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中子晶体学数据收集与处理在蛋白质结构中氢原子建模的应用

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DOI：

10.3791/61903

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2020年12月1日

 , 
1Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, 2Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

本文内容

摘要

中子蛋白质晶体学是一种能够定位氢原子的结构分析技术，从而提供有关蛋白质功能的重要机制信息。本文介绍了蛋白质晶体的安装、中子衍射数据收集、结构精修以及中子散射长度密度图分析的工作流程。

摘要

中子晶体学是一种结构分析技术，可确定生物大分子中氢原子的位置，从而提供有关质子化状态和水合状态的机制性重要信息，且不会引起辐射损伤。相比之下，X射线衍射仅能提供关于轻原子位置的有限信息，且X射线束 迅速引发光敏物质的辐射损伤 辅因子和金属中心。本文展示了在橡树岭国家实验室（ORNL）的IMAGINE和MaNDi光束线上，获得蛋白质晶体中子衍射结构所采用的工作流程，前提是已获得尺寸合适的蛋白质晶体（> 0.1 mm3) 已经培养完成。我们展示了氢化蛋白的封片方法 用于中子衍射数据收集的石英毛细管中的晶体，以及已安装晶体与D的蒸气交换过程2含氧缓冲液中以确保可交换位点上的氢原子被氘原子取代。氘的引入可降低由氢原子非相干散射引起的背景信号，并避免因其负相干散射长度导致的密度抵消现象。样品取向与室温数据采集策略以高通量同位素反应堆（HFIR）的IMAGINE束线上的准劳厄法数据采集为例进行说明。此外，在散裂中子源（SNS）的MaNDi飞行时间仪器上，展示了晶体安装及在液氮中快速冷冻以捕获不稳定反应中间体的低温数据采集方法。模型坐标文件与衍射数据文件的准备，以及中子散射长度密度（SLD）图的可视化也将予以介绍。最后将讨论仅使用中子数据或联合X射线与中子数据进行结构精修，以获得目标蛋白质的全原子结构。该中子结构解析过程将以溶菌性多糖单加氧酶的晶体为例进行演示。 Neurospora crassa LPMO9D，一种参与难降解多糖降解的含铜金属蛋白 通过 糖苷键的氧化断裂

引言

中子大分子晶体学是一种能够揭示蛋白质结构及其内在化学特性的独特技术。该技术在概念上与X射线衍射相似，中子衍射同样可提供大分子结构的原子级细节；然而，中子与原子核的相互作用使得轻元素原子（通常在X射线衍射中难以检测）得以精确定位1。在X射线衍射过程中，X射线由电子云散射，导致氢（H）等轻原子在分辨率未接近亚埃级（sub-Ångström）的电子密度图中难以清晰显现2。相比之下，中子的散射强度取决于其与原子核之间复杂的相互作用，同一元素的不同同位素具有不同的散射长度。因此，在中子散射长度密度（SLD）图中，轻原子及其同位素（如氢（1H）和氘（2H 或 D））的可见性与蛋白质骨架中的碳、氮和氧原子相当。此外，由于中子散射强度与电子数目无关，当轻元素与重元素彼此靠近时，其散射信号不会像X射线散射那样被重元素掩盖。利用中子衍射时，氢（H）及其同位素氘（D）的可见性显著增强，这为了解催化关键残基、辅因子和配体的质子化状态提供了重要信息，同时有助于确定水分子的取向，从而揭示催化机制和蛋白质化学的关键细节3。中子衍射还具有一项优势，即它是一种非破坏性技术，特别适用于对电离敏感的生物样品，例如含有金属中心或光敏氧化还原辅因子的蛋白质2。本文的主要目的是概述获得高质量中子蛋白质晶体 结构的完整工作流程 。我们建议感兴趣的读者参考 Podjarny 等人4、 Blakeley5、 Blakeley 等人6 以及 O‘Dell 等人3 关于中子蛋白质衍射的优秀综述，以及 Ashkar 等人7 关于中子散射进一步应用的文献。

中子主要通过核反应中的两种过程产生：反应堆源中的核裂变或加速器源中的散裂反应8。反应堆源通过235U同位素的核裂变产生连续中子束，而散裂中子源则通过质子轰击靶材（例如液态金属汞）产生脉冲中子束9。位于美国田纳西州橡树岭的橡树岭国家实验室（ORNL）同时拥有一个稳态中子源——高通量同位素反应堆（HFIR），以及一个60 Hz脉冲中子源 ——散裂中子源（SNS）。位于HFIR的IMAGINE光束线是一种专为生物大分子优化的中子衍射仪（补充图1）10。IMAGINE采用中子成像板探测器，利用2.8–4.5 Å范围内的窄带通，测量晶胞边长<150 Å的单晶的准劳厄衍射数据。位于SNS的Macromolecular Neutron Diffractometer（MaNDi）是一种飞行时间（TOF）劳厄中子衍射仪，配备球形探测器阵列框架（DAF）（补充图2）11。MaNDi通过在2.0–6.0 Å范围内调节2 Å的波长带宽，测量晶胞边长为10–300 Å的单晶衍射数据12。

中子的产生过程需要极高的能量，因此与同步辐射源的X射线束流相比，中子束流的通量相对较低13。为了在数据收集中获得足够的信噪比，必须生长出尺寸和质量均合适的晶体14。通常，晶体体积需大于> 0.1 mm3，才能获得具有足够统计精度的数据15。除了通量较低之外，还需考虑中子与样品原子核相互作用的固有特性16。同一种元素的不同同位素对中子的散射长度不同，这一特性可在小角中子散射（SANS）中被有效利用，以屏蔽或突出样品的特定区域，该过程称为反差匹配17。在衍射实验中，氢（1H的相干中子散射长度为-3.741 fm）的负相干散射长度可能导致中子散射密度图中的特征相互抵消，因为其他生物学相关原子的相干中子散射长度均为正值，包括碳（12C为6.6511 fm）、氮（14N为9.37 fm）、氧（16O为5.803 fm）、磷（31P为5.13 fm）和硫（32S为2.804 fm）（表1）12,14。此外，氢的非相干散射长度较大（25.274 fm），会增加数据收集过程中的背景信号，从而影响数据集的质量并降低分辨率7。为克服氢带来的这些限制，在中子衍射实验中必须将氢替换为其同位素氘（2H，D），后者具有正的相干中子散射长度（6.671 fm）和显著更低的非相干散射长度（4.04 fm）19。这一替换可通过全氘代实现，即在完全氘代的培养基中培养表达蛋白的生物体，从而确保氘在所有氢位点上的完全掺入20。也可以仅在可交换位点（可滴定基团）将氢部分替换为氘，而碳键合的不可交换位点仍保留氢21。这可通过在氘代母液中培养含氢的蛋白质晶体来实现22。然而更常见的方法是，在H2O缓冲液中生长出足够大的晶体后，通过气相交换进行H/D交换23。在此类情况下，晶体被安装在石英毛细管中，并与基于D2O的 母液进行气相平衡。

中子源的中子通量有限，导致数据收集时间较长，通常从数天到数周不等24。在橡树岭国家实验室（ORNL），IMAGINE 和 MaNDi 均采用 2–6 Å 范围内的窄波长带通，以优化数据收集25。数据可在室温 或低温条件下收集。低温数据收集有可能 提高数据质量，并为捕获催化中间体的冻结状态提供可能。在完成中子衍射数据收集后，通常会在同一晶体上、在相同温度下，或在相同条件下生长的另一晶体上收集一套X射线数据集26。在相同温度下进行数据收集，可使结构精修同时基于X射线和中子数据进行，从而避免因温度变化可能引起的假象，例如水分子可见性与位置的变化，或具有交替构象的残基占据率的变化27。联合X射线与中子数据精修可提高数据与参数的比例，并具有如下优势：利用X射线数据精修蛋白质主链坐标，同时利用中子衍射数据精修氢/氘（H/D）原子的位置28。当使用部分氘代样品时，这种方法尤为有用，因为此时蛋白质非可交换位点上的氢原子会导致散射密度抵消现象 。尽管蛋白质数据库（PDB）中收录的X射线结构数量远超中子结构，但最初为X射线数据精修设计的软件包现已扩展支持中子数据的处理3,29,30。数据收集完成后，可使用如 phenix.refine、CNSsolve（nCNS）或 SHELXL 等精修程序对模型进行精修28,31,32,33。在精修过程中，可使用 COOT 手动拟合中子散射密度图34。结构解析完成后，坐标文件以及中子和/或X射线衍射 数据文件可提交至PDB，由其进行验证并存档，供公众访问18,29,30。

