）1,25,56,57,58SPT 主要基于两个连续的步骤。第一步是在多个帧中对目标进行定位，以确定其位置（分割），如示意图所示 图2在第二阶段（颗粒连接）中，将连续帧中检测到的斑点进行连接，以估算其运动并重建其轨迹，形成一条轨迹（图3）。可以从随时间提取的每个 X、Y、Z 坐标数组计算出多种数值特征。详细文档见于 54 以及在线资源（http://imagej.net/TrackMate），参照“TrackMate 入门教程”。该过程的准确性可立即进行检查，通过直观的图形用户界面（向导式 GUI），用户可在每一步重新调整参数设置。以下部分简要描述如何将 TrackMate 应用于可见光图像的图像处理与定量分析步骤：
    1. 将完整的视频/图像时间序列拖放到 Fiji 工具栏中。
    2. 校准堆栈设置（图2A).
      1. 检查维度并选择以分配图像属性 图像> 特性填充 长度单位, 像素 尺寸 和 时间间隔 盒子
        注意： 为进行校准，请使用微通道的已知长度（500 µm, 图1C）并除以对应以像素为单位测得的长度。对于二维时间序列，需确保将Z/T字段中z切片设为1，并输入正确的视频帧数。若未正确设置，TrackMate的定量输出和参数将以像素单位和时间帧为单位进行报告。
    3. 图像预处理。
      1. 为增强在噪声背景中对免疫细胞的准确识别，需对明场图像进行预处理以校正伪影。确保数据集由8位TIFF图像组成（亮度范围：0-255）。
        注意：可见光图像中光照不均、信噪比低以及微小碎片颗粒的污染可能会影响细胞追踪过程的成功。此处，通过背景扣除、亮度/对比度调整功能，以及从原始图像中局部减去高斯模糊图像，对时间序列数据集进行预处理。ImageJ 中还提供其他多种用于相位对比或明场图像处理与分割的分析工具包，包括经验梯度阈值法（Empirical Gradient Threshold, EGT）。59.
    4. 第一校准面板（图2A)
      1. 选择图像堆栈后，启动 Trackmate（插件）>追踪  修订/确认数据的维度和时间窗口（即像素宽度和帧间隔）。
        注意：TrackMate 会自动读取图像属性框，以校准的物理单位给出最终的追踪结果（即 µm 和分钟）。
      2. 定义感兴趣区域以计算免疫细胞轨迹的提取，可通过手动输入数值或在活动图像上绘制闭合区域，然后按下“刷新源”按钮。为提取全局免疫细胞迁移路径，分别在微通道右侧（中央腔室）选择矩形区域， 图1E）以及左侧（肿瘤室， 图1D）。为分析癌症与免疫热点之间的相互作用，使用 ROI 工具绘制圆形子区域（前往 编辑 → 选择 → 指定).
        注意：当首次在新的生物学应用中运行此工具箱时，需花费必要时间优化参数设置，以重建细胞运动轨迹。
        注意： 手动追踪细胞轨迹（约50-100个细胞），以经验方式确定最佳配置，并以此作为基准验证自动提取运动的可靠性。此外，初始阶段应在较小区域内操作，以便于快速检查所选参数的准确性。
    5. 免疫斑点检测步骤（图2B)
      1. 选择默认选项 高斯拉普拉斯 (LoG) 检测器。LoG 检测器用于寻找明亮、类斑点状、近圆形的目标，其原理是对图像应用针对中等大小斑点（直径为 5 至 20 像素）优化的高斯拉普拉斯滤波器。
      2. 在 估计的斑点直径 （此处，10-13 µm）输入略大于预期斑点尺寸的数值。增加 阈值 （此处 1-3 µm）值，直到多余的伪影背景斑点减少，同时可能不移除目标特征。低于 阈值 （基于质量度量标准）不符合要求的将从后续分析中剔除。勾选中值滤波和亚像素定位选项，以提高斑点检测的质量。
      3. 使用 预览 单击按钮，可查看图像上以品红色圆圈标注的已识别免疫细胞，并进行快速检查。
        注意： 检测过程中的错误将对链接步骤产生显著影响。其他不希望出现的检测结果可在后续菜单中通过用户自定义滤波器（如斑点强度、大小或位置）进行校正。
    6. 确认选择无误后，点击 下一步.
