方法文章

为光遗传学实验构建简单通用的照明系统

DOI：

10.3791/61914

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2021年1月12日

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1Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 2University of California, San Diego, 3Department of Mathematical Computational, and Systems biology, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, Duke University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了如何使用PhyB和PIF3进行光遗传学实验以控制红光和远红光的基因表达。其中包括构建简单灵活的照明系统的分步说明，该系统可以使用计算机控制基因表达或其他光遗传学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用光控制生物过程提高了研究人员操纵许多生物过程的准确性和速度。光学控制允许前所未有的解剖功能的能力，并具有实现新型基因疗法的潜力。然而，光遗传学实验需要足够的光源，具有空间、时间或强度控制，这通常是研究人员的瓶颈。在这里，我们详细介绍了如何构建低成本和多功能的LED照明系统，该系统可针对不同的可用光遗传学工具轻松定制。该系统可配置为手动或计算机控制，LED强度可调。我们提供了一个图解的分步指南，用于构建电路，使其由计算机控制，并构建LED。为了便于该器件的组装，我们还讨论了一些基本的焊接技术，并解释了用于控制LED的电路。使用我们的开源用户界面，用户可以在个人计算机（PC）或廉价平板电脑上自动执行精确的计时和光脉冲。这种自动化使该系统可用于使用LED控制基因，信号通路和其他跨越大时间尺度的细胞活动的实验。对于该协议，不需要电子学方面的先验专业知识来构建所需的所有部件或使用照明系统进行光遗传学实验。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光遗传学工具正变得无处不在，并且不断开发新技术来光学控制生物过程，例如基因表达，细胞信号传导等等1，2，3。用光控制细胞过程的能力允许快速动力学、严格的空间控制和剂量依赖性调节，这些调节可以通过光强度和曝光时间来控制。要使用这些工具，需要控制这些参数的设备。我们最近开发了一种基因编码的PhyB-PIF3哺乳动物基因开关，它分别使用红光/远红光可逆地激活和失活基因4。该系统在几种哺乳动物细胞系中进行了测试，即使在非常少量的光（包括光脉冲）下也能实现无与伦比的基因表达诱导。希望使用PhyB开关和类似工具5，6的研究人员经常请求有关控制照明强度和持续时间的方法的信息。因此，我们开发了该协议，并附有分步说明，以便更广泛地采用这些光遗传学工具。

在LED广泛使用之前，带有滤光片的宽带光源用于研究光敏色素7等光敏蛋白。最近，一些LED照明系统已经与光遗传学工具8，9，10，11，12一起发布，但这些协议可能需要电子/软件方面的大量专业知识，需要专门的设备（例如，3D打印机，激光切割机或光掩模），或者没有提供一些研究人员需要部署的分步说明。虽然独立控制多孔板中的单个孔可能很有用，但当研究人员只需要在明光和暗光或红光与远红光下比较几个不同的样品时，通常没有必要。此外，许多现有的商业系统价格昂贵，定制能力有限。但是，该协议中描述的LED具有成本效益，明亮，并且可以以多种方式安装;因此，它们可用于照亮几种不同类型的样品。通过提供的协议和软件，可以使用和控制从紫外 （UV） 到 NIR 的 LED，以使用 UVR8 13，14、Dronpa15，16、LOV 域 17，18、阶跃函数视蛋白 19，20、CRY2 21，22、PhyB4，23，24 进行光遗传学实验，25、细菌光敏色素26、27、28、29等光响应系统30、31、32。

该协议构成了控制光刺激不同参数所需的电路和其他硬件的组装教程，以及运行光遗传学实验的分子/细胞工具。此外，我们报告了从Kyriakakis等人4优化的质粒，这些质 粒更小，更稳定，可用于克隆。通过该协议，没有电子和光学专业知识的生物学家可以构建灵活而强大的照明系统。我们逐步展示了如何构建LED系统，消除了更广泛采用光遗传学工具的技术瓶颈。该系统可轻松用于大多数细胞培养箱，即使它们不包含线端口。例如，我们将 LED 系统连续保存在加湿的 CO2 培养箱中超过 6 个月，性能没有下降。我们还解释了如何将 LED 系统连接到计算机，并将其与我们在 GitHub 上提供的开源软件连接 （https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces）。使用此协议构建系统可为研究人员提供调试潜在问题、更换部件和改进/扩展功能的基本知识。