蛋白质的结构分析是一种多层面的方法，其中采用多种技术来探究其功能与作用机制35中子蛋白质晶体学可提供有价值的化学信息，以拓展和补充来自X射线等其他研究的发现 衍射，光谱学，核磁共振（NMR）或微晶电子衍射（microED）36中子蛋白质衍射技术在揭示酶促反应机制方面具有独特优势，因为氢原子在其化学过程中起着核心作用。中子不会引起辐射损伤，因此特别适用于金属蛋白的研究。37. 本文展示了一个从样品制备到数据收集、精修与分析的中子蛋白质衍射过程的代表性实例（图1已培养出尺寸足以进行中子衍射实验的金属蛋白晶体 Neurospora crassa LPMO9DNcLPMO9D NcLPMO9D 是一种含铜的金属蛋白，通过在糖苷键处插入氧原子来参与难降解纤维素的降解过程38,39。该 NcLPMO9D 活性位点包含一个单核铜中心，该中心位于特征性的“组氨酸支架”结构中，由N端组氨酸和另一个保守的组氨酸组成补充图3)40真菌LPMO的N端会发生甲基化，但这种翻译后修饰在酵母中进行重组表达时不会发生。在 NcLPMO9D 静息态中，铜中心以 Cu 形式存在2+ 氧化态，并通过单电子还原激活为 Cu1+，使分子氧能够结合并被快速还原为超氧物种而得以活化41,42整体 NcLPMO9D 反应需要进一步添加一个电子和两个质子，以形成羟基化的多糖产物43负责从多糖底物中夺取氢原子（HAA）的活性氧物种的身份尚未确定，目前正在进行深入的结构与计算研究。44,45. 鉴于该处的氧化还原化学反应 NcLPMO9D 活性位点，减轻辐射损伤尤为关键。本文展示了室温与低温条件下的数据收集 NcLPMO9D 晶体以确定 NcLPMO9D 静息状态和活动状态下的结构 活化的还原形式，分别46重点将放在蛋白质晶体安装、用于数据收集的线站仪器设置、数据和坐标文件的准备，以及构建全原子中子结构模型所必需的精修步骤。

方案

1. 晶体尺寸评估

  1. 使用配备普通光和偏振光的显微镜测量晶体尺寸。选择体积不小于约 0.1 mm3 的晶体（补充图 4）。
  2. 标记含有足够大晶体的孔位，并记录用于生成这些晶体的结晶条件。

2. 氘代结晶缓冲液的制备

  1. 将结晶缓冲液组分溶解于 D2O 中，以制备氘代结晶缓冲液。
  2. 通过以下公式计算溶液的 pD 值，从而调节缓冲液的 pH：
    pD 测量公式，pD = pH_meas + 0.4，与生物化学分析相关。 (1)
    其中 pHmeas 是使用标准玻璃电极测得的 pH 值。NcLPMO9D 结晶缓冲液的原始 pH 为 6.0，因此在 pD 6.0 条件下，氘代结晶缓冲液的 pHmeas 应设定为 5.6。
  3. 使用前将 pH 计电极浸入 D2O 中十分钟（补充图 5）。
  4. 使用碱性试剂 NaOD 或酸性试剂 DCl 将 pHmeas 调节至 5.6。

3. 晶体收获

  1. 将硅化处理的 22 mm 圆形玻璃载玻片放置在用于收取晶体的结晶板旁边。每个晶体使用一块洁净的玻璃载玻片（图 2A）。
  2. 打开密封的夹心盒，取出含有蛋白质晶体的 9 孔大容量硅化玻璃板。
  3. 用微量移液器从结晶储液中吸取 10–20 μL 溶液，并将其滴加到玻璃载玻片上（图 2B）。
  4. 使用合适尺寸的微 loop 环收取晶体，并将晶体放入载玻片上的储液液滴中，以去除常与晶体一同被收取的杂质（图 2C 和 图 2D）。
    注意：操作需迅速，因为小体积液滴容易蒸发。晶体暴露在空气中时也容易干燥。当结晶液滴体积较小时，可能需要向蛋白液滴中添加一些储液，以防止晶体干燥。

4. 晶体安装

注意：毛细管装载方案因实验者的偏好而异。为防止晶体受损，需要截短的毛细管应使用切割石或砂纸划痕，以确保断裂面平滑。

  1. 通过毛细作用或直接用移液器将约 10 μL 储液缓冲液加入直径 2 mm、长度 50 mm 的石英毛细管的一端，填充该端（图 3A）。
    注意：建议使用者采用石英毛细管，因为除了其机械强度外，石英还能有效减少中子束的吸收，并降低毛细管本身带来的背景信号。玻璃毛细管会产生较强的背景信号并吸收中子，从而影响数据质量。
  2. 使用挂载环将晶体轻轻放入石英毛细管内的储液缓冲液中（图 3B 和 图 3C）。
  3. 轻轻敲击毛细管，使缓冲液及其浸没的晶体沿毛细管向下滑动（图 3D）。
  4. 将晶体放置在距离毛细管一端不小于 13.5 mm 且不大于 27.5 mm 的位置；该端将作为挂载端（补充图 6）。
  5. 使用细长的移液器吸头吸除晶体周围的缓冲液，使晶体保持微湿状态。切勿触碰晶体（补充图 7A）。
  6. 用细纸条吸干毛细管内壁的液体（补充图 7B）。
  7. 将 20–50 μL 氘代缓冲液加入毛细管的另一端（即非挂载端）（图 4A）。
  8. 使用加热“棒”熔化蜂蜡，并将毛细管轻轻插入熔融的蜂蜡中。重复此操作，直至形成气密性密封（图 4B 和 图 4C）。
  9. 在毛细管的挂载端加入极少量氘代缓冲液（约 5 μL），作为热蜂蜡的“散热介质”。将该端浸入熔融蜂蜡中，按前述方法形成气密性密封，最终使毛细管两端均被密封（图 4D）。
  10. 挂载完成后，使用显微镜检查晶体，确保其密封性（图 4E）。
  11. 将已挂载的晶体小心地用 Kim 擦拭纸固定于容器（如 15 ml Falcon 管或培养皿）中，并在晶体生长温度下水平存放（图 4F）。

5. 蒸气交换

  1. 晶体安装后两天，用新鲜缓冲液替换重水缓冲液。
  2. 用加热环熔化距离晶体最远的石蜡密封处，并使用移液器和滤纸灯芯去除缓冲液。
  3. 向毛细管中重新加入 20–50 μL 重水缓冲液溶液，并用石蜡密封。
  4. 每隔四天再重复两次重水缓冲液更换，以确保重水缓冲液的蒸汽交换完全，并至少继续进行蒸汽交换两周。