      注意： 这些设置可能因实验装置和成像采集模式（如视野范围、物镜放大倍数、明场或荧光图像）、细胞类型（贴壁或悬浮细胞）、细胞运动速度（慢速或快速运动）、细胞行为类型（是否相互作用）以及观察区域中细胞密度（低、中、高）的不同而有所变化。
    7. 继续并跳过 初始阈值分割 菜单。选择 超堆栈显示工具 窗口
    8. 设置斑点滤镜 面板（图2C).
      1. 选择： 均匀颜色. 滤光片，如图所示 图2C，可添加以保留特征值在直方图中高于或低于可逆阈值的标记斑点。
    9. 追踪器选择阶段（图3A）。选择 简易LAP追踪器，作为粒子连接算法，需要填写三个字段（在本情况下， "最大距离关联": 30-50 µm, "间隙闭合最大距离": 25-50 µm, "最大帧间隙（用于填补空缺）"：4-6）。该检测器负责管理闭合间隙事件，其成本关联计算仅基于它们各自的距离。
      注意：最大允许连接距离限制了候选匹配点的空间搜索范围，对应于两个连续帧之间细胞移动的最大允许位移图3D).
      1. 当观察到高迁移性颗粒的轨迹出现碎片化时，应提供更大的最大位移值。
        注意：如果帧与帧之间的移动距离超过给定的最大距离值，则两个链接将不会被连接。如果片段错误地连接了两个不同的细胞，请减小最大位移值。
      2. 尝试通过调整数值来重新连接缺失的区域 "间隙闭合的最大距离" 和 "最大帧间隔".
        注意：这些参数涉及非相邻帧中的间隙闭合事件。在某些帧中可能会出现斑点消失的情况（例如，失焦的颗粒、细胞移出或进入视野、在噪声较大的图像中分割失败）。
        注意：为处理分裂或合并事件，建议选择LAP linker作为检测器，该检测器会引入链接成本矩阵惩罚。
    10. 点击 下一步 运行追踪计算。按下 下一步.
    11. 过滤轨迹 面板（图3B）。从下拉菜单中选择免疫路径的颜色 "轨迹 ID" 或其它轨迹特征。此时可选择性地设置交互式过滤功能，以提高结果质量，并可返回重新执行该步骤。
      注意：伪影斑点源于图像噪声及特征质量的下降，这将导致产生较短的轨迹片段，而目标细胞可在多个连续帧中被追踪。
      1. 为了去除短路径， 根据其包含的斑点数量进行筛选。此外，使用多种选项组合对轨迹进行排序 追踪位移, 追踪时长 或 最小值/平均值/最大值速度 排除虚假或不需要的轨迹（这些轨迹的帧数少于延时成像的总时长，或涉及污点或不移动的颗粒），以免影响后续的后处理分析。
        注意：滤光片的选择可能因具体应用和生物系统而异。
    12. 检查所有轨迹 显示选项 界面，通过时间轴滚动，验证轨迹与细胞迁移路径的匹配准确性。下拉菜单提供斑点和路径的颜色编码，便于按多种模式（如动力学参数、强度、时间或空间位置）进行可视化和筛选。
      注意：对于高密度培养或高迁移性细胞的追踪，应提高图像采集帧率，以最小化连续时间间隔内细胞的位移。
    13. 分割与连接错误的手动校正（图3E).
