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构建用于光遗传学实验的简易多功能照明系统

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DOI：

10.3791/61914

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2021年1月12日

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1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

本文内容

摘要

本方案介绍了如何利用红光和远红光通过PhyB和PIF3控制基因表达来进行光遗传学实验。内容包括构建一个简单且灵活的照明系统的分步说明，该系统可实现通过计算机控制基因表达或其他光遗传学实验。

摘要

利用光来控制生物过程，已显著提高了研究人员操控多种生物过程的精确性和速度。光学控制为解析功能提供了前所未有的能力，并有望推动新型基因治疗的发展。然而，光遗传学实验需要具备空间、时间或强度控制能力的合适光源，而这往往是研究人员面临的技术瓶颈。本文详细介绍了如何构建一种低成本且多功能的LED照明系统，该系统可根据不同的现有光遗传学工具轻松进行定制。该系统可配置为手动或计算机控制，并可调节LED的光强。我们提供了图文并茂的分步指南，介绍电路的搭建、实现计算机控制以及LED组件的构造。为了便于设备组装，我们还讨论了一些基本的焊接技术，并解释了用于控制LED的电路原理。通过使用我们的开源用户界面，用户可在个人计算机（PC）或廉价平板电脑上自动实现光刺激的精确时序和脉冲控制。这种自动化功能使该系统适用于利用LED调控基因、信号通路及其他跨越较长时间尺度的细胞活动的实验。本实验方案无需使用者具备电子学方面的先验知识，即可完成所需部件的制作，或使用该照明系统开展光遗传学实验。

引言

光遗传学工具正变得无处不在，新的技术也在不断被开发，用于光学控制基因表达、细胞信号传导以及更多生物学过程1,2,3。利用光来控制细胞过程的能力，可实现快速的动力学响应、精确的空间控制以及剂量依赖性的调控，且这些调控可通过光照强度和照射时间加以控制。为了使用这些工具，必须具备能够调控这些参数的装置。我们近期开发了一种基因编码的PhyB-PIF3哺乳动物基因开关，该系统可分别利用红光/远红光可逆地激活和失活基因4。该系统已在多种哺乳动物细胞系中进行了测试，即使在极微弱光照条件下（包括脉冲光照）也能实现卓越的基因表达诱导效果。研究人员在使用PhyB开关及类似工具5,6时，常常需要了解如何控制光照强度和持续时间的方法。因此，我们制定了本实验方案，提供详细的分步操作说明，以促进这些光遗传学工具的广泛应用。

在LED广泛应用之前，研究人员使用带有滤光片的宽带光源来研究光响应蛋白，例如光敏色素7。近年来，一些与光遗传学工具同时发表的LED照明系统相继出现8,9,10,11,12，但这些方案可能需要研究人员具备较强的电子学或软件专业知识，或依赖专用设备（例如3D打印机、激光切割机或光刻掩模），且未提供某些研究人员在实际研究中所需的分步操作说明。虽然在多孔板中对各个孔进行独立控制在某些情况下具有优势，但当研究人员仅需比较明暗条件或红光与远红光下的不同样本时，这种独立控制通常并非必要。此外，许多现有的商用系统价格昂贵，且定制化能力有限。相比之下，本方案中描述的LED具有成本低、亮度高、安装方式多样等优点，因此可用于照射多种类型的样本。结合本方案提供的操作流程和软件，可使用从紫外（UV）到近红外（NIR）范围的各种LED，并通过软件控制，用于开展基于UVR813,14、Dronpa15,16、LOV结构域17,18、阶梯函数视蛋白19,20、CRY221,22、PhyB4,23,24,25、细菌光敏色素26,27,28,29以及其他光响应系统30,31,32的光遗传学实验。

本方案提供了用于组装光刺激实验所需电路及其他硬件的详细教程，涵盖对光刺激不同参数的控制，以及开展光遗传学实验所需的分子/细胞工具。此外，我们还报告了由 Kyriakakis 等人4优化的质粒，其尺寸更小、克隆稳定性更高。通过本方案，即使不具备电子学和光学专业知识的生物学家，也能构建出灵活且可靠的照明系统。我们以分步方式演示如何搭建 LED 系统，从而消除光遗传学工具广泛应用中的技术瓶颈。该系统可轻松用于大多数细胞培养孵箱，即使孵箱未配备穿线孔亦可使用。例如，我们将该 LED 系统持续置于加湿的 CO2 孵箱中超过 6 个月，性能未见下降。我们还说明了如何将 LED 系统连接至计算机，并与我们在 GitHub 上提供的开源软件进行交互（https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces）。采用本方案构建系统，可使研究人员掌握排查潜在问题、更换部件以及改进或扩展功能所需的基础知识。

系统概述

构建照明系统包括以下步骤：（1）构建电子电路，（2）构建外设（电源线、电源开关等），（3）构建LED灯，（4）组装所有这些组件，以及（5）安装用于通过用户界面控制LED的软件（图1A）。完成后，该照明系统可通过用户界面独立控制最多四个LED（图1B）。用户界面可使每个LED按指定时间间隔脉冲，并在设定时间后关闭。系统还设有启动延迟功能，可设定照明程序的开始时间。电位器（POT）可独立调节每个LED的强度，也可用于在无计算机情况下手动控制LED。连接LED的导线可为任意自定义长度，便于将其放置于培养箱或实验空间内。由于这些LED具有高功率，单个LED即可在一定距离外照亮较大区域。