6. 中子蛋白质衍射

注意：对 IMAGINE 光束线具体细节感兴趣的读者可参考 Meilleur 等人 2013 年及 Meilleur 等人 2018 年的研究10,47。

  1. 在 HFIR 的 IMAGINE 光束线进行室温数据采集
    1. 样品安装
      1. 用橡皮泥将毛细管固定的晶体固定在测角仪上。
      2. 将测角仪安装在样品杆上，并使用离线对准站将晶体在光束中居中。
      3. 将样品杆固定在仪器样品台（补充图 1B）。
      4. 确保实验舱已清空，并打开光束线快门以进行中子数据采集。
    2. 数据采集
      1. 在光束线控制计算机上打开数据采集程序，点击 Setup 选项卡以设置数据采集策略。在 Experiment Parameters 下，在 Sample Name 旁输入样品名称，在 Proposal 旁输入项目编号。在 Image Naming 下选择 Folder template，设置采集数据的保存路径，选择 Image Prefix 并输入相应的帧名称（补充图 8）。
      2. 打开 Optics 图形用户界面，点击 2.78 设置 λmin，点击 4.78 设置 λmax，以设定用于数据采集的准劳厄范围（补充图 9）。
      3. 切换到 Collect 选项卡，在 Next Scan Parameters 下，在 Exposure 中输入曝光时间（秒），在 N Frames 中输入帧数，在 Δ ϕ/Frame 中输入数据采集角度。在 Image Prefix 下命名待采集帧，并点击 Start Scan 按钮启动数据采集（补充图 10）。
      4. 衍射中子将由成像板探测器检测。每次曝光结束后，成像板将被读取，衍射图样将显示在数据采集图形用户界面上（补充图 11）。
      5. 帧数据由负责的光束线科学家使用 Lauegen、Lscale50 和 Scala 进行指标化、积分、波长归一化和缩放处理，数据采集完成后将向用户提供合并后的反射文件（补充图 12）。
        注：IMAGINE 和 MaNDi 光束线的数据采集均以准劳厄模式进行，采用 Helliwell 等人48 和 Nieh 等人49 开发的劳厄衍射数据采集方法与软件。
      6. 在完成中子衍射数据采集后，对同一晶体在相同温度下采集相应的 X 射线数据集（补充图 13）。
        注：也可使用同一液滴或相同结晶条件下生长的晶体采集 X 射线衍射数据，用于联合中子/X 射线结构精修。
  2. 在 SNS 的 MaNDi 光束线进行低温数据采集
    注：对光束线具体细节感兴趣的读者可参考 Coates 等人（2015）、Meilleur 等人 201810,11。
    1. 样品安装
      1. 配制用于晶体还原的氘代抗坏血酸浸泡溶液和氘代冷冻保护剂。将每种溶液各取 20 μL 滴入结晶板的坐滴孔中。
        注：冷冻保护剂溶液通常为在 D2O 中配制、已证明适用于低温 X 射线衍射数据采集的冷冻保护剂。如有需要，可进一步优化其浓度等参数以适应中子数据采集。
      2. 选择用于样品安装的环，并按照 MaNDi 指南将其连接至磁性低温基座（补充图 14）。
      3. 在泡沫低温杜瓦中装入液氮。将金属低温保护套浸入液氮中冷却（补充图 15A）。
      4. 从毛细管两端移除石蜡塞，轻敲毛细管使缓冲液塞移动，使固定晶体浸入缓冲液中。将晶体冲洗至坐滴孔中的 20 μL 储液滴中（补充图 15B 和 补充图 15C）。
        注：若已通过将结晶液滴与氘代缓冲液平衡或直接将晶体浸泡于氘代缓冲液中完成 H/D 交换，则此步骤非必需。
      5. 将晶体浸入抗坏血酸浸泡溶液中两小时。将晶体装入连接至磁性低温基座的微环中。将装好的晶体浸入冷冻保护剂中 10 秒，然后迅速将晶体和低温夹具浸入液氮中冷冻（补充图 15D）。
      6. 晶体冷冻后，使用预冷的低温针钳将其安装到配备低温气流的 MaNDi 样品台上。轻轻松开低温针钳，确保晶体保持在低温气流中（补充图 2C）。
    2. 数据采集
      1. 打开数据采集软件，实验信息将自动填充。
      2. 点击晶体中心，通过计算机控制的测角仪将其居中（补充图 16）。
      3. 在 Table 下，通过在“phi”中输入数据采集角度，以及在 Value 中输入每帧的总中子束曝光量，设置数据采集策略（补充图 17）。
      4. 点击 Submit 开始数据采集。
      5. 数据采集过程中，衍射中子将可见（补充图 17）。随着曝光时间增加，衍射斑点将变得更加清晰，信噪比提高（图 5）。
      6. 帧数据将由负责的光束线科学家使用 Mantid 和 Lauenorm 进行指标化、积分、波长归一化和缩放处理，数据采集完成后将向用户提供合并后的强度文件51。

7. 结构精修

  1. 联合X射线与中子数据精修
    1. 结构准备
      1. 使用 phenix.refine 软件包和 Coot 进行手动建模，精修X射线数据以获得蛋白质结构，从而得到完整的结构。
      2. 打开 CCP4，选择 Convert to/modify/extend MTZ 程序，将中子数据的R-free数据标志与X射线数据的标志匹配。选择以 MTZ 格式导入反射文件。在 In 下上传获得的中子MTZ文件，并在 Import FreeR MTZ 下上传X射线MTZ文件（补充图18）。在 Out 下为新MTZ文件命名，然后点击 Run。
      3. 打开 Phenix 软件包，点击“精修工具”下的 ReadySet。在 PDB文件 旁上传经X射线数据精修后的PDB坐标文件。选择 若模型中缺失则添加氢原子，并在下拉菜单中选择 可交换位点为H/D，其余位置为H。选择 向溶剂分子添加氘原子，其余选项保持默认值（补充图19A）。
        注：若使用全氘代蛋白质，请选择 若模型中缺失则添加氢原子，并在下拉菜单中选择 可交换位点为H/D，其余位置为D。
    2. 结构精修
      1. 在 精修 选项卡下打开 phenix.refine 程序，设置使用X射线和中子数据的联合精修。在 配置 选项卡的 输入文件 中，输入经ReadySet处理的X射线结构PDB文件，以及相关配体所需的CIF约束文件。上传使用CCP4分配了Rfree标志的中子MTZ文件，并在 数据类型 标题下将其指定为“中子数据”和“中子R-free”。上传X射线MTZ文件，并在 数据类型 标题下将其指定为“X射线数据”和“X射线R-free”。上传数据后，空间群 和 数据标签 将自动填充（补充图19B）。
        注：进行精修并输入晶体信息时，应使用X射线数据确定的晶胞参数。
      2. 在 配置 选项卡的 精修设置 中保持标准精修策略。将循环次数增加至五次（补充图20）。
      3. 选择 所有参数，点击 高级，然后选择 氢原子…。将 氢原子精修模型 更改为 独立，并关闭 强制riding adp（补充图20）。
      4. 选择 所有参数，打开 搜索参数 选项。搜索关键词 核，并选择 对X-H/D使用核间距（补充图20）。
      5. 点击 运行 以启动精修。
    3. 模型构建
      1. 在Phenix中完成精修后，点击 结果 选项卡中的 在Coot中打开，以可视化X射线电子密度图和中子SLD图。点击 显示管理器 选项卡，在 图谱 下点击 删除图谱 以移除 _neutron 图谱（补充图21）。点击 文件 > 打开MTZ、mmCIF fcf或phs…。选择当前精修文件并打开.mtz文件。在 振幅 和 相位 选项中，均从下拉菜单中选择 2FOFCWT_no_fill_neutron 数据。重复此操作，打开 FOFCWT_neutron 数据。打开 显示管理器，将中子和X射线的2FOFCWT图谱切换为 滚动，然后滚动以将2FOFCWT图谱的rmsd降低至1.00（补充图21）。将中子和X射线的FOFCWT图谱切换为 滚动，然后滚动以将FOFCWT图谱的rmsd降低至3.00。
      2. 对残基进行目视检查，以确定模型是否与数据吻合。通过分析差值密度图的峰值，确定所有可交换位点的正确取向和H/D占据率。这包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；组氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和赖氨酸的氮原子；半胱氨酸的巯基；天冬氨酸和谷氨酸的羧基；主链酰胺基团；配体；辅因子以及任何可能的功能化残基（图6）。
      3. 根据中子密度和氢键相互作用，使用 旋转平移区域/链/分子 功能旋转水分子以重新取向（补充图22A 和 补充图22B）。使用 编辑Chi角 工具和 旋转平移区域/链/分子 功能调整蛋白质残基H/D可交换位点的位置（补充图22C 和 补充图22D）。
  2. 结构精修——仅中子数据精修
    1. 结构准备
      1. 打开Phenix，选择“分子置换”，然后选择“Phaser-MR（完整功能）”，通过分子置换法推导仪器科学家提供的缩放强度的相位，生成起始的pdb格式坐标文件。在“输入与通用选项”选项卡中输入起始pdb结构，并完成 集合、非对称单元内容 和 搜索流程 选项。
      2. 打开 模型工具，选择 PDB工具。将pdb文件作为 输入文件 插入。进入 选项 选项卡，在 移除原子选择 下选择溶剂、配体、辅因子和金属的名称。这将移除所有水分子、辅因子、配体和金属离子，生成一个最小模型。此外，选择从模型中 移除交替构象（补充图23）。
      3. 在Phenix中选择 精修，然后打开 ReadySet。在 PDB文件 旁输入编辑后的pdb坐标文件。选择 若模型中缺失则添加氢原子，并在 中子精修选项 的下拉菜单中选择 可交换位点为H/D，其余位置为H（补充图23）。
    2. 结构精修
      1. 在Phenix的 精修 选项卡下打开 phenix.refine 程序。在 配置 选项卡的 输入文件 框中输入经ReadySet处理的PDB文件。在 输入文件 框中上传中子数据的MTZ文件，并在 数据类型 列中将其指定为X射线数据和X射线R-free，尽管实际为中子数据。下一步设置的精修配置将用于将反射文件作为中子数据处理。上传数据后，空间群和数据标签将自动填充（补充图24A）。
      2. 在 配置 选项卡的 精修设置 中保持标准精修策略。将循环次数增加至五次。在 其他选项 下，从 散射表 下拉菜单中选择 中子。取消选择 更新水分子 选项（补充图24B）。
      3. 选择 所有参数>高级>氢原子。在新窗口中，从 氢原子精修模型 下拉菜单中选择 独立，并关闭 强制riding adp（补充图20）。
      4. 选择 所有参数 > 搜索参数… 选项。搜索关键词 核，并选择 对X-H/D使用核间距（补充图20）。
      5. 选择 运行 以启动精修。
        注：初始精修后，需目视检查中子SLD图并在Coot中进行手动模型构建。可能需要插入模型中存在的配体/辅因子。后续精修将需要相关配体的CIF约束文件，这些文件应在 phenix.refine 的 配置 选项卡中上传。
    3. 模型构建
      1. 在Phenix中完成精修后，点击 结果 选项卡中的 在Coot中打开，以可视化中子SLD图和结构。点击 显示管理器 选项卡，在 图谱 下点击 删除图谱 以删除2FOFCWT和FOFCWT图谱（补充图25）。点击 文件 > 打开MTZ、mmCIF fcf或phs…。选择当前精修文件夹并选择.mtz文件。在 振幅 和 相位 选项中，均从下拉菜单中选择 2FOFCWT_no_fill 数据。再次点击 文件 > 打开MTZ、mmCIF fcf或phs…，并在 振幅 和 相位 选项中均选择 FOFCWT 数据。打开 显示管理器，将2FOFCWT_no_fill图谱切换为 滚动，然后滚动以将2FOFCWT_no_fill数据的rmsd降低至1.00（补充图25）。将FOFCWT图谱切换为 滚动，然后滚动以将FOFCWT数据的rmsd降低至3.00。
      2. 对蛋白质结构进行目视检查，以确定模型是否与中子SLD图吻合。
      3. 如 7.1.3.2 所述，确定具有H/D可交换位点的残基和基团的正确取向和H/D占据率。使用 旋转平移 工具和 编辑Chi角 调整残基位置（图6）。如有必要，可使用 实空间精修区域。通过文本编辑器手动插入正确的原子坐标，以修复从残基“爆裂”的D原子。
        注：实空间精修区域 在Coot中未针对中子SLD图优化，可能导致与D原子结合的原子出现不规则键长，即“爆裂残基”（补充图26）。建议手动编辑必要的原子坐标，避免使用 实空间精修区域。
      4. 根据中子密度插入并重新取向水分子。在Coot中添加水分子时，选择 在指针处放置原子 图标，并选择插入水分子（补充图27A）。Coot将默认在此位置插入一个O原子。
      5. 要为Coot中插入的水分子的O原子添加D原子，请使用Phenix。打开 精修 菜单，点击 ReadySet。在 中子精修选项 旁，仅选择 向溶剂分子添加氘原子。取消选择 若模型中缺失则添加氢原子（补充图27B 和 补充图27C）。
        注：仅使用中子数据的模型构建与联合X射线/中子结构的模型构建不同，因为没有X射线数据来辅助主链和重原子坐标的精修。在联合精修中，首先使用电子密度图确定蛋白质主链和侧链坐标，然后在联合X射线/中子数据精修中，从中子SLD图推导H/D原子的取向和占据率。而在仅中子精修中，整个结构均从中子SLD图分析得出，需构建水分子、主链、侧链、配体以及H/D原子（图6）。仅基于中子数据的精修中，数据与参数比值较低，应谨慎避免过度拟合数据。