      1. 为提高结果质量，在分析肿瘤-免疫相互作用的感兴趣区域（ROI）时，应手动编辑斑点（如碎片颗粒、静止细胞），并剔除因检测到的肿瘤边界而产生的错误轨迹。
      2. 首先，在 ImageJ 工具栏中选择 TrackMate 工具。若要消除整个堆栈中已存在的一个点，请按住 shift 键，然后用鼠标光标在目标点上创建一个 ROI 掩膜（以绿色圆圈标出），随后按下 DEL 键。
      3. 若因斑点消失导致轨迹缺失，需添加新斑点时，请将鼠标置于目标位置后按 A 键。完成此操作后，重新执行轨迹连接计算过程。
    14. 当满意时，选择 分析 在 显示选项 面板以生成三个文本文件（图3C 和 3F）。下表中的 "轨迹中斑点的统计分析" 提供免疫斑点的空间-时间坐标（标注了相应帧数和轨迹编号的细胞的X-Y-Z位置）。 "轨迹统计中的链接" 和 "轨迹统计" 包含有关轨迹的信息：轨迹持续时间、检测到的间隙或点的数量、轨迹起始和终止帧等。为每个数据集保存并导出。
      注意：单击结果窗口中的某一行时，相应的斑点、链接或轨迹将在延时视频中被激活，以便进行视觉检查。重复过滤步骤以选择或移除轨迹。所有后续导出的数据将随之更新。提示：在处理相互作用的兴趣区域（ROI）时，可利用轨迹的起始帧、终止帧及持续时间值来计算癌细胞与免疫细胞之间的接触时间。
    15. 按下 保存 按钮以生成包含所有参数值、图像路径以及随时间变化的斑点位置的 XML 文件。“加载 TrackMate 文件”命令（插件> 追踪）将为每个电影文件单独恢复整个过程会话。
    16. 移动到图形用户界面中名为 选择一个操作。在列表中使用 捕获叠加 > 执行 生成带有轨迹叠加的视频功能。提示： "绘制 N-点图 与 时间" 可选择此选项以计算感兴趣区域（ROI）内免疫细胞的空间密度图6B，右侧面板）。
    17. 后期处理分析与迁移统计
      1. 在 Trackmate 中直接分析原始位置数据，或导出数据以计算全面的动力学参数29 （即总轨迹长度、欧氏距离、限制比、均方位移）56平均或瞬时轨迹速度、停滞系数、迁移角度分布、前向迁移指数、平均直线速度，用于分类免疫细胞迁移行为（如定向迁移或扩散性运动）30,31）以及对靶向癌细胞的反应（例如，经处理的 与 对照组
        ​注意：其他有用的插件，例如 Chemotaxis and Migration Tool（http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/），可提供多种图形（如图中所示的玫瑰图或扇形图）， 图6）以及用于实验性细胞迁移与趋化数据高级分析和可视化的统计学方法。结合细胞追踪与细胞分割算法24,25,45 可实现单细胞水平形态学参数的测量（例如，细胞表面积、长轴与短轴长度以及细胞长宽比）。

2. 竞争性检测中的3D免疫活性肿瘤芯片模型

注意：3D 芯片设计如图所示 图4，包含5个主要区域：一个中央区域用于悬浮免疫细胞的导入，两个侧边区域用于在水凝胶基质（150-250 µm 高）以及培养基灌注室。免疫室和肿瘤室通过两组狭窄的微通道阵列（200×12×10 µm3，L×W×H, 图 4E。定期 100 µm- 间距相等的等腰梯形微柱（每侧凝胶区域约有 25-30 个界面）， 图4C利用表面张力与毛细作用力之间的平衡，在注射过程中通过屏障限制凝胶溶液60,61 并将肿瘤区域与两个侧向的额外培养基腔室连接，以建立凝胶-液体界面（图5。3D竞争性检测的详细特征如下所示 图4免疫细胞优先迁移至承载肿瘤的两个水凝胶区域 经过不同处理的细胞可被监测和定量。这种特殊的竞争性布局可用于研究多种不同的癌症生物学表型（例如，耐药性与侵袭性、原发性或转移性、应答者与非应答者）。此外，凝胶包埋区域可轻松整合不同的细胞群体，以重建包含基质成分（成纤维细胞、内皮细胞）的更复杂的肿瘤微环境。23 或模拟特定的免疫抑制微环境34 （例如巨噬细胞），用于解析药物耐药性和肿瘤逃逸机制。
注意：可使用商业试剂盒进行活/死细胞检测（例如 Thermo Fisher Scientific, Incucyte 试剂），通过检测细胞核和活化型caspase染色来评估有丝分裂或凋亡性死亡事件，如 Nguyen 等人所报道。33.