LED驱动器说明

为了提供电源并控制LED的亮度，本方案将详细介绍构建“LED驱动器”的步骤。每个LED都有其特定的工作电压范围（图1C）。在运行过程中，可通过电位器调节稳压器的输出电压，从而控制光强。电位器（POT）通过改变电阻来调节输出电压/亮度。使用1kΩ（1千欧姆）电位器调节时，构成我们所称的“高压电路”，其电压调节范围为1.35 V至2.9 V。由于2.9 V对于低电压LED而言过高（图1C），我们展示了一种改进方法（电阻3或“R3”，见补充图1A），可将电压范围限制在与低电压LED匹配的水平。当R3与电位器并联时，可将施加到LED的最大电压降低至1.85 V（组装细节见补充图8）。通过使用电压而非电流来控制亮度，该系统能够更灵活地适配不同工作电压的LED。图1C列出了高电压和低电压LED的类型，以指导选择最合适的电路。该设计确保最小电压足够低，使电位器关闭时LED完全熄灭，同时防止电压超过LED的典型工作电压。在PhyB光遗传学实验中，我们使用深红光和远红光LED，这些LED采用低电压电路。

LED计算机控制系统说明

该LED照明系统可在不连接计算机或微控制器的情况下用于持续照明。然而，若需执行脉冲程序或控制单个LED的时序，则必须安装微控制器。为了使用微控制器控制LED，需要一个晶体管将微控制器连接至电路。该晶体管可感应微控制器输出的电压，并在导通与绝缘状态之间切换。为了控制“开启”和“关闭”，我们采用一种称为“NPN开关型晶体管”（2N2222）的元件，作为R2上的可控分流开关（补充图1A）。当微控制器的电压施加到晶体管基极时，晶体管变为导通状态，使LED电压降低，从而关闭LED。因此，LED与晶体管的开关状态均由微控制器直接控制，而微控制器则由安装在个人计算机（PC）上的软件进行调控。

构建照明系统需要完成以下步骤：搭建电路；搭建电源、手动电源开关、电位器（POTs）和微控制器连接；组装LED；准备一个黑色盒子以容纳整个照明系统；连接所有线路和设备；安装LED控制软件，用光刺激细胞；使用双荧光素酶报告基因检测法测定基因表达。

方案

1. 构建电路

注意：此处描述的是为一个可用的LED构建单个电路的方案。扩展至最多四个LED的说明包含在补充信息中。

  1. 打开烟雾吸收器和电烙铁。将水加入清洁海绵中，并准备好焊锡。
    警告：务必采取安全措施，以排除烟雾并防止烫伤。
  2. 按照补充图示中所示顺序，开始将电路元件焊接到印刷电路板（PCB板）上。
    注意：在烙铁头使用少量焊锡，先加热元件金属部分和PCB板，再将额外焊锡直接熔化到元件上；助焊剂可显著提高焊接效果。
  3. 焊接跳线和元件（补充图2 和 补充图3）。
    1. 对于跳线（连接电路板上两点的绝缘导线），从跳线套件中取两段导线：橙色 [7.6 mm (0.3 英寸)] 和黄色 [12 mm (0.4 英寸)] 各一段。
    2. 将PCB板夹在“辅助手”支架上，将跳线插入以下孔位，将端子弯折45度，并添加助焊剂（图2、补充图2 和 补充图3）：a1 和 a3 → 接地 (-)（橙色），a7 → 电源 (+) #7（黄色），d2 → d6（黄色）。
    3. 焊接后修剪导线背面。
    4. 将LM317T电压调节器插入以下孔位，弯折引脚并添加助焊剂（图2 和 补充图4）：Adj → e5，Vout → e6，Vin → e7。
    5. 先焊接左右两端并修剪，然后焊接并修剪中间引脚。
    6. 为设定电路的低电压范围，将一个820 Ω电阻完全插入c2 → c5孔位，焊接后修剪（图2 和 补充图5）。
    7. 为实现微控制器对LED的控制，将晶体管插入b3–b5（图2 和 补充图6）：集电极 → b3，基极 → b4，发射极 → b5。
      注意：注意晶体管的方向，确保正确插入；查阅规格书以确认集电极、基极和发射极的标识。
  4. 焊接用于电位器（POT）、LED、微控制器和电源的线对线连接器。
    注意：注意线对线连接器导线的颜色，以及使用的是公头还是母头线对线连接器。
    1. 确定所需LED需要“低压”电路还是“高压”电路（图1C）。
      注意：如果LED在“低压”列表中，则需要在电位器（POT）上并联一个电阻。
    2. 对于“低压”或“高压”电路，将母头线对线连接器的一根导线穿过a5孔（补充图7）。如果制作的是低压电路，暂时不要焊接。
      注意：将裸露的导线末端拧紧，防止细小线丝散开。如果导线过粗，难以穿过孔位而不散开，可剪除2–6股后再重新拧紧（补充图7B–D）。
    3. 如果制作“高压”电路，请跳至步骤1.4.5。如果制作“低压”电路，则将一个560Ω电阻穿过同一孔（a5），并与线对线连接器的引线一起焊接。
    4. 将电阻的另一端连接至接地端（补充图7G）。
    5. 将已焊接至a5孔的母头线对线连接器的另一端连接至接地端并进行焊接（补充图8A,B）。
    6. 对于微控制器连接，将一段公头线对线连接器的一端插入a4孔，另一端插入与接地端相连的孔位（补充图9A–C）。
    7. 对于LED连接，将一段母头线对线连接器的一端插入a2孔，另一端插入与接地端相连的孔位（补充图9D,E）。