结果

在室温下，使用 HFIR 上的 IMAGINE 仪器，以及在低温条件下使用 SNS 上的 MaNDi 仪器，按照上述方案收集了来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的裂解性多糖单加氧酶（NcLPMO9D）晶体的中子衍射数据。实验所用晶体为在基于 H2O 的缓冲液中生长的氘化蛋白质晶体，体积大于 0.1 mm3（大尺寸晶体的示例见补充图4及后续图示）。晶体被装载于石英毛细管中，并在数据收集前用基于 D2O 的缓冲液进行为期三周的蒸气交换处理（图4）。

在 IMAGINE 光束线上进行了室温数据采集（图1）。历时四小时的白光束测试产生了高分辨率衍射数据，表明晶体尺寸和质量均适合进行完整数据集的采集。除了提供晶体衍射质量的初步信息外，初始宽通带曝光还可用于指标化衍射图样并确定晶体取向矩阵。鉴于该晶体属于 P21 空间群，实验采用共18帧、每帧采集时间为20小时的数据采集策略。与X射线衍射数据采集类似，对称性更高的空间群需要更少的帧数（即更小的角度覆盖范围）即可收集完整的数据集。数据以准拉厄（quasi-Laue）模式采集，波长范围为 2.8 – 4.0 Å。数据采集完成后，对数据进行了指标化、积分、标定与合并，最终得到分辨率为 2.14 Å 的中子散射长度密度（SLD）MTZ 格式文件。数据质量评估遵循与X射线数据分析相似的标准，但由于中子蛋白质衍射是一种通量受限的技术，因此数据完整性达到80%且CC1/2不低于0.3即被视为可接受。

在室温中子衍射数据收集完成后，使用同一颗晶体在1.90 Å分辨率下收集了室温X射线衍射数据集（补充图13）。X射线数据用于确定C、N、O和S等“较重”原子的位置。将仅基于X射线数据精修得到的结构作为初始模型，进一步对X射线和中子数据进行联合精修。使用Phenix ReadySet在非可交换位点添加H原子，在可交换位点添加H和D原子，并向初始X射线模型中的水分子添加D原子。完成模型准备后，对两个数据集进行了迭代精修（补充图19和补充图20）。在Coot中通过目视检查电子密度图，进行交互式模型构建，以正确取向侧链和水分子（补充图22）。中子数据主要用于确定质子化状态和水分子的取向。丝氨酸和色氨酸等残基的电子密度图与其相应的中子散射长度密度（SLD）图的比较表明，中子蛋白质衍射可提供有关H/D可交换位点质子化状态的信息（图7）。水分子的电子密度图与中子SLD图叠加显示，尽管氢键相互作用可从X射线数据中推断，但中子数据能明确提供这些氢键取向的信息（图8）。生成了中子SLD FO-FC omit图，用于确定侧链的质子化状态及H/D取向。图中展示了酪氨酸和苏氨酸残基的中子SLD图，其中中子Fo-FC omit图清晰显示出正峰，表明H/D的存在（图9）。所收集的中子衍射数据还提供了关于多种质子化状态的有价值信息，例如Lys的-ND3+基团（图10）。在模型优化过程中密切监控精修统计参数（Rwork和Rfree），以防止过度拟合。最终的统计结果显示，X射线Rwork为12.77%，Rfree为18.21%；中子Rwork为14.48%，Rfree为21.41%，共包含389个水分子（Supplementary Figure 28）。

在MaNDi光束线上，对经抗坏血酸浸泡以将铜活性位点从CuII还原为CuI的NcLPMO9D进行了低温温度数据收集（补充图2和补充图15）45。数据收集前先采用4小时曝光进行中子衍射测试，以验证衍射质量，随后在飞行时间（TOF）劳厄模式下进行数据收集。根据晶体的空间群，设计了共18帧、每帧收集剂量为80库仑的数据收集策略。数据在波长范围2.0–4.0 Å的TOF-劳厄模式下收集。数据收集完成后，对数据进行了指标化、积分、标度和合并，最终得到分辨率为2.40 Å的MTZ格式反射文件51,52。