  1. 细胞与基质溶液的制备及装置加样
    注意：在以下实验设置中，两个凝胶区域包含人A375M黑色素瘤细胞系的混合物，这些细胞在基质溶液（例如Matrigel）中培养，并暴露于作为单药治疗或联合用药的治疗剂。该设置使我们能够以竞争性方式评估两种药物联用相对于单药的疗效，并量化其吸引外周血单个核细胞（PBMCs）的能力。
    1. 将基质溶液（例如 Matrigel）的储备液置于冰上解冻 4 °C 实验前一天将冰箱准备好。
      注意：请勿将产品反复冻融，否则会导致其变性 "成团的"其他合成或天然水凝胶方案也可适用于本实验体系。请参考 33,34,35 用于制备胶原基质中的癌细胞。
    2. 将经活细胞兼容性 PKH67 绿色荧光细胞连接剂染色的 A375 人黑色素瘤细胞重悬于基质溶液（2 mg mL⁻¹）中-1）。如需，加入5-aza-2'-deoxycytidine（DAC； 2.5 µM），称为DAC和/或IFN-α2b，按适当剂量称为IFN32.
      注意：核对基质瓶规格表上的批号。根据浓度计算配制浓度为 2 mg/mL 所需的培养基体积-1 请根据您的具体应用调整最佳蛋白浓度和癌细胞悬液浓度。
    3. 小心地上下吹打以避免产生气泡。混合时将微量离心管置于冰上，以防止发生非预期的聚合反应。
    4. 灭菌后，将装置置于冰上（使用带盖冰桶），以在整个加样过程中防止基质溶液凝固。
    5. 缓慢注射两种 IFN 和 DAC/IFN Matrigel/肿瘤细胞混合物（2-4 µL）分别加入左侧和右侧凝胶孔中，使用 10-µL 使用预冷的吸头的微量移液器（图 5A)。从一侧施加轻柔压力，推动基质溶液直至到达另一侧。
      注意：选择基质溶液的体积应避免溢出至相邻通道。加样时切勿施加过大的移液压力，以防溶液泄漏至培养基通道和中央通道。若在加样过程中通道内的凝胶路径发生堵塞，可尝试从另一入口注入溶液，直至凝胶前沿相遇。当将微量移液器从入口拔出时，应按住活塞，否则负压会将基质溶液吸入移液器内。
    6. 将装置以直立位置放入培养箱中 37 °C 和 5% CO₂2 30 分钟，以使基质溶液发生凝胶化图5B). 小心操作含有未聚合凝胶的芯片，以防止凝胶从通道中泄漏。
    7. 同时，重悬PKH67标记的PBMCs（1×106 细胞）在 10 µL 完全DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）
    8. 基质凝胶化后，用（50-100 µL在所有六个储液池中加入等量的培养基，以防止芯片中的凝胶干燥。将芯片置于培养箱中孵育，直至接种免疫细胞悬液。
      注意：在显微镜下检查肿瘤细胞在凝胶中的分布是否正确且均匀，以及聚合凝胶屏障的完整性。凝胶区域部分形成或不均匀，或混合物中存在气泡，可能导致实验开始时因初始压力波动，使PBMCs过早流入凝胶培养基通道。
    9. 从六个孔中吸出培养基，并将移液头置于培养基通道入口附近，以中等压力轻轻注入PBMC细胞悬液。加样时间顺序如图所示。 图 5C:
      1. PBMCs 在 10 µL 将培养基加入上部中央孔中。
      2. 50-100 µL 将培养基加入侧通道的四个孔中，每孔均加入。
      3. 40-90 µL 将培养基加入上部中央孔中。
      4. 50-100 µL 将培养基加入下部中央孔中。
    10. 在加样步骤后，需在显微镜下确认外周血单个核细胞（PBMCs）的分布仍局限于中央腔室。图7A).