2. 构建电源、手动电源开关、电位器和微控制器连接

  1. 构建电源。
    1. 从 a29 焊接一根橙色 [7.6 mm (0.3 英寸)] 跳线至接地端（补充图 10）。
    2. 从 a30 焊接一个母对母线对线连接器至电源正极（+）（补充图 11A–C）。
    3. 从 c29 至 c30 焊接一个公对公线对线连接器（补充图 11D–F）。
    4. 剪下电源线上的连接器，露出导线并剥去绝缘层（补充图 12A–C）。
    5. 使用助焊剂笔在焊接前向导线添加助焊剂（补充图 3G）。
    6. 将一段直径为 3.18 mm (1/8 英寸) 的热缩管套在公对公线对线连接器上，另将一段较粗的 4.76 mm (3/16 英寸) 热缩管套在电源线上（补充图 12D）。
    7. 将电源线与公对公线对线连接器的导线拧在一起并进行焊接（补充图 12E, 13A,B）。
    8. 将直径较小的热缩管（3.18 mm，1/8 英寸）套在连接处，并使用热风枪加热收缩（补充图 13C,D）。
    9. 将直径较大的热缩管（4.76 mm，3/16 英寸）套在已收缩的小热缩管外，再次加热使其收缩（补充图 13E,F）。
  2. 构建手动电源开关。
    1. 将直径为 3.18 mm (1/8 英寸) 的热缩管套在开关的导线上（补充图 14A）。
    2. 将公对公线对线连接器的导线拧在一起并焊接（补充图 14B,C）。
    3. 将直径为 3.18 mm (1/8 英寸) 的热缩管套在焊接部位，并使用热风枪加热收缩（补充图 14D,E）。
  3. 将公对公线对线连接器连接至电位器（POT）。
    1. 将线对线连接器的黑色导线绕接在电位器（POT）的中间端子上（补充图 15B）。
    2. 将绕接在端子上的导线紧密拧紧并焊接（补充图 15C）。
      注：可使用小型精密镊子辅助完成紧密缠绕。
    3. 参照 补充图 15D，对红色导线与端子的连接重复相同操作。
    4. 使用镊子折断红色箭头附近的金属片（补充图 15E,F）。
  4. 构建微控制器连接（仅适用于计算机控制的 LED）。
    1. 若制作用于多个 LED 的驱动器，则除一个母对母线对线连接器外，将其余所有连接器的黑色导线剪除（补充图 16A）。
    2. 按照图示对线对线连接器的端部进行压接（补充图 16B–D）。
    3. 将压接好的端部插入矩形连接器中（补充图 16E）。

3. 构建LED

  1. 剥去电线末端约 5 mm 的绝缘层，并使用助焊剂笔涂抹助焊剂，如 补充图 3G 所示。
    注意：为了高效地将导线焊接到 LED 底座上，必须在 LED 底座的触点和导线上添加助焊剂。
  2. 通过从下方加热导线并从上方添加焊料的方式对导线进行镀锡（补充图 17B）。
  3. 使用助焊剂笔将助焊剂涂在 LED 底座的表面触点上（补充图 17C）。
  4. 在较大的烙铁头（约 4–5 mm）上放置足量焊料（补充图 17D），用其加热 LED 底座上的触点（补充图 17E）。数秒后，将焊料拖过触点（补充图 17F）。在另一个触点上重复步骤 3.3–3.4（补充图 17G）。
    警告：焊接过程中 LED 底座可能变得非常烫。应将 LED 底座放置在不会熔化或烧毁的表面上。
  5. 使用鳄鱼夹将黑色导线夹在“C+”触点（阴极）上（补充图 18A）。
  6. 在大尺寸烙铁头上放置足量焊料（补充图 18B），然后将其压在导线上，直到 LED 底座上的焊料熔化（补充图 18C）。固定住导线（补充图 18D），在保持导线位置的同时移开电烙铁（补充图 18E）。
  7. 在用于连接 LED 的焊盘上涂抹少量焊膏（补充图 19A,B），然后使用镊子将 LED 放置在焊盘上（补充图 19C）。
    注意：如果位置略有偏差，无需担心；当焊膏熔化后，LED 会自动对齐。
  8. 将红色导线放在“A+”（阳极）上，并用鳄鱼夹夹紧（补充图 20A–C）。
  9. 在大尺寸烙铁头上放置足量焊料（补充图 20D），然后将其压在导线上，直到 LED 底座上的焊料以及 LED 下方的焊膏完全熔化（补充图 20E）。
    注意：焊膏熔化后，颜色会变为银白色（补充图 20H,I）。
  10. 根据所需装置选择合适的导线长度。剥去 LED 导线以及公对公线缆连接器的绝缘层（补充图 21A），然后按照 补充图 3G 所示添加助焊剂。
  11. 将热缩管套在导线上。在线对线连接器上使用 3.18 mm（1/8 英寸）热缩管，在导线上使用 4.76 mm（3/16 英寸）热缩管（补充图 21B）。
  12. 使用“辅助手”夹具夹住线对线连接器，将连接器端与导线拧在一起（补充图 21C），然后进行焊接。另一根导线同样操作（补充图 21D,E）。
  13. 将 3.18 mm（1/8 英寸）热缩管套在焊点上并加热收缩（补充图 21F–G）。
  14. 将 4.76 mm（3/16 英寸）热缩管套在已收缩的 3.18 mm（1/8 英寸）热缩管外，再次加热使其收缩（补充图 21H–I）。
  15. 使用带有下方垫有胶带的“辅助手”夹具夹住 LED 导线（补充图 22A）。
  16. 按照制造商说明混合环氧树脂，并将其涂覆在焊接好的 LED 顶部（补充图 22B）。静置过夜使其固化。
  17. 若使用魔术贴进行安装，可剪下一小块魔术贴（补充图 23A），并将其紧压在 LED 背面持续 30 秒。
  18. 使用高速旋转工具在黑色盒子的盖子上切出一个缺口（补充图 23C–E）。
  19. 通过磨砂膜构建单个 LED 的安装结构。
    1. 使用平头钻头在黑色盒子顶部钻一个直径为 1.75 cm（11/16 英寸）的孔，用于放置 LED（补充图 24A）。
    2. 使用高速旋转工具在孔的一侧切出一个缺口，以为 LED 导线留出空间，如 补充图 24A 所示。
    3. 裁剪一块 25–30 mm 的磨砂膜，并用胶带将其固定在黑色盒子内部，覆盖 LED 将要透光的孔洞（补充图 24A）。
    4. 将 LED 放置在黑色盒子外部的孔洞上方，确保磨砂膜和胶带已就位，并使用电工胶带固定（补充图 24B–E）。