系统概述

构建照明系统涉及 （1） 构建电子电路，（2） 构建外围设备（电源线、电源开关等），（3） 构建 LED，（4） 组装所有这些组件，以及 （5） 安装软件以通过用户界面控制 LED（图 1A）。完成后，照明系统可以通过用户界面独立控制多达四个 LED（图 1B）。用户界面使每个 LED 能够以指定的时间间隔脉冲，并在指定时间后关闭。还有一个开始延迟，可以在指定时间开始照明程序。电位计 （POT） 可独立调节每个 LED 的强度，也可用于无需计算机即可手动控制 LED。LED的电线可以是任何自定义长度，使其可以轻松放置在培养箱或实验室空间中。由于这些LED的高功率，它们可用于从远处用单个LED照亮大面积区域。

指示灯驱动器说明

为了给LED供电和控制强度，该协议将通过构建"LED驱动器"的步骤。每个 LED 都有一系列工作电压（图 1C）。在工作期间，控制光强度的稳压器的输出电压可通过电位计调节。POT改变电阻，调节输出电压/亮度。使用1kΩ（1千欧）电位器调谐可提供我们所说的"高压电路"，范围为1.35 V至2.9 V。 由于2.9 V对于操作低压LED来说太高（图1C），我们显示了单个修改（电阻3或"R3" 补充图1A），限制了与低压LED匹配的范围。当与电位计并联时，R3用于将施加到LED的最大电压降低到1.85 V（ 补充图8中详述的组件）。通过使用电压而不是电流来控制亮度，该系统对于具有不同工作电压的LED更加灵活。 图1C 包含高压和低压LED列表，以指导最佳电路选择。这种设计将最小电压保持在足够低的水平，以便在电位计关闭时LED完全关闭，并且不允许电压超过LED的典型工作电压。对于PhyB光遗传学，我们使用深红色和远红色LED，它们使用低压电路。

LED电脑控制系统说明

LED照明系统可用于无需计算机或微控制器的恒定照明。但是，对于脉冲程序和控制单个LED定时，必须安装微控制器。要使用微控制器来控制LED，需要一个晶体管将微控制器连接到电路。该晶体管感测来自微控制器的电压，并从导电或绝缘切换。为了控制"开"和"关"，我们使用所谓的"NPN开关型晶体管"（2N2222）作为R2上的可控分流器（补充图1A）。当来自微控制器的电压施加到晶体管基极时，晶体管变得导电并使LED电压变低，从而关闭LED。因此，LED和晶体管的开启和关闭状态由微控制器直接控制，微控制器由PC上安装的软件控制。

要制作照明系统，需要以下步骤:构建电路;构建电源、手动电源开关、POT 和微控制器连接;构建发光二极管;容纳一个黑匣子以适应照明系统;连接所有布线和设备;安装LED控制软件，用光刺激细胞;使用双荧光素酶测定法测量基因表达。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 构建电路