      注意：若条件不理想，可根据需要调整浓度，并使用全新的芯片重复接种步骤。在计算计划实验条件所需的体积时，应参考额外数量的芯片（15–20%），以预留可能的误差和调整空间。体积和浓度应根据具体应用进行优化。
    11. 将组装好的装置置于培养箱内的水平表面上 37 °C 和 5% CO₂2 用于后续荧光成像采集。加载悬浮的免疫细胞后，请小心操作芯片。
      注意：每隔 2-3 天更换一次培养基，以补偿储液池中因蒸发造成的体积损失。对于趋化因子谱分析，最多可 100 µL 在步骤1中，可从培养隔室的两个孔中分别吸取液体，请参见步骤2.7。
  2. ImageJ 中单通道荧光图像中招募的 PBMCs 的自动计数
    注意：可用于共聚焦高分辨率成像的常规免疫荧光方法可作为终点检测手段应用于芯片上的操作。基本染色步骤包括细胞在芯片上的固定、通透化、封闭、抗体结合，以及其间穿插的洗涤步骤和细胞核染色。在嵌有肿瘤微环境的3D凝胶区域中浸润的未标记免疫细胞，可在预定时间点进行固定，并针对活化/耗竭/成熟相关标志物进行染色（例如，对于CD8+细胞，可检测CD69、CD95、PD1、TIM3等标志物）。参见Parlato等人的研究。35，通过共聚焦显微镜评估SW620凋亡细胞的吞噬作用，使用安装在 170 µm-厚盖玻片。在芯片上加入抗人HLA-DR-FITC抗体 aliquots 对IFN-DCs进行染色。
    为计算在竞争性信号刺激下浸润的荧光标记活免疫细胞的程度，常规图像分析流程设置如下（图 7D- G):
    1. 在特定时间点，分别获取经单一或联合药物处理的肿瘤细胞所在左右凝胶区域的相差显微图像以及红色/绿色荧光通道的显微照片。
      注意：此处图像在细胞接种后（0 h）、孵育48 h后及孵育72 h后，由EVOS-FL荧光显微镜采集图 7A- B使用 4x-10x 放大倍数拍摄中央腔室、微通道阵列以及两个相邻的侧通道，侧通道中分别含有 A375 加 IFN 和 A375 加 DAC/IFN。
      1. 进行图像采集操作时，应考虑待测量的参数，并避免待计数特征的信号饱和。由于生物样本本身的变异性、染色质量以及所采用的显微镜技术在用户导向应用中的差异，最佳的图像分割结果依赖于所获取图像的性质。
    2. 将荧光单通道数据（本例中红色 = PBMCs）通过拖拽方式载入 Fiji 的主窗口图 7D复制图像以避免在选择预处理滤镜直至最终分割的过程中覆盖原始数据。
      1. 如果图像是彩色图像（RGB），请点击 图像 > 输入8位或16位以转换为灰度图像。检查 编辑 > 选项 > 转化s 设置为 转换时的比例尺.
    3. 通过去除噪声和伪影对原始数据进行预处理。
      1. 前往 步骤 > 减去背景 通过应用滚球算法校正具有大空间强度变化的不均匀噪声背景。将半径设置为至少等于最大前景颗粒的尺寸。选择 预览 用于试错流程以获得最佳结果的参数设置。数值过小可能导致目标结构被错误地移除。
      2. 在 亮度&Contrast 按住 command 键拖动 最小值/最大值 滑块以调整直方图中强度的范围。移动 最大值 向左滑动以增加亮度，避免特征 washed-out。移动 最低限度 向右滑动以增加图像对比度，避免背景中较不明显的特征消失。点击 应用 以固定更改。
    4. 图像增强。
      1. 前往 步骤 > 滤光片 以及在图像上实验中值滤波和高斯滤波（图7E).