4. 为照明系统配备一个黑色遮光箱

  1. 对于四 LED 系统，在盖子上钻四个直径为 0.83 cm（21/64 英寸）的孔，孔间距为 3.81 cm（1.5 英寸），用于安装电位器（补充图 25）。
  2. 使用高速旋转工具，在左上角切出一个 1.19 cm × 1.90 cm（0.47 英寸 × 0.75 英寸）的矩形孔（补充图 25）。
  3. 使用平头钻头，在黑色盒体上钻一个直径为 1.75 cm（11/16 英寸）的孔（补充图 26）。
  4. 修整孔的边缘，并将护线套插入步骤（补充图 26）中钻出的孔内。
  5. 对于计算机控制的 LED 系统，使用砂纸打磨单片机将要粘接的黑色盒体内部区域，以及单片机支架的底面。
  6. 先将单片机卡入支架中，再将支架固定在黑色盒体内，并用环氧树脂将其粘牢（补充图 27A）。
  7. 使用砂纸打磨两个卡扣的底部以及黑色盒体内将要放置电路板的区域，并用环氧树脂将卡扣固定在黑色盒体内（补充图 27A）。
  8. 将 PCB 板插入卡扣中固定（补充图 27B）。
  9. 将电源开关从盖子上的方形孔（补充图 25 中制作）中穿过，并卡入到位（补充图 28A）。
  10. 将电位器（POT）穿过盖子上的孔，旋紧固定（补充图 28A），并将旋钮安装到电位器上（补充图 28B）。

5. 连接所有线路和设备

  1. 标记线对线连接器（例如，LED、POT、COM）（补充图29A）。
  2. 将步骤2.4中制作好的压接连接器（补充图16）连接到两个母头连接器（POT和LED）之间的公头线对线连接器上（补充图7A和S37）。
  3. 将压接端插入微控制器（补充图30）。
  4. 将USB线穿过橡胶护套并插入微控制器。
  5. 将LED的导线穿过橡胶护套，并连接至微控制器连接端左侧的母头线对线连接器（补充图9D和38）。
  6. 将电源线穿过橡胶护套，并连接至PCB板右侧的公头线对线连接器（补充图11D）。
  7. 将电源开关的公头线对线连接器连接至PCB板右侧的母头线对线连接器（补充图11A）。
  8. 将盖板上电位器（POT）的公头线对线连接器连接至PCB板上的母头线对线连接器（补充图8和36）。
    注意：未连接电位器时，切勿开启电路。

6. 安装LED控制软件

注意：请参阅 GitHub 补充文件中的详细软件安装说明。https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. 下载并安装用于编程微控制器的软件
  2. 下载并安装包管理器
  3. 对微控制器进行编程
  4. 下载并安装运行时引擎
  5. 下载用户界面

7. 用光刺激细胞

  1. 转染 HEK293 细胞。
    1. 将 HEK293 细胞以每孔 100k 的密度接种至 24 孔板中。
    2. 参考示例表格计算无血清培养基、聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）和 DNA 的体积（补充图 39），并按照试剂生产商的说明书进行转染。
  2. 用光刺激细胞。
    注意：转染后细胞必须保持在黑暗环境中，或使用不会激活光遗传系统的光源进行操作。
    1. 确定将对细胞使用的刺激类型（持续光照、脉冲强度等）。
    2. 将电位器（POTs）调至关闭状态（逆时针旋转），然后打开 LED 电源。
    3. 将光强计置于黑色盒子内细胞将要放置的位置，盖上带有 LED 的盖子，根据需要调节光照强度。
    4. 若使用计算机控制 LED，请打开用户界面软件。
    5. 设置用户界面（图 5A,B）。
      1. 在左上方面板中，选择微控制器对应的 COM 端口，然后点击 连接。
      2. 使用右侧面板对每个 LED 进行编程。若需持续光照，请在“开启时间”中设置任意非零时间，并将“关闭时间”设为零。
      3. 在右下方面板中设置主定时控制。
        1. 如需延迟光照，可在“启动延迟”中设置延迟时间（HH:MM）。
        2. 如需在指定时间后关闭所有 LED，请在“运行时间”中设置时长（HH:MM）。
        3. 点击 运行 按钮（图 5A）以启动光照程序。

8. 使用双荧光素酶报告基因检测法测定基因表达

  1. 将10 mL荧光素酶缓冲液与荧光素酶试剂混合，配制荧光素酶试剂，并分装至1 mL离心管中，于-80 °C保存，可保存长达1年。
  2. 将5倍浓度的裂解缓冲液稀释为1倍浓度，每孔使用100 µL，用于N + 2个孔。例如，对于30个样品，使用30 × 20 µL的5X裂解缓冲液和30 × 80 µL的MQ H2O。
  3. 配制Renilla底物溶液：每1 mL Renilla缓冲液中加入20 µL Renilla底物（此用量适用于10个检测反应）。
  4. 从培养箱中取出细胞，吸除培养基，每孔加入100 µL 1x裂解缓冲液，置于100 RPM摇床上振荡15分钟。
  5. 置于-20 °C环境中至少1小时。
  6. 向白色96孔板的每个孔中加入100 µL荧光素酶试剂。
  7. 设置酶标仪用于检测发光信号。使用酶标仪的发光检测模块，设定积分时间为1秒。
  8. 将解冻后的裂解液加入荧光素酶试剂下方的孔中。使用多通道移液器将20 µL样品与荧光素酶试剂混合，并立即检测发光信号。
  9. 待读数达到平台期后，每孔加入100 µL Renilla底物溶液，再次进行扫描检测。
  10. 用荧光素酶信号除以Renilla信号，以校正转染效率。
  11. 比较经转染效率归一化后的荧光素酶信号（例如，比较红光照射与远红光照射样品的信号）。

结果

当电源电路、电源、电源开关、电位器（POTs）以及 LED 完成组装（至补充图21）后，即可对电路进行测试。在所有电位器安装到位后，可通过电位器调节 LED 的亮度。当组装完成至补充图29时，该系统即可手动用于光遗传学或其他应用。整个系统的电源可通过电源开关手动控制。每个 LED 的亮度可通过连接到对应电路的电位器独立调节。