注:此处介绍了为可用 LED 构建单个电路的协议。补充信息中包含将其扩展到最多四个 LED 的说明。

  1. 打开烟雾吸收器和烙铁。在擦拭海绵中加水，手边有焊料。
    注意:确保采取安全预防措施以去除烟雾并防止烧伤。
  2. 开始按照补充面板中显示的顺序将电路组件焊接到印刷电路板（PCB板）上。
    注意:在烙铁头上使用少量焊料先加热元件和PCB板的金属，然后将额外的焊料直接熔化到元件上;助焊剂可以帮很多忙。
  3. 焊料跳线和组件（补充图2 和 补充图3）。
    1. 对于跳线（连接电路板上两点的绝缘电线），请使用跳线套件中的两根橙色 [7.6 毫米（0.3 英寸）] 和黄色 [12 毫米（0.4 英寸）] 电线。
    2. 将PCB板夹在"帮助之手"上，将跳线插入以下针孔中，将端子弯曲45度并添加助焊剂（图2，补充图2和补充图3）:a1和a3→接地（-）（橙色），a7→电源（+）#7（黄色），d2→d6（黄色）。
    3. 焊接然后修剪电线的背面。
    4. 将LM317T稳压器插入以下针孔中，弯曲引脚并添加磁通量（图2 和 补充图4）:调整→e5，V输出 →e6，V在 →e7中。
    5. 首先焊接左右端子，修剪它们，然后焊接并调整中间端子。
    6. 要设置电路的低电压范围，请将 820 Ω 电阻一直插入针孔中，焊接并调整 c2 → c5（图 2 和 补充图 5）。
    7. 要通过微控制器实现LED控制，请将晶体管插入b3–b5（图2 和 补充图6）:集电极→b3，基极→b4，发射极→b5。
      注意:请注意晶体管的方向以正确插入;检查规格以查找集电极、基极和发射极名称。
  4. 焊接 POT、LED、微控制器和电源的线对线连接器。
    注意: 注意线对线连接器的电线颜色以及是使用母头还是公头线对线连接器。
    1. 确定所需LED是否需要"低压"电路或"高压"电路（图1C）。
      注意: 如果 LED 在"低电压"列表中，则需要一个与 POT 并联的电阻器。
    2. 对于"低压"或"高压"电路，将来自母线对线连接器的电线穿过孔 a5（补充图 7）。如果制作低压电路，请不要焊接到位。
      注意:扭转裸线末端，使小线毛不会剥落。如果电线看起来太粗而无法穿过针孔而不会磨损，请切开 2-6 股，然后将它们重新扭曲在一起（补充图 7B–D）。
    3. 如果制作"高压"电路，请跳至步骤1.4.5。如果制作"低压"电路，请将560Ω电阻推入同一孔（a5），并用线对线连接器引线焊接。
    4. 将电阻的另一端接地（补充图7G）。
    5. 将焊接到与其接地的 a5 孔中的母线对线连接器的另一端插入并焊接（补充图 8A，B）。
    6. 对于微控制器连接，将公头线对线连接器的一端插入孔 a4，另一端插入连接到地面的孔（补充图 9A–C）。
    7. 对于 LED 连接，将母线对线连接器的一端插入孔 a2，另一端插入连接到地面的孔（补充图 9D，E）。

2.建立电源，手动电源开关，POT，微控制器连接

  1. 构建电源。
    1. 将橙色 [7.6 mm （0.3 英寸）] 跳线从 a29 焊接到地面（补充图 10）。
    2. 将 a30 的母线对线连接器焊接到电源 （+）（补充图 11A–C）。
    3. 将公头线对线连接器从 c29 焊接到 c30（补充图 11D–F）。
    4. 切断电源线上的连接器，露出电线，然后剥去它们（补充图 12A–C）。
    5. 在焊接之前，使用助焊笔在导线上添加助焊剂（补充图3G）。
    6. 在公线对线连接器周围放置一个 3.18 毫米（1/8 英寸）的收缩管，并在电源线上放置一个 4.76 毫米（3/16 英寸）的较厚的一块（补充图 12D）。
    7. 将电源和公线对线连接器的电线扭在一起并焊接（补充图 12E、13A、B）。
    8. 将直径较小的收缩管 3.18 mm（1/8 英寸）放在连接上，并用热风枪将其收缩（补充图 13C，D）。
    9. 将直径较大的收缩管 4.76 毫米（3/16 英寸）放在较小的收缩管 3.18 毫米（1/8 英寸）上，然后再次加热（补充图 13E，F）。
  2. 构建手动电源开关。
    1. 将热缩管放在开关电线上 3.18 mm（1/8 英寸）（补充图 14A）。
    2. 扭曲并焊接公头线对线连接器的电线（补充图 14B，C）。
    3. 将收缩管 3.18 毫米（1/8 英寸）放在焊接部分上，然后用热风枪收缩（补充图 14D，E）。
  3. 将公头线对线连接器连接到 POT。
    1. 将线对线连接器的黑线绕在 POT 的中间端子周围（补充图 15B）。
    2. 拧紧缠绕在端子上的电线并将其焊接（补充图 15C）。
      注意:小型精密钳子可以帮助拧紧。
    3. 重复与端子的红线连接，如 补充图15D所示。
    4. 用钳子折断红色箭头附近的金属卡舌（补充图15E，F）。
  4. 建立微控制器连接（仅计算机控制的 LED 需要）。
    1. 如果为多个 LED 制造 LED 驱动器，请切断除一个母线对线连接器之外的所有黑线（补充图 16A）。
    2. 压接线对线连接器的末端，如图所示（补充图 16B–D）。
    3. 将压接端推入矩形连接器（补充图 16E）。