数据收集完成后，2.40 Å的低温 NcLPMO9D 中子衍射数据集用于仅中子数据的精修。中子数据通过分子置换法进行相位确定，以 PDB 5TKH 作为初始模型。使用 Phenix ReadySet 在非可交换位点添加氢原子，并在可交换位点添加具有部分占据率的氢/氘原子。使用 PDB Tools 从初始模型中移除水分子。补充图23）。模型制备随后通过优化处理 phenix.refine 使用中子散射台补充图24）。在 Coot 中进行交互式模型构建，并利用 FO- Fc 并根据潜在的氢键相互作用进行定位图11A 和 图11B）。在分析中子散射长度密度（SLD）图谱时，若水分子排列高度有序，则可清晰可见；但若其有序度不高，则其密度可能呈现球形或椭球形。图11C-E）。中子散射长度密度（SLD）图提供了有关残基取向的宝贵信息，例如天冬酰胺，当仅使用X射线衍射数据时，区分其羰基与氨基基团可能具有挑战性（图12A 和 图12B）。F 中的峰O- FC 中子散射长度密度省略图在确定组氨酸残基在N端的质子化状态方面也极具信息价值δ- 或 Nε-位置（图12C 和 图12D）。利用中子散射长度密度（SLD）图也可确定具有多个可交换氢/氘位点的残基的质子化状态。这一点在FO- FC 精氨酸的中子散射长度密度（SLD）省略图，已知其带有正电荷（图12E 和 图12F）。与之前相同，通过监测R值来防止过拟合工作 和 R自由最终统计结果给出的 R工作 22.58% 和 R自由 30.84%补充图29）。鉴于中子蛋白质衍射是一种通量受限的技术，必须考虑氢（H）的负散射长度和较大的非相干散射因子，因此可以预期，仅使用中子数据的精修结果在统计学上将劣于联合X射线与中子数据的精修，且可见的水分子数量较少（补充图28 和 补充图29).

在分析中子散射长度密度（SLD）图时，会明显发现由于氢（H）的中子散射长度为负值，经过与含D2O的结晶缓冲液进行蒸气交换处理的氢化蛋白质会出现密度抵消现象。正因如此，当与对应的电子密度图相比时，含有与碳相连的不可交换氢原子的中子SLD图会显得不完整（图13A）。这种抵消效应在分辨率较低时通常更为明显，因此获得高质量的蛋白质晶体至关重要。因此，最好对同一样品同时使用X射线和中子数据进行联合精修，其中X射线数据可用于确定蛋白质主链的位置（图13B）。此外，半胱氨酸和甲硫氨酸中的硫原子可能在中子SLD图中可见度较差，需借助X射线数据来精确定位原子位置（图13C 和 图13D）。对于中子散射长度较弱的金属元素，在中子SLD图中建模也可能具有挑战性，这在我们的LPMO9D图中已有体现。因此，在同一晶体上收集一套低剂量（无辐射损伤）的X射线数据非常有用，因为它可以通过电子密度图实现金属原子的定位（图13E 和 图13F）。

显示从蛋白质生产到结构完成各阶段的蛋白质晶体学工作流程示意图。
图1：中子蛋白质晶体学工作流程图。蛋白质生产。 为了获得中子结构，首先需要表达蛋白质。通常使用基于H2O或D2O的培养基进行细菌表达，分别用于高效生产含氢或全氘代的重组蛋白。蛋白质在基于H2O的缓冲液中纯化，随后在基于H2O或D2O的结晶缓冲液中结晶，以生长出至少0.1 mm3大小的晶体。样品制备： 在进行中子衍射数据收集之前，基于H2O生长的晶体需进行H/D交换，将蛋白质中可滴定的H原子替换为D。H/D交换可通过将晶体直接浸泡在氘代结晶缓冲液中、将结晶液滴与基于D2O的储液槽平衡，或将晶体装入石英毛细管中通过蒸气扩散与氘代结晶缓冲液交换来实现。中子数据收集： 完成H/D交换后，需对候选晶体进行筛选，以评估其衍射质量。分辨率达到2.5 Å或更高的晶体被认为适合进行完整数据集的收集。晶体可装入石英毛细管中在室温下进行数据收集，或使用冷冻环快速冷冻后在低温下收集数据。在同一温度条件下，需对同一（或相同）晶体收集一套X射线数据集。模型构建： 使用phenix.refine程序，同时或单独依据中子数据和X射线数据进行结构精修。蛋白质结构的手动模型构建在Coot软件中利用中子散射长度密度（SLD）图完成。完整结构： 蛋白质结构构建完成后，坐标模型需经过验证并提交至蛋白质数据库（Protein Data Bank）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于观察结晶的显微镜装置；包括用于分析的放大样品。
图 2：蛋白晶体的收获。（A）在显微镜下操作晶体。（B）打开装有硅化玻璃板的密封三明治盒。用移液器将储液缓冲液滴加到硅化玻璃载片上。（C）使用微环捞取晶体。（D）将晶体置于一滴母液中，以洗去常与晶体一同收获的杂质。 请点击此处查看该图的放大版本。

晶体转移过程；填充毛细管、晶体装载、毛细管视图、溶液运输。
图 3：将晶体转移至石英毛细管。（A）石英毛细管末端填充有储液缓冲液。（B）将晶体转移至石英毛细管中，并（C）浸入储液缓冲液中。（D）利用储液缓冲液将晶体沿毛细管向下输送。请点击此处查看该图的放大版本。

结晶装置；毛细管与石蜡封口法；实验步骤；显微镜下的晶体图像
图 4：石英毛细管的密封。（A）在毛细管末端加入氘代缓冲液以形成“液塞”。（B）使用“加热棒”熔化石蜡。（C）将毛细管浸入熔化的石蜡中进行密封。（D）在毛细管两端形成石蜡塞以完成密封。（E）晶体安装后的状态。（F）将密封好的毛细管置于培养皿中，并用橡皮泥固定。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光数据、时间依赖性、光学发射分析、1-16小时；图像序列示意图。
图5：中子衍射图样信噪比的提高。随着数据收集的进行，衍射斑点的强度逐渐增强。（注：此处展示的实时衍射图像仅用于说明，且来自不同的晶体。）请点击此处查看该图的放大版本。

中子散射长度密度图，调整丝氨酸和色氨酸位置，蛋白质结构分析。
图6：在Coot中利用中子数据进行交互式模型构建。（A）正的FO-FC中子散射长度密度峰（绿色），表明需要通过调整二面角来重新定向丝氨酸。2FO-FC中子散射长度密度图以紫色显示，2FO-FC电子密度图以蓝色显示。（B）正确放置的丝氨酸。（C）正负FO-FC中子散射长度密度峰（分别为绿色和红色），表明色氨酸需要旋转或平移以匹配差值密度峰。（D）正确取向的色氨酸。请点击此处查看该图的放大版本。

电子密度与中子散射长度密度图、示意图、丝氨酸/色氨酸鉴定、结构分析。
图 7：中子散射长度密度图提供的额外信息。（A）2FO-FC 电子密度图（蓝色）显示了丝氨酸中“较重”原子的位置。（B）2FO-FC 中子散射长度密度图（紫色）清晰地显示了丝氨酸中“较轻”的 D 原子的位置。（C）2FO-FC 电子密度图（蓝色）显示了色氨酸中“较重”原子的位置。（D）2FO-FC 中子散射长度密度图（紫色）清晰地显示了色氨酸中“较轻”的 D 原子的位置。请点击此处查看此图的放大版本。

电子和中子图谱；示意图显示电子密度、中子散射长度密度（SLD）以及结构分析的叠加图。
图 8：水分子的定位。（A）水分子的 2FO-FC 电子密度图（蓝色）呈球形特征。（B）2FO-FC 中子 SLD 图（紫色）提供有关水分子取向和氢键相互作用的信息。（C）水分子的电子密度图与中子 SLD 图的叠加图。其中 2FO-FC 中子 SLD 图以紫色显示，2FO-FC 电子密度图以蓝色显示。请点击此处查看该图的放大版本。