安装软件并对微控制器进行编程后，用户界面即可与微控制器通信。通过用户界面，可采用多种方式对LED进行时间上的控制：（1）可设置每个LED保持开启的指定时长；（2）可设置每个LED进行脉冲式闪烁；（3）可设置全局启动延迟时间（例如，转染后24小时再开始光照）（图6B）；（4）可设置延迟结束后程序运行的总时长。本系统提供两种用户界面：一种具有较大的按钮，可同时控制两个LED；另一种可同时控制四个LED（图5A,B）。双LED用户界面针对平板设备进行了优化，对于多数实验中红光和远红光LED的控制已足够使用。

对于较大规模的实验，可使用第二个用户界面控制多达四个LED。在诱导基因表达时，预期结果取决于多个参数，包括诱导时间、诱导强度（如光照或药物剂量）以及细胞内可诱导表达元件的拷贝数。为展示这一点，我们共转染了PhyB基因开关以及不同量的报告基因DNA（pPK-202）（分别占转染总DNA的0.5%、1%、2%、4%和8%）图6A）并按照图示进行照射 图 6B. 在含有 PhyB 但无质粒产生藻蓝胆素（PCB-生色团）（即对光无响应）的样品中，荧光素酶基因表达/渗漏随报告基因 DNA 量的增加而升高图6C（远红光 P） < 0.0001，线性回归后接Wald检验），（红色P < 0.0001，经线性回归后进行Wald检验）。此外，当整个PhyB基因开关（包括产生PCB发色团的质粒（光敏细胞））暴露于远红光照射时，荧光素酶的表达也随着转染混合物中报告基因构建体含量的增加而上升（图6C，D（远红光 P < 0.0001，经线性回归后进行Wald检验）。类似地，当光敏细胞被红光照射时，随着报告基因量的增加，荧光素酶的表达也随之升高（P < 0.0001，经线性回归后进行Wald检验）。在比较红光处理细胞与远红光处理细胞的诱导水平时，我们发现随着报告基因量的增加，激活倍数略有下降（图6E（P = 0.0141，线性回归后接Wald检验）。

LED 电路组装流程；逐步构建、组件及兼容性表；实验设置。
图1：单个LED的基本电路。（A）流程图，概述构建LED照明系统所需的各个步骤。（B）LED照明控制系统。（左）用于调节LED亮度和时序的控制盒；（中）运行用户界面以控制LED的PC平板电脑；（右）用于安装LED并放置细胞以进行光学刺激的暗盒。（C）用于判断LED需要高压还是低压电路的对照表。请点击此处查看此图的放大版本。

晶体管电路组装指南；示意图；2N2222A、LM317T 在面包板上的放置位置，操作说明。
图2：将元器件焊接到位的操作说明。（A）构建电路的分步卡通示意图示例。（B,C）包含设备组装过程图片的操作说明示例。（D）同时组装多个电路的操作说明示例。请点击此处查看此图的放大版本。

带标签引脚和接线的电位器盒装置，用于电子控制，内部连接可见。
图3：组装完成的LED控制系统示意图。（A）组装系统顶部外部视图。（B）组装完成的四LED照明系统内部视图。请点击此处查看此图的放大版本。

半导体器件组装；显微放大图像；电子元件检测。
图 4：将 LED 重新熔焊至散热器的操作说明。（A）LED 底座及深红色 LED 的放大图。（B）将焊膏涂布至 LED 底座上的示意图。（C）焊接完成后的 LED 图像。红色箭头指示焊盘位置。与焊接前的灰色状态（A）相比，焊接后焊料呈现金属光泽/明亮外观。请点击此处查看此图的放大版本。

由Arduino控制的LED定时接口（A，B），实验室培养箱（C），光感受器信号示意图（D，E）
图5：用于控制光遗传学实验的软件。（A）一个带有大按钮的双LED用户界面，便于在低成本平板电脑上使用。（B）四LED用户界面。两个界面均支持对LED进行独立控制。在脉冲模式下，可对LED编程以设定特定的脉冲宽度和持续时间进行开关操作。脉冲还可设置启动延迟和预设的总运行时间。（C）安装在细胞培养箱上的LED控制平板。（D）远红光照射下PhyB基因系统的示意图。远红光使基因保持在“关闭”或“暗”状态。（E）红光照射下PhyB基因系统的示意图。红光通过促进PhyB与PIF3之间的相互作用来诱导基因表达。该相互作用使与PIF3融合的基因激活结构域（AD）定位于UAS启动子，从而激活报告基因。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光素酶报告基因实验；质粒图谱、转染时间线、表达图谱。
图6：使用LED系统调控PhyB的预期结果。（A）编码PhyB+PIF3双杂交伴侣蛋白的质粒（pPK-351）、编码藻蓝胆素（PCB-发色团）合成酶的质粒（pPK-352）以及荧光素酶报告质粒（pPK-202）。（B）C–E项实验的光照诱导时间线。（C）随着报告基因DNA用量增加的本底转录水平（即“泄漏”表达）。未共转染pPK-352的“泄漏”样本对光无响应，但仍接受红光或远红光照射；“光开关”（LS）样本则包含所有光控基因开关质粒，并接受红光或远红光照射。（D）对红光和远红光刺激的诱导表达水平。（LS-远红光数据在C和D中相同）。（E）经红光/远红光照射后细胞中荧光素酶的诱导倍数。 请点击此处查看该图的放大版本。

 请点击此处下载补充图1-39。

补充图1：用于多个LED的电子驱动电路。（A）单个LED系统的电路图。（B）四个LED系统的电路图。

补充图2：连接电路的互连部分。（A）将PCB板夹在辅助固定架上。（B）将主电路跳线按图示插入通孔中。（C）导线连接器的坐标对应示意图。对于四个LED系统，按图示绘制线条将每个电路分开（黑色垂直线）。补充图31–38 描述了同时组装四个电路的过程。