3. 构建发光二极管

  1. 剥去线端（~5 mm）并使用助焊剂笔涂抹助焊剂，如 补充图3G所示。
    注意: 为了有效地将导线焊接到 LED 基座上，必须在 LED 基座和导线上的触点中添加助焊剂。
  2. 通过从下方加热导线并从顶部添加焊料来镀锡电线（补充图 17B）。
  3. 使用助焊剂笔将助焊剂放在LED底座的表面触点上（补充图17C）。
  4. 将大量焊料放在大焊头 （~4–5 mm） 上（补充图 17D），用它来加热触点处的 LED 基座（补充图 17E）。几秒钟后，将焊料拖过触点（补充图 17F）。对另一个触点重复步骤3.3–3.4（补充图17G）。
    注意:在焊接过程中，LED 底座会变得非常热。将 LED 底座放在不会熔化或燃烧的表面上。
  5. 使用发夹将黑线夹在触点"C +"（阴极）上（补充图18A）。
  6. 将大量焊料放在大焊头上（补充图18B），然后将其向下压在导线上，直到LED底座上的焊料熔化（补充图18C）。按住电线（补充图18D）并在将电线固定到位的同时取出烙铁（补充图18E）。
  7. 将少量焊膏放在焊盘上以进行 LED 连接（补充图 19A，B），并使用镊子将 LED 放在焊盘上（补充图 19C）。
    注意:如果位置有点偏差，没关系;一旦焊膏熔化，它就会到位.
  8. 握住"A+"（阳极）上的红线，并用发夹将其夹住（补充图20A-C）。
  9. 将大量焊料放在大焊头上（补充图20D），然后将其向下压在导线上，直到LED底座上的焊料和LED下方的焊膏熔化（补充图20E）。
    注意:锡膏熔化后，颜色变为银色（补充图20H，I）。
  10. 选择所需设置所需的电线长度。剥去LED导线和公头线对线连接器（补充图21A），然后添加助焊剂，如 补充图3G所示。
  11. 将收缩管放在电线上。在线对线连接器上使用 3.18 mm（1/8 英寸）收缩管，在电线上使用 4.76 mm（3/16 英寸）收缩管（补充图 21B）。
  12. 用"帮助之手"夹住线对线连接器，然后用电线扭转连接器端（补充图 21C）并焊接它们。对另一根导线重复此操作（补充图21D，E）。
  13. 将 3.18 mm（1/8 英寸）收缩管放在焊料上并收缩（补充图 21F–G）。
  14. 将 4.76 毫米（3/16 英寸）收缩管放在 3.18 毫米（1/8 英寸）收缩管上并收缩（补充图 21H–I）。
  15. 将 LED 电线夹在"帮助之手"上，并在其下方贴上胶带（补充图 22A）。
  16. 根据制造商的说明混合环氧树脂，并铺在焊接的LED顶部（补充图22B）。放置过夜以治愈。
  17. 如果使用触摸扣进行安装，请切下一小块触摸扣（补充图 23A），然后将其按压在 LED 背面 30 秒。
  18. 使用高速旋转工具在黑匣子的盖子上做一个凹口（补充图23C-E）。
  19. 通过隐私膜为单个 LED 构建支架。
    1. 使用铲形钻头，在放置 LED 的黑匣子顶部钻一个 1.75 厘米（11/16 英寸）的孔（补充图 24A）。
    2. 使用高速旋转工具，在孔的一侧开一个凹口，为 LED 线腾出空间，如 补充图 24A 所示。
    3. 切一块隐私膜（25-30毫米）并用胶带粘在黑匣子的内部，覆盖LED将照亮的孔（补充图24A）。
    4. 将 LED 放在黑匣子外面的孔顶部，用隐私膜和胶带用电工胶带固定到位（补充图 24B–E）。