        注意：预滤波半径应根据图像噪声像素进行调整。非线性中值滤波通过将像素值替换为其邻域像素的中值，以减少椒盐噪声。 "高斯模糊" 通过用周围像素的加权平均值替换像素，对数字图像进行平滑处理。权重来源于高斯概率分布，因此邻近像素的影响更大。
      2. 可选择性前往 步骤 > 数学 > 伽马 已勾选 预览 调节对比度的盒子
        注意：在 B 中设置的强度&C 面板在两个最小值和最大值之间进行缩放。数值 < 1.0 强调低强度之间的差异，同时保持数值 > 1.0 用于突出高亮度之间的差异。伽马校正有助于确定显示范围，在不使最亮区域饱和的前提下显示最暗的物体。
    5. 创建二值图像掩膜。
      1. 前往 图像 > 调整 > 阈值最常使用的方法是基于强度水平的直方图分析来确定阈值，如图所示。 图 7F在下拉菜单中，尝试不同的全局阈值方法（在本例中，采用Otsu法）。
      2. 手动滚动或在直方图面板中输入已知的像素强度范围，观察叠加在图像上的红色图案的变化，该图案大致呈现实际的细胞区域。 重置 按钮可移除叠加层。确认无误后，单击 应用 生成图像的二值化版本。检查 步骤 > 二元 > 选项 用于控制阈值化图像的显示方式以及颗粒分析器识别对象的方式。
    6. 使用菜单命令 过程/二值化/分水岭颗粒 在阈值处理过程中，对于部分重叠或合并的区域，可通过分水岭算法添加一条1像素宽的线条，以实现精确分割。执行形态学操作（如膨胀或腐蚀），以增加或去除欠饱和或过饱和区域的像素。
      注意：欲了解更多信息 参见 菜单命令部分或参考 形态库基于数学形态学用于处理二值数据的集成库 J。
    7. 定量图像特征描述
      1. 在获得满意的物体识别后，打开粒子分析器 分析 > 分析颗粒. 可根据颗粒的大小和圆度（以像素或校准后的测量单位表示）将其排除（在显微镜设置下检查正确的比例尺） 图像 > 特性）。为包含所有对象，将默认范围设为 0-无穷大，并将圆度的默认范围设为 0.00 - 1.00（0 表示直线，1 表示完美圆形）。
      2. 过滤小颗粒 "噪声" 非关注的像素或特征，请设置最小和最大范围。勾选 包含孔洞，显示，轮廓 和 显示结果 窗口字段中的选项。 边缘排除 将舍弃在图像边界上检测到的颗粒。 添加 至 经理 将获得的选择添加到 ROI 管理器中以进行进一步分析，同时保留颗粒的位置信息。
        ​注意：在 "ROI 管理器"可以校正自动分割记录的输出结果（合并被错误分割的细胞，分割被错误合并的细胞）。使用 Fiji 工具栏中的选择工具，在包埋有癌细胞的两个凝胶区域内选择感兴趣区域（ROI），以评估免疫细胞浸润情况。
    8. 将获得的数值导出至电子表格以进行统计分析，如图所示。 图7G. "结果" 列出与已编号的轮廓颗粒特性相关的数据表。 "总结" 打开一个窗口，显示图像名称、总数量以及整幅图像的其他信息。
      1. 前往 分析 > 设置测量参数 以涵盖多种参数。
    9. 可选择性地记录宏（通过选择） 插件 > 宏 > 记录) 以自动化处理流程，并节省对大型数据集的分析时间。
      1. 使用相同的处理流程分析相同区域的绿色荧光通道，以评估三维区域中肿瘤细胞的形态学变化16

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结果

肿瘤免疫浸润是宿主抗肿瘤反应的一个参数。肿瘤中浸润性白细胞的组成、密度、位置和功能状态具有异质性，这些白细胞与癌细胞之间的相互作用可能蕴含可用于预测疾病进程和治疗反应的临床相关信息。在此背景下，微流控技术可作为互补且具有优势的体外工具，用于探索肿瘤的免疫微环境，以及监测对抗癌治疗的反应。将微流控检测、活细胞成像与追踪软件相结合，可能建立可靠的定量方法，以量化免疫细胞在不同环境下如何调整其迁移模式。在本章节中，我们报告了在通过标准软光刻工艺制备的定制微流控装置中，建立免疫细胞与靶向癌细胞的多功能二维（2D）或三维（3D）共培养体系的操作步骤。在第1节中，使用微流控装置使贴壁细胞（MDA-MB-231癌细胞）与非贴壁细胞（外周血单个核细胞，PBMCs）之间实现化学和物理接触。某些化疗药物（如蒽环类药物等）可诱导恶性细胞发生“免疫原性”凋亡，从而增强其在免疫活性宿主中的可识别性。癌症免疫原性细胞死亡（ICD）的特征是濒死细胞释放膜结合型和可溶性信号分子，这些分子作为警报素激活免疫细胞。为了对ICD反应进行定量验证，我们利用微流控平台收集的数据，其中白细胞可通过特制的微通道桥向其靶细胞移动。在将来自健康供体的PBMCs（WT，野生型）与经或未经...