补充图3：将导线焊接到PCB上。 （A）弯曲跳线，使其与PCB直接接触，并在焊接时保持固定位置。（B）弯曲导线的另一视角。（C）焊接后的导线。（D）在PCB上修剪后的导线。（E）用焊锡加热后收缩的绝缘层。（F）移动绝缘层至指定位置，以覆盖接地通孔（蓝色箭头）。（G）在导线端部或端子上添加助焊剂。

补充图4：将稳压器焊接到位。 （A）稳压器坐标的示意图。（B）稳压器的放置位置。（C）弯曲的稳压器引脚。（D）焊接后的稳压器焊盘。

补充图5：将电阻R1焊接到指定位置。 （A）电阻R1（820Ω）坐标的示意图。（B）使用镊子夹住引线将电阻拉入位。（C）已拉至靠近PCB的电阻。（D）焊接完成后的电阻靠近PCB的状态。

补充图6：将晶体管焊接到位。 （A）晶体管坐标及方向示意图。（B）注意晶体管的方向；本型号的标签朝向电压调节器（LM317T）。请仔细核对晶体管规格，确保“发射极”、“基极”和“集电极”插入正确的孔位。（C）焊接前将引脚弯折后的晶体管。

补充图7：将电位器的线对线连接器焊接到位（对于低压电路还需添加一个560Ω电阻）。（A）线对线连接器位置的坐标图（若构建低压电路，需添加R3-560Ω电阻；此时应先将线对线连接器插入孔中，再插入电阻）。（B）一个母型线对线连接器。（C）为便于将电阻和线对线连接器装入通孔，将编织线中的3–5根细丝弯折。（D）使用剥线钳尽可能贴近绝缘层将细丝剪断。（E）将母型线对线连接器的红线插入a5通孔（对于低压电路，将R3电阻插入同一通孔）。（F）焊接前电阻和线对线连接器的底部视图。（G）R3电阻焊接后与地线连接的图像（F = 母型）。

补充图8：将电位器的导线对导线连接器焊接到接地端。（A）电位器导线对导线连接器接地连接位置的坐标示意图。（B）电位器导线对导线连接器与R3并联的俯视图（F = 母端）。

补充图9：焊接微控制器和LED的线对线连接器。 （A）用于将2N222A和接地连接至微控制器的线对线连接器坐标图。 （B）已焊接的公头线对线连接器。 （C）（B）的顶视图。 （D）用于将电路输入端和接地连接至LED的母头线对线连接器坐标图。 （E）已焊接的母头线对线连接器（F = 母头，M = 公头）。

补充图10：焊接电源电路的跳线。 （A）用于将电源连接至地线的橙色跳线坐标示意图。 （B）已焊接就位的橙色跳线。 （C）跳线焊接完成后的底部视图。

补充图11：焊接电源开关和电源线对线连接器。（A）用于连接电源开关的母型线对线连接器的坐标位置示意图。（B）已焊接就位的母型线对线连接器。（C）（B）的另一视角。（D）用于连接电源的公型线对线连接器的坐标位置示意图。（E）已焊接的公型线对线连接器。（F）（E）的另一视角（F = 母型，M = 公型）。

补充图12：将电源连接至公对公电线连接器。 （A）未经改装的电源。（B）剪断电源线。（C）剥去电源线外皮，并切除多余的绝缘层。（D）在电源线上套上热缩管。用于隔离两个接头的热缩管（红色箭头），以及用于固定分开展开的电线的热缩管（黄色箭头）。（E）拧紧的电线将电源与母对公电线连接器相连。

补充图13：将电源连接焊接到公对公电线连接器并进行绝缘。 （A）电源接地端与母对母电线连接器之间的焊接连接。（B）电源正极端子与母对母电线连接器之间的焊接连接。（C）热缩管套在已焊接的单个连接上（红色箭头）。（D）电源的两个连接均已焊接，并已完成热缩管加热处理。（E）将热缩管放置在各个连接处（黄色箭头）。（F）完成后的电源。

补充图14：将电源开关焊接到公对公电线连接器上。 （A）电源开关，其导线已剥去绝缘层，并将热缩管套在导线上（红色箭头所示）。（B）将开关与公对公电线连接器之间的导线拧在一起，准备焊接。（C）将热缩管移至焊接好的连接处上方。（D）经加热处理后，热缩管完全覆盖连接部位。（E）已组装完成的带公对公电线连接器的电源开关。

补充图15：将电位器连接至公对公线缆连接器。 （A）电位器的各个部件。（B）将公对公线缆连接器扭绞并弯曲，以钩住电位器的中间端子。（C）公对公线缆连接器已缠绕在电位器的中间端子上。（D）已焊接的线对线连接。（E）红色箭头指向待拆除的金属标签。（F）拆除金属标签后的电位器。

补充图16：连接微控制器的布线。 （A）用于母对母线对线连接器的导线，在压接前已剥除绝缘层并裁剪。（B）线对线连接器上压接端子的位置。（C）线对线连接器的压接过程。（D）已完成压接的线对线连接器。（E）完全组装好的微控制器连接。

补充图17：将导线和LED焊接至LED底座 第1部分。 （A）将LED焊接至LED底座所需的材料。（B）对剥除绝缘层的导线末端进行上锡。（C）在LED底座的触点上涂抹助焊剂。（D）将焊料加至较大的烙铁头以对LED底座进行上锡。（E）将焊料放置在触点上以加热LED底座。（F）用烙铁头沿触点拖动后的LED底座状态。（G）在另一触点上执行相同的步骤。

补充图18：将导线和LED焊接到LED底座上的步骤 第2部分。 （A）使用发夹将一根上锡的导线夹在触点上。注意黑色导线已焊接到阴极“C-”。（B）在烙铁头处添加足量的焊料。（C）将烙铁头压在导线上，熔化LED底座和导线上的焊料。（D）按住导线，使其在移开烙铁后仍保持原位。（E）固定导线位置，直至焊料完全凝固。