4.容纳一个黑匣子以适应照明系统

  1. 对于四 LED 系统，在连接电位计的盖子上钻四个 0.83 厘米（21/64 英寸）孔，相距 3.81 厘米（1.5 英寸）（补充图 25）。
  2. 使用高速旋转工具，在左上角切一个 1.19 cm x 1.90 cm（0.47 英寸 x 0.75 英寸）的矩形孔（补充图 25）。
  3. 使用铲形钻头在黑匣子上钻一个 1.75 厘米（11/16 英寸）的孔（补充图 26）。
  4. 锉削孔并将索环插入钻入的孔中（补充图 26）。
  5. 对于计算机控制的LED，请用砂纸将微控制器粘在黑匣子中的区域以及微控制器支架的底部。
  6. 将微控制器卡入支架，然后将支架固定在黑匣子中，然后环氧树脂就位（补充图27A）。
  7. 使用砂纸打磨两个夹子的底部和黑匣子中放置电路的区域，并用环氧树脂将夹子固定在黑匣子内（补充图27A）。
  8. 将PCB板固定到夹子中（补充图27B）。
  9. 将电源开关推入 补充图 25 中盖子上的方孔并将其卡入到位（补充图 28A）。
  10. 将锅推入盖子上的孔中，拧入到位（补充图28A），然后将旋钮放在锅上（补充图28B）。

5. 连接所有接线和设备

  1. 标记线对线连接器（例如，LED、电位器、通信）（补充图 29A）。
  2. 将步骤 2.4 中制造的压接连接器（补充图 16）连接到两个母连接器（POT 和 LED）之间的公线对线连接器（补充图 7A 和 S37）。
  3. 将压接端连接到微控制器（补充图30）。
  4. 将 USB 电缆穿过索环并将其插入微控制器。
  5. 将 LED 的电线拉过索环，并连接到微控制器连接左侧的线对线母连接器（补充图 9D 和 38）。
  6. 将电源的电线拉过索环，并将其连接到PCB板右侧的公线对线连接器（补充图11D）。
  7. 将电源线开关的公线对线连接器连接到PCB板右侧的线对线母连接器（补充图11A）。
  8. 将盖子上的 POT 的公线对线连接器连接到 PCB 板上的母线对线连接器（补充图 8 和 36）。
    注:请勿在未连接电位计的情况下打开电路。

6. 安装LED控制软件

注意:请参阅 Github 上补充文件中的详细软件安装说明。https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

  1. 下载并安装微控制器编程软件
  2. 下载并安装包管理器。
  3. 对微控制器进行编程。
  4. 下载并安装运行时引擎。
  5. 下载用户界面。

7. 用光刺激细胞

  1. 转染HEK293细胞。
    1. 在24孔板中以每孔100k细胞板板HEK293细胞板。
    2. 使用示例表计算无血清培养基、聚乙烯亚胺（PEI）和DNA体积（补充图39），并使用制造商的方案进行转染。
  2. 用光刺激细胞。
    注意:转染后细胞必须保存在黑暗中或使用不会激发光遗传学系统的光源进行处理。
    1. 决定对细胞使用哪种类型的刺激（连续光，脉冲强度等）。
    2. 关闭 POT（逆时针）后，打开 LED 电源。
    3. 将测光表放在将放置电池的黑匣子内，并将带有 LED 的盖子放在测光表上。根据需要调整光强度。
    4. 如果使用计算机控制 LED，请打开用户界面软件。
    5. 对用户界面进行编程（图 5A，B）。
      1. 在左上角的面板上，选择微控制器的COM端口，然后单击 连接。
      2. 使用右侧的面板对每个 LED 进行编程。对于常亮灯，请在"时间开启"中选择除零以外的任何时间，并将"时间关闭"设置为零。
      3. 在右下面板上，对主时序控件进行编程。
        1. 要延迟照明，请选择启动延迟 （HH:MM）。
        2. 要在指定时间后关闭所有 LED，请选择运行时间 （HH:MM）。
        3. 通过单击 "运行" 按钮启动照明程序（图5A）。