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讨论

所述方法旨在以可调节的复杂程度，建立一种通用方法，以重现肿瘤免疫学领域的两个重要方面，从而受益于采用更具生理相关性的体外模型。第一个方面涉及肿瘤细胞群体本身，研究单个细胞的特性有助于更准确地描述其异质性以及相关的生物学和临床意义，包括对治疗的耐药性、转移倾向、干细胞特性及分化程度。另一方面则是肿瘤微环境（TME），包括非癌性组分（免疫细胞和基质细胞、血管）以及化学/物理环境（细胞外基质成分、趋化因子及其他释放的可溶性因子），这些因素可深刻影响疾病特征及个体对治疗——尤其是免疫治疗——的反应63。值得注意的是，将上述方法拓展至其他研究领域时，需充分理解新模型在开发与应用过程中所带来的一系列局限性与挑战。

引用工程建模中的一条准则（“对问题建模，而非对系统建模”），必须优化确定在芯片模型中所需的最少（细胞、物理和化学）组分与条件，以确保模型在整个实验过程中具有生物学相关性和稳定性。因此，每种细胞类型、微环境和实验设置的组合都必须经过仔细选择、评估，并在单次实验以及不同实验批次之间持续监测。这些检查包括如实验方案部分所述，严格控制微流控装置...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。AS 由意大利癌症研究基金会（AIRC，启动基金 2016 #18418）和意大利卫生部（RF_GR-2013-02357273）提供资助。GS 和 FM 由意大利癌症研究协会（AIRC）项目编号 21366（资助对象：G.S.）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养材料 
50 mL 离心管Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯CLS430828离心管
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma；St. Louis，MOA3656DNA去甲基化剂
6孔板Corning-Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯CLS3506培养皿
75 cm² 细胞培养处理过的培养瓶康宁，纽约州，纽约430641U培养瓶
A365M美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，弗吉尼亚州马纳萨斯
CVCL_B222		人黑色素瘤细胞系
盐酸多柔比星Millipore-Sigma；St. Louis，MOD1515蒽环类抗生素 
Dulbecco改良Eagle培养基 DMEMEuroClone Spa，意大利米兰ECM0728LSK-MEL-28 细胞培养基  细胞
不含钙不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液EuroClone Spa，意大利米兰ECB4004L生理盐水缓冲液
胎牛血清EuroClone Spa，意大利米兰ECS0180L细胞培养辅助设备
FicollGE-Heathcare17-1440-02从人血中分离单个核细胞 
血细胞计数板Neubauer细胞计数器
肝素化小瓶赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆静脉血采集管
干扰素α-2bMillipore-Sigma；St. Louis，MOSRP4595重组人细胞因子
L-谷氨酰胺 100XEuroClone Spa，意大利米兰ECB3000D细胞培养辅助设备
液氮
Lympholyte 细胞分离培养基Cedarlane Labs，Burlington，加拿大通过密度梯度离心法分离淋巴细胞
LymphoprepAxis-Shield PoC AS，挪威奥斯陆
Matrigel康宁，纽约州，纽约354230生长因子减少型基底膜基质
MDA-MB-231 美国典型培养物保藏中心（ATCC），弗吉尼亚州马纳萨斯 HTB-26人乳腺癌细胞系
青霉素/链霉素 100X  EuroClone Spa，意大利米兰ECB3001D细胞培养辅助设备
移液器辅助器Drummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201液体处理
PKH26 红色荧光细胞连接剂Millipore-Sigma；St. Louis，MOPKH26GL红色荧光细胞染料