补充图 19：将导线和 LED 焊接到 LED 底座上的步骤 第3部分。 （A）使用尖头工具将焊膏涂抹到 LED 底座上，用于安装 LED。 （B）已正确放置焊膏的 LED 底座。 （C）将 LED 放置到 LED 底座上，使 LED 的触点与底座的触点对齐。

补充图20：将导线和LED焊接到LED底座的第四部分。（A）黑色导线仍通过发夹固定在触点上。（B,C）使用第二个发夹将红色导线固定到位。注意，红色导线焊接至阳极“A+”。（D）在烙铁头处添加足量焊料。（E）烙铁头压住导线，熔化LED底座和导线上的焊料，以及LED下方的焊膏。（F）焊接完成后，热的LED底座正在冷却。（G）已将导线和LED焊接好的LED底座。（H,I）红色箭头指向焊盘。焊接后，焊点呈现金属光泽（与焊接前的灰色相比，参见补充图16D）。

补充图21：将LED导线连接至公对公导线连接器。 （A）已剥线的导线与公对公导线连接器，旁边为对半切开的热缩管（1/8英寸和3/16英寸）。（B）焊接前，热缩管放置在导线上方的位置。（C）焊接前将导线拧在一起。（D）从导线到公对公连接器的焊接连接。（E）红色和黑色导线均已焊接完成。（F）将1/8英寸热缩管套在焊接连接处。（G）使用热风枪加热后收缩的热缩管。（H）将3/16英寸热缩管套在较小的热缩管外。（I）焊接并用热缩管密封后的连接部位。

补充图 22：使用环氧树脂将导线和 LED 固定在 LED 底座上。 （A）使用木制涂布器将环氧树脂涂抹到 LED 底座中。在下方放置胶带以接住滴落的环氧树脂。（B）将环氧树脂均匀地铺满整个表面。（C）将 LED 静置过夜使其固化。

补充图23：在盒子盖内安装LED灯。 （A）带魔术贴的LED灯，便于安装。（B）使用魔术贴将不同颜色的LED灯安装在黑色盒子内部。（C）用高速旋转工具在黑色盒子盖上切出缺口，以便容纳LED灯的导线。（D）用于刺激细胞的黑色盒子，内附魔术贴以安装LED灯。（E）在带有魔术贴的LED盒内放置多孔板的位置示意图。

补充图24：将LED安装在盒子盖外部。（A）使用高速旋转工具在黑色盒子的盖子上钻孔，并切出一个缺口，以便为导线留出空间（红箭头所示）。（B）将LED插入孔中，导线置于缺口内，并用绝缘胶带固定。（C）再使用两段胶带进一步固定LED。散热片背面暴露在外，以最大化散热效率。（D）在LED安装位置的孔洞上粘贴磨砂膜。红箭头指向磨砂膜。（E）用于通过外部安装的LED刺激细胞的黑色盒子，LED外覆磨砂膜以实现光照扩散。（F）在配备外部LED和磨砂膜的LED盒子中放置多孔板的位置示意图。

补充图25：在盒子盖板上钻孔以安装电源开关和电位器。 （A）盒盖的带尺寸标注的CAD图纸。（B）带有电位器和电源开关孔的盒盖。

补充图26：制备导线出口孔。 （A）带标注尺寸的CAD图纸。（B）使用钻头钻孔后的孔洞照片。（C）使用高速旋转工具或锉刀对出口孔进行打磨光滑。（D）将护线套安装到出口孔中。

补充图27：微控制器和PCB在盒子中的放置位置。（A）盒内的微控制器支架（橙色）和PCB支架。（B）已固定在盒内的微控制器和PCB。

补充图 28：电位器和电源开关的安装位置。 （A）带有电源开关和四个电位器的盒盖正面视图。（B）盒盖正面视图，已添加电位器旋钮。（C）盒盖背面视图，显示已安装的组件。

补充图29：组装完成的LED控制系统。 （A）打开的控制盒，内部导线使用标签打印机标注，并用扎带整理归位。（B）完全组装后的控制盒，每个POT和PIN均标有标签。

补充图30：压接式线对线连接器的放置。（A）用于四LED微控制器系统的压接式线对线连接器的照片。（B）将压接连接器插入微控制器端口的位置示意图。

补充图31：放置跳线。（A）电路板上标有红色跳线的坐标。（B）电路板上标有黄色跳线的坐标。

补充图32：放置跳线。 显示黄色跳线位置坐标的电路板。

补充图33：添加电压稳压器。 将LM317T电压稳压器添加到电路中，其坐标在图中标出。

补充图34：插入820Ω电阻。 将R1电阻添加到电路中，其坐标在图中标出。

补充图35：插入晶体管。 将2N2222A晶体管添加到电路中，其坐标在图中已标注。

补充图36：插入用于POT连接的母端线对线连接器和电阻（可选）。 在图中，导线和电阻通过其坐标进行标注并添加到电路中。（A）插入红色导线，随后插入R2电阻（560Ω）（仅适用于低压电路）。（B）将电阻的另一端插入指定的接地孔中。（C）将黑色导线插入标记的孔中以连接至接地。注意：R2（560Ω）与电位器并联。

补充图37：为微控制器连接和电源插入 male 线对线连接器。 将导线连接到电路中，并在图中标注其坐标。A将红色导线插入指定的孔中。B将黑色电线插入标记的孔中。 

补充图38：添加LED线对线连接器。 （A）红色引线坐标高亮显示的母型线对线连接器。 （B）黑色引线坐标高亮显示的母型线对线连接器。

补充图39：PhyB-PIF3基因开关实验的设置。（A）含有海肾荧光素酶作为内参对照的主混合液示例表格。（B）用于设置PhyB-PIF3光遗传学实验双荧光素酶报告基因检测DNA混合物的示例表格。（C）设置PEI转染试剂并将混合物分装至细胞（逐滴加入）的示例表格。（D）放置照度计以设定LED亮度的位置。