8. 使用双荧光素酶测定法测量基因表达

  1. 通过将 10 mL 荧光素酶缓冲液与荧光素酶试剂和等分试样在 1 mL 管中混合以在 -80 °C 下储存长达 1 年来制备荧光素酶试剂。
  2. 将裂解缓冲液 5x 转换为 1x，用于 N + 2 孔的 100 μL。例如，对于 30 个样品，30 x 20 μL 的 5X 裂解缓冲液和 30 x 80 μL 的 MQ H2O。
  3. 制备 Renilla 底物溶液:20 μL Renilla 底物用于 1 mL Renilla 缓冲液（此量适用于 10 次测定）。
  4. 从培养箱中取出细胞，吸出培养基，每孔加入 100 μL 1x 裂解缓冲液，并将其置于 100 RPM 的摇床上 15 分钟。
  5. 置于-20°C至少1小时。
  6. 将每个样品 100 μL 荧光素酶试剂添加到白色 96 孔板的孔中。
  7. 设置酶标仪进行发光。使用读板器的光度计模块，将积分设置为 1 秒。
  8. 将解冻的裂解物添加到荧光素酶试剂下方的孔中。使用多通道移液器将 20 μL 样品混合到荧光素酶试剂中并立即测量发光。
  9. 读数稳定后，加入 100 μL Renilla 底物溶液并再次扫描。
  10. 将荧光素酶信号除以雷尼拉信号，以考虑转染效率。
  11. 比较转染效率标准化的荧光素酶信号（例如，比较来自红光照射和远红光照射样品的信号）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一旦电源电路、电源、电源开关、POT和LED组装好（直至 补充图21），就可以测试电路。所有 POT 就位后，POT 将控制 LED 强度。一旦组装完成，直到 补充图29，该系统可以手动用于光遗传学或其他应用。整个系统的电源可以通过电源开关手动控制。每个LED的强度可以使用连接到每个电路的POT独立控制。

安装软件并对微控制器进行编程后，用户界面可以与微控制器通信。通过用户界面，可以通过多种方式对LED进行时间控制:（1）每个LED可以编程为保持指定的时间，（2）每个LED可以编程为脉冲，（3）全局启动延迟（例如，当转染和照射光24小时后）可以编程（图6B），（4）程序在延迟后运行的总时间。有两个用户界面，一个带有较大的按钮，可以一次控制两个 LED，另一个可以控制四个 LED（图 5A，B）。两个LED用户界面针对平板电脑进行了优化，足以控制许多实验中的红色和远红色LED。

对于较大的实验，第二个用户界面可用于控制多达四个LED。当诱导基因表达时，预期的结果取决于几个参数。这些包括诱导时间、诱导水平（例如，光或药物的量）和细胞中诱导构建体的拷贝数。为了证明这一点，我们转染了PhyB基因开关以及不同数量的报告DNA（pPK-202）（转染DNA的0.5%，1%，2%，4%和8%）（图6A），并如图 6B所示照亮。在含有PhyB但没有质粒产生藻蓝比林（PCB-发色团）（即对光无反应）的样品中，荧光素酶基因表达/泄漏随着报告DNA的数量而增加（图6C）（远红P<0.0001，线性回归后进行Wald测试），（红色P<0.0001，线性回归后进行Wald测试）。此外，当整个PhyB基因开关，包括产生PCB发色团的质粒（光敏细胞）被照亮为远红光时，荧光素酶表达也随着转染混合物中报告构建量的增加而增加（图6C，D）（远红光P < 0.0001，线性回归，然后进行Wald测试）。同样，当光敏细胞被红光照射时，荧光素酶表达也随着报告物量的增加而增加（P < 0.0001，线性回归，然后进行Wald检验）。当比较红光处理细胞与远红光处理细胞的诱导水平时，我们发现随着报告数量的增加，折叠激活略有降低（图6E）（P = 0.0141，线性回归，然后是Wald检验）。

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图 1:单个 LED 的基本电路。 （A） 流程图，显示构建LED照明系统所需步骤的概述。（二）LED照明控制系统。（左）用于调节 LED 强度和定时的控制箱。（中）运行用于控制 LED 的用户界面的 PC 平板电脑。（右）一个黑匣子，用于安装LED和放置用于光学刺激的电池。（C）用于确定LED是否需要高压电路或低压电路的表。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2
图 2:将组件焊接到位的说明。 （A）构建电路的分步卡通说明示例。（乙，丙）带有正在组装的设备图片的示例说明。（D）同时组装多个电路的示例说明。 请点击此处查看此图的大图。

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图 3:组装好的 LED 控制系统的视图。 （A） 组装系统的外部俯视图。（B） 组装好的四个 LED 照明系统的内部视图。 请点击此处查看此图的大图。