PKH67 绿色荧光细胞连接剂Millipore-Sigma；St. Louis，MOPKH67GL绿色荧光细胞染料
RPMI-1640EuroClone Spa，意大利米兰ECM2001LMDA-MB-231 细胞培养基
血清移液管（2 mL，5 mL，10 mL，25 mL，50 mL）Corning- Millipore-Sigma；St. Louis，MOCLS4486；CLS4487；CLS4488；CLS4489；CLS4490液体处理
无菌吸头（1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa，意大利米兰ECTD00010；ECTD00020；ECTD00200；ECTD01005移液器使用技巧
计时器
台盼蓝溶液赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆15250061用于评估细胞活力的细胞染色
胰蛋白酶EuroClone Spa，意大利米兰ECM0920D贴壁细胞解离试剂
细胞培养设备
EVOS-FL 荧光显微镜赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆活细胞荧光显微镜
人源化细胞培养孵育箱 赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆311 型直接加热 CO₂ 培养箱；TC 230细胞培养的孵育 37 °C，5% CO₂2
朱莉显微镜Nanoentek
实验室冰箱（4 °C)FDM
实验室安全柜（II级）Steril VBH 72 MP层流罩
光学显微镜Zeiss
可冷藏离心机Beckman Coulter
恒温水浴
微加工材料 
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（Aptes）Sigma AldrichA3648用于将PDMS键合到塑料盖玻片的硅烷化试剂
铬石英掩模 / 4"×4"HRC / 无AZ MB W&A,  德国光刻用光学掩模
玻璃盖玻片，D 263 M 舒特玻璃  (170 ± 5 µm)Ibidi，德国10812
30%过氧化氢溶液卡洛·埃尔巴试剂412081过硫酸铵溶液试剂
甲基异丁基酮卡洛·埃尔巴试剂461945PMMA电子束抗蚀剂显影液
显微镜载玻片（50片装）76.2 mm × 25.4 mm Sail Brand7101用于键合芯片的基底
Miltex 活检穿孔器配推杆，内径 1.0 mmTedpella用于芯片储液池的皮肤活检打孔器
PMMA  950 kDaAllresist，德国AR-P. 679.04用于光学掩模图案化的正性电子束光刻胶
未经处理的聚合物盖玻片Ibidi，德国10813用于键合芯片的基底
Prime CZ-Si晶圆  4”，（100），硼掺杂Gambetti Xenologia Srl，意大利30255
丙-2-醇卡洛·埃尔巴试剂415238
丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）Sigma Aldrich484431-4LSU-8 抗蚀剂显影液
SU-8 3005Micro resist technology，德国C1.02.003-0001负性光刻胶
SU-8 3050Micro resist technology，德国C1.02.003-0005负性光刻胶
Biopunch套件，ID 4.0 mm，6.0 mm，8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80用于芯片储液池的皮肤活检打孔器
硫酸 96%卡洛·埃尔巴试剂410381过硫酸铵溶液试剂
SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒Dowsil, Dow Corning11-3184-01硅酮弹性体（PDMS）
三甲基氯硅烷 (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLSU-8 图案化模具的硅烷化试剂
微加工设备
100 kV 电子束光刻Raith-Vistec EBPG 5HR
热板
光学光刻系统EV-420 双面接触式掩模对准器
反应离子刻蚀系统Oxford Plasmalab 80 Plus 系统
真空干燥器

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