电子密度与中子散射长度密度图；蛋白质结构中酪氨酸、苏氨酸分析示意图。
图9：中子散射长度密度 FO-FC 缺失图。 (A) FO-FC 中子散射长度密度图（绿色）清晰显示了酪氨酸残基的H/D取向。2FO-FC 中子散射长度密度图以紫色显示，2FO-FC 电子密度图以蓝色显示。(B) 具有正确H/D取向的酪氨酸残基。( C) FO-FC 中子散射长度密度图（绿色）清晰显示了苏氨酸残基的H/D取向。( D) 具有正确H/D取向的苏氨酸残基。 请点击此处查看该图的放大版本。

电子密度与中子散射长度密度图；蛋白质结构中的赖氨酸分析；示意图。
图10：通过中子散射长度密度图显示的多种质子化状态。（A）2FO-FC电子密度图（蓝色）仅能显示赖氨酸ε-铵基中氮原子的位置。（B-E）FO-FC中子散射长度密度缺失图（绿色）清晰地展示了带正电的-NH3基团。2FO-FC中子散射长度密度图以紫色显示，2FO-FC电子密度图以蓝色显示。（F）电子密度图与中子散射长度密度图的叠加。请点击此处查看该图的放大版本。

中子散射长度密度图，显示水分子在氢键中的位置；结构生物学分析。
图 11：中子散射长度密度图中水分子的呈现方式。（A）水分子的位置根据FO-FC中子散射长度密度图（绿色）及潜在氢键确定。2FO-FC中子散射长度密度图以紫色显示。（B）位置正确的水分子。（C-E）水分子的中子散射长度密度图因B因子和氢键相互作用不同而呈现的各种形态。请点击此处查看该图的放大版本。

显示天冬酰胺、组氨酸和精氨酸结构分析的中子散射长度密度图。
图12：中子散射长度密度图提供的氨基酸取向与质子化信息。（A）中子散射长度密度 FO-FC 图中的峰（绿色）表明天冬酰胺残基的取向不正确。2FO-FC 中子散射长度密度图以紫色显示，2FO-FC 电子密度图以蓝色显示。（B）正确取向的天冬酰胺的 2FO-FC 中子散射长度密度图（紫色）。（C）中子散射长度密度 FO-FC 图中的峰（绿色）表明组氨酸在 Nε 位点发生单质子化。（D）组氨酸 Nε 位点质子化的 2FO-FC 中子散射长度密度图（紫色）。（E）中子散射长度密度 FO-FC 缺失图中的峰（绿色）证实了精氨酸带正电荷。（F）带正电荷的精氨酸的 2FO-FC 中子散射长度密度图（紫色）。请点击此处查看此图的放大版本。

显示谷氨酸、硫、甲硫氨酸和铜分析的中子散射长度密度图和电子密度图。
图13：不连续的中子散射长度密度（SLD）图。（A）氢化并经过蒸气H/D交换的蛋白质的2FO-FC中子SLD图（紫色）。由于不可交换氢原子的负散射长度，谷氨酸在中子SLD图中表现出信号抵消现象。（B）叠加的2FO-FC电子密度图（蓝色）清晰地显示出谷氨酸的电子密度。（C）甲硫氨酸中的硫原子在2FO-FC中子SLD图（紫色）中可见性较差。（D）叠加的电子密度图清晰地显示出甲硫氨酸的密度。（E）金属原子（此处为铜）在中子2FO-FC SLD图（紫色）中可见性较差。（F）叠加的2FO-FC电子密度图（蓝色）清晰地显示出配位铜原子的密度。请点击此处查看该图的放大版本。

同位素相干散射长度 (fm)非相干散射长度 (fm)
1H-3.74125.274
2H6.6714.04
12C6.65110
14N9.372
16O5.8030
23Na3.633.59
24Mg5.660
31P5.130.2
32S2.8040
35Cl11.656.1
39K3.741.4
40Ca4.80
55Mn-3.731.79
56Fe9.940
63Cu6.430.22
64Zn5.220

表1：中子散射长度与非相干散射值。 改编自Sears，199216。

补充图1：高通量同位素反应堆上的IMAGINE仪器。（A）位于冷中子导管大厅中的IMAGINE仪器。（B）样品被安装在石英毛细管中，并用橡皮泥固定在测角仪上。样品台和探测器台闭合，以将晶体和圆柱形成像板置于中子束中。经国际晶体学联合会许可修改53。图像由橡树岭国家实验室Genevieve Martin提供许可。 请点击此处下载该图。

补充图2：散裂中子源的MaNDi仪器。（A）MaNDi Anger相机探测器阵列。经国际晶体学联合会许可转载11。（B）MaNDi可移动样品台。（C）在MaNDi处将样品装载于石英毛细管中，并安装在测角仪上用于室温数据采集。图片经橡树岭国家实验室Genevieve Martin许可提供。请点击此处下载该图。

补充图3：溶菌性多糖单加氧酶 NcLPMO9D的结构。 NcLPMO9D的铜活性位点位于一个平坦的多糖结合表面。铜离子由两个组氨酸残基以经典的“组氨酸支架”方式配位，此外还有一个轴向的酪氨酸残基参与配位。请点击此处下载该图。

补充图4：在坐滴结晶板中生长出足够体积的晶体。 （A）在9孔硅化玻璃板中通过坐滴法培养出的大晶体。（B 和 C）对晶体进行测量，以筛选出体积 > 0.1 mm3 的晶体。请点击此处下载该图。

补充图5：用于测定氘代缓冲液pH值的pH计设置。 使用前，将pH电极浸泡在D2O中。使用NaOD和DCl调节氘代缓冲液的pH值。 请点击此处下载该图。

补充图6：MaNDi样品安装指南。 常温数据采集时石英毛细管的最大尺寸及样品位置。
转载自：https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment 请点击此处下载该图。

补充图7：去除多余缓冲液。（A）使用微毛细管吸头从石英毛细管中吸除多余缓冲液。（B）用细纸芯吸走残留缓冲液，使毛细管完全干燥。请点击此处下载该图。

补充图8：数据采集图形用户界面。 用于数据采集的“实验参数”输入窗口。 请点击此处下载该图。

补充图9：光学图形用户界面（GUI）。 用于数据采集的准劳厄范围选择以及中子计数率的监测。请点击此处下载该图。

补充图10：在数据采集图形用户界面中进行数据采集。 曝光时间、采集帧数和角度在“采集”选项卡中设定。然后使用“开始扫描”启动数据采集。请点击此处下载该图。

补充图11：检测并显示的衍射中子。 在曝光时间结束时，中子敏感成像板探测器被读取，衍射图样在数据采集图形用户界面（GUI）中显示。请点击此处下载该图。

补充图12：中子衍射后的数据处理。 数据采集完成后，使用Lauegen、Lscale和Scala对衍射图像进行指标化、积分、波长归一化和缩放，以生成合并后的衍射点文件。 请点击此处下载该图。

补充图13：X射线数据收集。 使用安装有石英毛细管晶体的家用X射线发生器进行室温数据收集。 请点击此处下载该图。

补充图14：MaNDi冷冻数据收集的安装指南。 MaNDi进行冷冻数据收集时所用CrystalCaps的尺寸及针高。
转载自：https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment 请点击此处下载该图。

补充图15：用于冷冻中子衍射数据收集的快速冷冻。（A）晶体浸泡、使用微环捞取晶体，并在与低温兼容的容器（如泡沫杜瓦瓶）中用液氮快速冷冻的装置示意图。安装好的晶体可使用预冷的低温镊子直接转移至光束线上的低温测角仪上。（B）熔化石蜡密封以取出晶体。（C）将晶体冲洗至石英毛细管末端以便捞取。（D）晶体依次在抗坏血酸浸泡缓冲液和冷冻保护剂中浸泡，随后在液氮中快速冷冻。请点击此处下载该图。

补充图16：样品对准界面。 中子束中的晶体对准由蓝色十字表示，通过点击定位实现中心对准。请点击此处下载该图。

补充图17：用于数据采集的CSS图形用户界面。数据采集策略，包括曝光剂量和角度，已上传至CSS图形用户界面中。随着数据采集的进行，实时探测器上检测到的衍射中子将在上方面板中显示。请点击此处下载该图。

补充图18：在CCP4中匹配R-free标志。 中子数据的R-free标志与在同一晶体或相同晶体上收集的X射线数据的R-free标志进行匹配，用于联合精修。请点击此处下载该图。