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图 4:将 LED 回流焊接到散热器上的说明。 （A）LED底座和深红色LED的特写。（B） 将焊膏放置在 LED 底座上。（C） 焊接 LED 的图片。红色箭头指向焊盘。与焊接前的灰色（A）相比，焊接后，焊料呈现金属/光泽。 请点击此处查看此图的大图。

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图 5:用于控制光遗传学实验的软件。 （A） 带有大按钮的两个 LED 用户界面，便于与廉价平板电脑一起使用。（b） 四 LED 用户界面。两个接口均允许独立的 LED 控制。对于脉冲，可以将 LED 编程为在特定脉冲宽度和指定持续时间内打开和关闭。脉冲还可以具有启动延迟和预定的总运行时间。（C）将LED控制片安装在细胞培养箱上。（D）用远红光照射时的PhyB基因系统示意图。远红光使基因处于"关闭"或"黑暗"状态。（E）用红光照射时的PhyB基因系统图示。红光通过促进PhyB和PIF3之间的相互作用来诱导基因表达.这种相互作用将与PIF3融合的基因激活域（AD）定位到UAS启动子，从而激活报告基因。 请点击此处查看此图的大图。

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图 6:使用 LED 系统控制 PhyB 的预期结果。 （A）编码PhyB + PIF3双杂交伴侣的质粒（pPK-351），编码藻蓝比林（PCB-发色团）合成酶（pPK-352）的质粒和荧光素酶报告质粒（pPK-202）。（B）C-E的光诱导实验时间表。 （C）基础转录水平（AKA泄漏）随着报告DNA数量的增加。"泄漏"样品不用pPK-352转染（即对光无反应），而是用红光或远红光照射。光开关（LS）样品包括所有光基因开关质粒，并用红光或远红光照射。（D）响应红光和远红光的光感应水平。（LS-远红光在C和D中是相同的数据。（E）在用红光/远红光照射的细胞中折叠诱导荧光素酶。 请点击此处查看此图的大图。

 请按此下载补充图1-39。

补充图1:多个LED的电子驱动电路。 （A） 单个 LED 系统的电路图。（B） 四 LED 系统的电路图。

补充图2:放置电路互连。 （A） 将PCB板夹在帮助手上.（B）主电路跳线进入通孔的位置图片。（C） 映射坐标的电线连接器图。对于四个 LED 系统，如图所示绘制划分每个电路的线（黑色垂直线）。 补充图31–38 描述了四个电路同时组装。

补充图3:将电线焊接到PCB上。 （A） 弯曲跳线，使其与PCB直接接触并在焊接时保持原位。（B） 弯曲电线的另一个视图。（C）焊接后的电线。（D） PCB上修剪的电线。（E）用焊料加热后收缩绝缘。（F） 将绝缘层移动到位以覆盖接地通孔（蓝色箭头） （G） 向电线端或端子添加助焊剂。

补充图4:将稳压器焊接到位。 （A）稳压器坐标图。（B）稳压器的放置。（C） 弯曲的稳压器引线。（四）焊接后的稳压端子。

补充图5:将R1电阻焊接到位。 （A） R1电阻（820Ω）坐标图。（B） 用钳子通过引线拉过电阻 （C） 拉电阻靠近 PCB。（D）焊接的电阻靠近PCB板。

补充图6:将晶体管焊接到位。 （A）晶体管坐标和方向的图。（B）注意晶体管的方向;此型号中的标签面向稳压器 （LM317T）。仔细检查晶体管的规格，确保"发射极"、"基极"和"集电极"位于正确的孔中。（C） 端子在焊接前弯曲的晶体管。

补充图7:将电位计的线对线连接器焊接到位（外加一个用于低压电路的560Ω电阻）。 （A）线对线连接器的坐标图（加上R3-560Ω，如果构建低压电路，线对线连接器放置在电阻器前面的孔中）。（B） 母线对线连接器。（C） 为了便于将电阻器和线对线连接器安装到通孔中，弯曲 3-5 股编织线。（D） 用线切割器尽可能靠近绝缘层切断绞线。（E）将母线对线连接器的红线插入a5通孔（对于低压电路插入R3穿过相同的通孔）。（F） 焊接前电阻器和线对线连接器的底视图。（G） 接地的焊接 R3 电阻的图像（F = 母头）。