讨论

本实验室已使用此处所述的LED系统来优化、表征并操作多种光遗传学工具。在Kyriakakis等人的研究4中，我们并行测试了多种PhyB-PIF基因开关的组合。随后，我们利用该系统测试不同频率的光脉冲，以测量基因开关的动力学特性及有效光强度。该系统还被用于优化和表征两种使用蓝光进行激活的光遗传学系统5,6。由于大多数光遗传学工具仅需一个足够亮的LED即可激活，因此为每个孔配备大量LED的系统并非总是必要。该装置成本低廉、性能可靠、易于重新配置，且组装过程中无需任何前期电子学专业知识。

在补充的补充图31–38中，我们描述了如何将最多四个LED集成到该系统中。尽管这可能会限制某些需要大量平行条件的实验，但可以通过将本方案中使用的9伏电源替换为更高功率的电源来增加更多LED。类似地，多个低功率LED也可以并联连接到每个电路上。在后一种配置中，部分LED将无法单独控制，但当需要多个LED覆盖更大区域时，这种设计非常实用。一旦熟悉了该系统的电子结构，便可通过多种方式对其进行定制。定制系统的其他策略包括：调节LED与样品之间的距离，或通过滤光片/散射片进行照射，以实现均匀的光照条件，或防止加热，如（补充图23）及Allen等5所述。我们LED设计的另一个显著特点是其被环氧树脂封装，并在背面配有搭扣固定装置；这使得LED能够方便而牢固地安装在几乎任何位置：如培养箱、鱼缸、动物笼具、墙壁等。

许多利用光遗传学控制基因、信号通路及其他细胞活动的实验通常需要脉冲式光照，持续时间较长，或需在培养箱中进行，因此需要实现自动化或无需显微镜的远程操控。该LED系统已在湿润的CO2培养箱内连续运行数月，未出现任何问题。此外，对于PhyB等可逆光遗传系统，实验人员可能需要编程设定特定的脉冲照明方案。在我们之前的研究4中，曾通过用户界面使用脉冲程序测试了哺乳动物细胞中PhyB-PIF3开关的可逆动力学特性。根据本文所述方法，编程设定脉冲方案十分简便，能够以用户友好的方式为多种类型的光遗传学实验提供所需的灵活性与自主性。

构建该系统的最关键步骤包括在PCB板上组装电路以及连接各个元器件，这些内容在第1节和第2节中有详细说明。必须严格遵循这两个部分中的每一步操作，并在焊接每个元器件之前逐行仔细核对焊盘编号。第2节解释了如何安装将连接到电路的元器件。为确保元器件以正确方向连接，特别重要的是要保证线对线连接器上黑色和红色导线的颜色匹配。在这两个部分中出现的任何微小疏忽都极有可能影响系统的正常功能。事实上，排查此方法故障的第一步就是检查电路是否正确搭建，以及所有连接是否到位。第二步尤为重要的是检查焊接质量，查看是否存在松动的连接，以及导线是否存在散开的金属丝可能导致电路短路。第三步是确保LED正常工作，可通过电源或1.5 V电池配合鳄鱼夹夹住LED的两个电极进行测试。另一个潜在的关键考虑因素是防止高功率使用LED时产生过热，或实现更广范围的照明以扩散光线。为解决这些问题，可将LED安装在一个黑色盒子外部，盒子内侧贴有“隐私膜”，如补充图23及Allen等5所述。由于该系统结构简单，拆卸以验证、修改、升级或维修模块化组件并不困难。

对于诱导型基因系统而言，另一个关键因素是需要考虑所需的激活程度，或受控生物系统可接受的泄漏表达水平。如图6所示，这些参数会随报告基因DNA的用量而变化。此外，转染效率以及因此导致的每个细胞中报告基因载体的拷贝数也会存在差异。对于某些实验而言，构建含有固定量报告基因或PhyB基因开关元件的细胞系，并筛选出具有理想诱导表达范围的克隆，可能更具优势，这在药物诱导系统中是常见的做法。由于慢病毒质粒pPK-2304的尺寸较大且不稳定，我们还构建了基于pcDNA骨架的非慢病毒质粒版本PhyB开关，即pPK-351（Addgene #157921）和pPK-352（Addgene #157922）。

通过按照本方案构建此LED照明系统，用户将拥有在体外和体内开展多种光遗传学实验所需的所有组件。结合在哺乳动物细胞中使用PhyB-PIF3的说明，本方案将使非工程背景的研究人员和生物学家能够在多种实验条件下灵活且有效地应用基于PhyB的光遗传学技术。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢王英晓（Peter）博士、黄子梁和莫莉·艾伦在LED系统开发过程中测试了不同版本的系统。本研究得到了加州大学圣地亚哥分校和索尔克研究所Kavli脑与心智研究所、美国国家科学基金会通过信息科学中心（资助号CCF-0939370）、美国国立卫生研究院资助NS060847以及美国国立卫生研究院资助R21DC018237的支持。

材料

本文使用的材料清单
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晶体管纽瓦克2N2222A可从多个地方购买。
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细胞培养试剂
人胚肾293细胞 HEK293ATCCATCC CRL-1573常用细胞系。
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胎牛血清ThermoFisher26140079这些非常常见，且存在多种等效型号。
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10,000 单位/毫升的青霉素和 10,000 µg/mL 链霉素ThermoFisher15140122这些元件非常常见，且存在多种等效型号。
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白色康宁96孔实心黑色或白色聚苯乙烯微孔板ThermoFisher07-200-589首选白色培养板。请勿使用透明培养板。
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PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量 40,000）PolySciences24765-1可用其他转染试剂替代。
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设备名称
斜口剪线钳（110 mm）亚马逊Proskit 1PK-037S这些元件非常常见，且存在多种等效型号。
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Dremil 切割和研磨工具亚马逊Dremel 200-1/15任何类似的Dremel均可使用。
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Dremil 磨削头亚马逊Dremel 84922碳化硅磨石
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EDSYN 原装豪华型 SOLDAPULLT亚马逊DS017用于清除焊料/纠正错误。
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