补充图19：结构准备与精修。（A）使用Phenix ReadySet工具在可交换位点添加氢/氘双占位。（B）联合使用中子数据和X射线数据进行联合精修，初始输入模型则基于在同一晶体或相同晶体上收集的X射线数据集进行精修。请点击此处下载该图。

补充图20：精修参数设置的配置。 精修模型以及核间距均设置为联合X射线/中子衍射数据精修。 请点击此处下载该图。

补充图21：Coot模型构建的数据选择。 在Coot中打开包含X射线和未填充中子数据的phenix MTZ文件输出，以生成电子和中子散射长度密度（SLD）图，用于交互式模型构建。请点击此处下载该图。

补充图22：联合精修过程中在Coot中进行的交互式模型构建。（A）FO-FC中子散射长度密度（SLD）图中正（绿色）和负（红色）的密度峰，表明水分子需要通过旋转/平移重新定位。2FO-FC中子SLD图以紫色显示，2FO-FC电子密度图以蓝色显示。（B）正确放置的水分子。（C）FO-FC中子SLD图中正的密度峰（绿色）表明苏氨酸残基需要通过调整χ角进行旋转，以匹配差值密度峰。（D）正确取向的苏氨酸残基。请点击此处下载该图。

补充图23：仅中子数据精修的结构准备。起始坐标文件通过PDBTools去除水分子，并在可交换位点添加双H/D占据度，以进行后续精修。请点击此处下载该图。

补充图24：仅中子数据精修。（A）上传中子数据以及准备好的初始模型。（B）中子数据精修的设置使用中子散射表。 请点击此处下载该图。

补充图25：Coot模型构建的数据选择。 未填充的中子数据在Coot中打开，用于交互式模型构建。 请点击此处下载该图。

补充图26：氘代残基在Coot中的实空间精修。（A）正负FO-FC中子散射长度密度峰（分别为绿色和红色），表明精氨酸残基需要移动以适配FO-FC密度峰。2FO-FC中子散射长度密度图以紫色显示，2FO-FC电子密度图以蓝色显示。（B）使用实空间精修功能时，由于缺少Coot几何约束库，导致D原子“炸开”。（C）D原子未随残基其余原子一同移动。（D）可通过文本编辑器手动修正D原子位置。请点击此处下载该图。

补充图27：添加水分子。 （A）可通过人工方式将水分子添加到正的FO-FC中子散射长度密度（SLD）图中的密度峰（绿色）上。插入的水分子在Coot中最初以一个氧原子（O）表示。（B）使用Phenix ReadySet工具为水分子的氧原子添加氘原子（D）。（C）成功添加了氘代水分子。请点击此处下载该图。

补充图28：精修统计信息。 联合X射线/中子精修后的最终数据精修统计结果。请点击此处下载该图。

补充图29：精修统计结果。 仅使用中子数据进行最终数据精修后的统计结果。请点击此处下载该图。

讨论

中子蛋白质晶体学是一种高度敏感的技术，可用于探测蛋白质中的质子化状态和水分子的取向。这些信息有助于阐明蛋白质的催化机制，因为质子化状态的变化以及氢键相互作用通常在酶促化学反应中起核心作用10。尽管中子蛋白质晶体学是一种信息丰富的技术，但在计划开展中子衍射实验之前，仍需考虑若干因素，即：

  1. 数据收集对大尺寸蛋白质晶体的需求。
  2. 氢及其他元素（如金属离子）的散射特性。
  3. 使用氘代样品时，结构精修和模型构建软件的局限性。

中子蛋白质晶体学是一种受通量限制的技术。与X射线衍射数据相比，由于该技术固有的限制（通量受限、准拉乌埃法、波长较长），中子数据集通常表现出较高的R因子以及较低的完整性、冗余度和信噪比。单帧数据的采集通常需要12–18小时。实验的成功在很大程度上取决于样品的尺寸和质量，晶体尺寸一般需达到0.1 mm3 通常是最低要求3中子衍射需要制备大量蛋白质，以设置体积范围为10至800 μL的结晶液滴。根据晶体和样品参数，可使用体积计算器估算生长足够大晶体所需的最小体积（https://neutrons.ornl.gov/imagine）。目前最常用的方法是通过蒸汽扩散法生长大型晶体。3悬滴结晶法可在10–25 μL的大液滴中促进晶体生长，而使用市售的坐滴结晶装置可设置体积更大、最大约达50 μL的液滴。14,54硅化九孔玻璃板可用于制备体积高达800 μL的较大液滴。这些玻璃板可置于Hampton Research公司提供的商用“三明治盒”中。其他结晶技术包括批量结晶，其液滴尺寸受限于容器的容量。批量结晶实验的设置体积可从微升级别至毫升级别。55也可采用透析法进行结晶，其中蛋白质与沉淀剂通过透析达到平衡。 通过 透析膜，或沿沉淀剂浓度梯度进行对流扩散，或通过多孔塞（如琼脂糖）56,57接种是获得所需体积晶体的另一种替代方法。微接种和宏接种已成功用于大晶体的生长，包括大体积晶体的生长。 NcLPMO9D45了解蛋白质相图的一些知识，包括温度对溶解度的影响，有助于大晶体的生长。

在规划中子衍射实验时，优化蛋白质制备以在衍射数据收集中最大化信噪比至关重要7。为避免氢原子（H）引起的密度抵消和高强度非相干散射，可通过将H原子替换为其同位素氘（D）来改善中子散射长度密度（SLD）图谱，因为D具有正的相干散射长度和较低的非相干散射长度。为此，需将氢化蛋白质晶体与氘代结晶缓冲液进行气相交换，从而实现溶剂分子以及蛋白质中可交换、可滴定的H原子的H/D交换23。气相交换操作是将氢化晶体置于石英毛细管中，并加入基于D2O的 氘代结晶缓冲液“塞段”，该方法是一种高效且温和的技术，应用最为广泛14,23,35。该交换过程可能需要数周时间，且最好定期更换氘代缓冲液，以确保最大程度的H/D交换。此外，也可通过将晶体直接浸泡于氘代缓冲液中实现H/D交换。为避免晶体因暴露于D2O而受到应力影响，应逐步提高D2O:H2O比例完成浸泡过程58。除此之外，也可在氘代缓冲液中对氢化蛋白质进行结晶，以实现可交换H位点的H/D交换22,59。然而需要注意的是，基于D2O的缓冲液会影响蛋白质的溶解度，因此需要对已知的H2O体系条件进行进一步调整3,59。在某些情况下，基于D2O的缓冲液还可能导致晶体尺寸减小59。通过在氘代培养基中表达蛋白质，可实现可滴定H原子及碳键合H原子完全被D取代，从而获得全氘代样品20。全氘代样品所得的中子SLD图谱将显著改善，不再出现氢化样品对应的密度抵消现象。这对于表征蛋白质或辅因子中非可交换位点上的H/D分布具有重要意义。然而，全氘代蛋白质的表达成本高且产率低60。美国橡树岭国家实验室（ORNL）结构分子生物学中心（CSMB）为需要制备全氘代样品的用户提供氘代设施（https://www.ornl.gov/facility/csmb）。全氘代表达通常在1升规模的生物反应器中进行，可获得约50毫克纯化蛋白61。

在收集完中子衍射数据后，需进行精修和交互式模型构建。精修可使用多种软件套件完成，包括 phenix.refine、nCNS 或 SHELXL28,31,32,33。其中，Phenix 套件是最常用于中子衍射数据精修的软件，通常与 Coot 联合使用，后者用于根据中子散射长度密度（SLD）图手动构建模型34。尽管 Phenix 和 Coot 均支持中子衍射数据的处理，但它们可能缺乏处理中子数据特有特征及氘代样品所需的部分功能。例如，Coot 不包含针对氘代残基的几何优化参数，这可能导致模型构建过程中出现困难，因为“实空间精修”功能会导致残基结构“爆炸”（补充图26）62。该问题可通过为所有氘代残基生成约束文件来解决，但这一过程极为繁琐，且目前尚无公开可用的此类参数库。在 Phenix 中进行精修时，可交换的 H/D 位点初始占据率通常设为 H 和 D 各占 0.50。随着精修的进行，H 和 D 的占据率将根据中子 SLD 图进行优化。在交互式模型构建过程中，差值密度 Fo-Fc 图对于评估 H/D 占据率具有重要参考价值。这些图可用于判断哪些位点具有较高的 D 占据率，这在活性位点尤其重要，因为其质子化状态与催化功能密切相关63。然而，当 H:D 占据率接近 0.70:0.30 时，会出现难以判断的情况，此时中子 SLD 图中信号完全抵消64。还应注意，准劳厄中子数据集的完整性通常约为 80%，低于 X 射线衍射数据中常见的 ≥ 98%。因此，在 Phenix 中精修中子衍射数据时，缺失的观测振幅（Fo）会由模型计算补充，以完成反射列表，但这可能引入模型偏差。为避免此类潜在偏差，在交互式模型构建过程中应查看“无填充”（no_fill）图，而非“已填充”（filled）图。

用户可以选择对结构进行联合X射线/中子数据精修，或仅使用中子数据进行精修。观察中子散射长度密度（SLD）图时，特别是在较低分辨率下，可能会感到困惑，尤其是对于氢化蛋白质而言，尽管经过H/D气相交换，非可交换位点上的氢（H）仍然存在。这会导致中子密度图出现抵消现象，从而呈现出不连续的图谱假象。65,66收集相应的X射线数据集有利于在联合精修中补充这些抵消效应图13A 和 图13B通常采用联合精修策略，即利用X射线数据精修蛋白质主链坐标，同时利用中子衍射数据精修可交换位点上氢/氘原子的位置和占据率28由于在可交换位点引入H/D占据会增加精修参数的数量，因此与X射线数据联合精修也会提高数据点与参数的比例。联合精修需要在同一晶体或相同条件下培养的晶体上，在相同温度下收集相应的X射线数据集。对于在室温（300 K）下收集的中子衍射数据，应采用低剂量数据收集策略在室温下收集相应的X射线数据集，以限制辐射损伤。相比之下，全氘代样品由于不存在同等程度的H/D信号抵消，可提供更优且连续的中子散射长度密度（SLD）图。然而，某些元素（包括金属和硫）的中子散射长度导致它们在中子SLD图中可见性较差，即使蛋白质已经实现全氘代图13C-F)18如果需要对金属进行表征，最好采用X射线衍射进行联合精修，或结合光谱学技术以补充衍射实验。当中子数据集具有高分辨率，或使用了全氘代蛋白质时，通常可进行仅基于中子数据的精修。此外，若研究的蛋白质对辐射损伤高度敏感，则仅使用中子数据精修尤为有利，因为X射线解析的结构可能包含辐射诱导的人工假象。如果计划仅基于中子数据进行精修，必须确认相应的中子数据集具备足够的完整性和分辨率。

ORNL 提供两个用于收集中子衍射数据的设施：位于 HFIR 的 IMAGINE 光束线以及位于 SNS 的 MaNDi 光束线36,67。尽管这两种仪器均基于相似原理有效收集中子衍射数据集，但在申请机时前，应考虑每种仪器独特的技术参数。IMAGINE 收集准劳厄（quasi-Laue）数据，专为在晶胞尺寸达约 100 Å 的晶体上进行室温数据收集而优化。MaNDi 可用于在晶胞尺寸达约 300 Å 的晶体上，采用飞行时间-劳厄（TOF-Laue）方法收集室温和低温数据。在收集完整数据集之前，需对晶体进行测试，以评估所获得衍射图样的质量，该测试中晶体仅暴露于中子束下采集单帧数据。若晶体质量足够好，则将收集完整的中子衍射数据集，并进行指标化、积分、标度校正与合并，此过程类似于X射线数据处理。IMAGINE 使用 Lauegen 和 Lscale 软件，而 MaNDi 则采用 Mantid 软件包并应用三维轮廓拟合技术48,50,51,68,69,70。在任一设施注册成为用户的科研人员，最终将获得以 MTZ 或 HKL 格式提供的数据集，用于后续分析。

中子衍射是一种非破坏性、高灵敏度的技术，可用于探测生物大分子的质子化状态及氢键相互作用，尤其适用于光敏感蛋白和金属蛋白的研究。在应用该技术及处理数据时，需考虑若干关键因素。 在开展实验之前，其结果可能为理解目标蛋白的催化机制提供有价值的见解。中子蛋白晶体学可与计算、结构、生物化学及光谱学研究相互补充，成为生物学家表征生物大分子所用技术工具箱中有价值的工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

蛋白质表达、纯化和结晶实验在美国橡树岭国家实验室能源部生物与环境研究用户设施——结构分子生物学中心（CSMB）进行。中子衍射数据在美国橡树岭国家实验室散裂中子源（SNS）的BL-11B MaNDi束线上收集，该设施由美国能源部基础能源科学办公室科学用户设施部门资助。作者感谢Brendan Sullivan在数据处理方面的协助。X射线衍射数据在北卡罗来纳州立大学分子教育、技术与研究创新中心（METRIC）的设施上收集，该中心由北卡罗来纳州政府支持。GCS部分得到了南非国家研究基金会（NRF）以及橡树岭国家实验室研究生机会（GO!）项目的资助。FM得到了美国农业部NIFA哈奇基金211001的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸水纸尖，规格 #30-#40，长度 60 mmDiaDent/DiaVet218-292
毛细管蜡HamptonHR4-328
CCP4版本 7.0.077
锥形离心管（15 mL）CorningCLS430790
锥形离心管（50 mL）CorningCLS430828
Coot版本 0.8.9.2
CrystalCap ALSHamptonHR4-779
弯头镊子MitegenTW-CTF-1
氯化氘溶液，35 wt. % 溶于 D2O，≥99 atom % DSigma-Aldrich543047
重水，99.9 atom % DSigma-Aldrich151882
双厚度 MicroLoops 1000 µmMitegenM5-L18SP-1000
FiveEasy pH 计 F20-Std-KitMettler Toledo30266626
泡沫杜瓦瓶标准容器 800 mlSpearlabM-FD-800
四色固定用黏土HamptonHR4-326
HEPES，BioUltra 级，分子生物学用，≥99.5% (T)Sigma-Aldrich54457
配备 EIGER 4M 探测器的高通量旋转阳极 X 射线衍射仪Rigaku, Oxford Cryostream 和 DectrisXtaLAB Synergy-R实验室用 X 射线衍射仪
直型磁力棒MitegenM-R-1013198
微量加样器吸头，用于填充 Femtotips 及其他玻璃毛细管（仅供研究使用），0.5 – 20 µL，100 mm，浅灰色，192 个（2 架 × 96 个）Eppendorf930001007
微量离心管，容积 1.5 mLEppendorfZ606340
带透明盖的培养皿，直径 100 mmFischerbrandFB0875713
Phenix版本 1.14-3260
夹针钳，18 mmMitegenM-R-1013196
移液器，容积 0.1–2.5 μLEppendorf ResearchZ683779
移液器，容积 100–1000 μLEppendorf ResearchZ683825
移液器，容积 10–100 μLEppendorf ResearchZ683809
移液器，容积 20–200 μLEppendorf ResearchZ683817
聚乙二醇 BioXtra 级，平均分子量 3,350，粉末状Sigma-AldrichP4338
石英毛细管，内径 1.00 mm，长度 80 mmHamptonHR6-146薄壁毛细管
研究用体视显微镜系统OlympusSZX16
可重复使用 B3 型（SSRL/SAM 风格）测角仪底座MitegenGB-B3-R
圆形微型中空玻璃管（VitroTubes），透明熔融石英，内径 1.00 mm，长度 100 mmVitroComCV1012厚壁毛细管
带盖三明治盒HamptonHR3-132
硅化 9 孔玻璃板HamptonHR3-134
坐滴结晶板（24 大孔）MitegenXQ-P-24S-A
氘氧化钠溶液，40 wt. % 溶于 D2O，99 atom % DSigma-Aldrich176788
厚型硅化圆形盖玻片（22 mm × 0.96 mm）HamptonHR3-247
通用移液器吸头，0.1–10 µLVWR76322-528
通用移液器吸头，1–100 µLVWR76322-136
通用移液器吸头，100–1000 µLVWR76322-154
通用移液器吸头，20–200 µLVWR76322-150
通用移液器吸头，1–20 µLVWR76322-134
蜡笔HamptonHR4-342

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中子晶体学数据收集与处理在蛋白质结构中氢原子建模的应用
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