补充图8:将电位计的线对线连接器焊接到地上。 （A） 电位器线对线连接器的接地连接坐标图。（B） 与R3并联的电位计线对线连接器的顶视图（F = 母头）。

补充图 9:焊接微控制器和 LED 线对线连接器。 （A） 用于将 2N222A 和接地连接到微控制器的线对线连接器的坐标图。（B） 焊接公头线对线连接器。（C） （B） 的俯视图。（D） 用于将电路的输入和接地连接到 LED 的母线对线连接器坐标图。（E） 焊接的母线对线连接器（F = 母头，M = 公头）。

补充图10:焊接电源电路的跳线。 （A） 用于将电源连接到地面的橙色跳线的坐标图。（B） 焊接到位的橙色跳线。（C） 焊接到位的跳线的底视图。

补充图 11:焊接电源开关和电源线对线连接器。 （A） 用于连接电源开关的母线对线连接器的坐标图。（B） 母线对线连接器焊接到位。（C） （B）的另一种观点。（D）用于连接电源的公线对线连接器的坐标图。（E） 焊接公头线对线连接器。（F）（E）的另一种观点（F =女性，M =男性）。

补充图 12:将电源连接到公头线对线连接器。 （A） 未经修改的电源。（二）切断电源线。（C） 电源线剥去，多余的绝缘层被切断。（D）在电源线周围放置收缩管。分隔两个连接的管子（红色箭头）和固定分离电线的管子（黄色箭头）。（E） 将电源连接到母线对线连接器的双绞线。

补充图 13:将电源连接焊接并绝缘到公头线对线连接器。 （A） 电源接地与母线对线连接器之间的焊接连接。（B） 电源正极端子与母线对线连接器之间的焊接连接。（C） 收缩管拉过焊接的单个连接（红色箭头）。（D）两个电源连接都焊接并带有热处理的收缩管。（E） 在单个连接上放置收缩管（黄色箭头）。（F） 已完成的电源。

补充图 14:将电源开关焊接到公线对线连接器上。 （A） 电源开关，将剥线和收缩管放在电线上（红色箭头）。（B）连接开关的导线和公线对线连接器在焊接前绞合在一起。（C） 将收缩管放在焊接的连接上。（D）用热处理的收缩管覆盖的连接。（E） 与公头线对线连接器组装的电源开关。

补充图15:将电位计连接到公头线对线连接器。 （一）电位器部件。（B） 一个公线对线连接器，扭曲和弯曲以钩住电位器的中间端子。（C） 围绕电位器中间端子绞合的公线对线连接器。（D） 焊接的线对线连接。（E） 移除前指向金属卡舌的红色箭头。（F）电位器拆卸金属片后。

补充图 16:连接微控制器连接。 （A） 为准备压接而剥皮和切割的母线对线连接器的电线。（B） 将压接放在线对线连接器上。（C） 线对线连接器的压接。（D） 压接线对线连接器。（E） 完全组装好的微控制器连接。

补充图 17:将电线和 LED 焊接到 LED 底座上，第 1 部分。 （A） 将 LED 焊接到 LED 底座所需的材料。（B） 对剥线的尖端进行镀锡。（C） 在 LED 底座的触点上施加助焊剂。（D） 在大烙铁头上添加焊料，以镀锡 LED 底座。（E） 将焊料放置在触点上以加热 LED 底座。（F） 将烙铁头拖过触点后的 LED 底座。（G） 对另一个联系人采取相同的程序。

补充图 18:将电线和 LED 焊接到 LED 底座上，第 2 部分。 （A） 使用发夹夹在触点上的镀锡电线。请注意，黑线焊接在阴极"C-"上。（B） 在烙铁头上添加大量焊料。（C） 烙铁头压在导线上，熔化 LED 基座和导线上的焊料。（D）按住电线，使其在取出烙铁时保持原位。（E） 将导线固定到位，直到焊料变硬。

补充图 19:将电线和 LED 焊接到 LED 底座上，第 3 部分。 （A） 使用锋利的尖端将焊膏放在 LED 底座上以安装 LED。（B） 带有焊膏的LED底座就位。（C） 将 LED 放置在 LED 基座上，使 LED 和 LED 基座的触点匹配。

补充图 20:将焊线和 LED 焊接到 LED 底座上，第 4 部分。 （A）仍然被发夹夹在触点上的黑线。（乙，丙）使用第二个发夹，将红线固定到位。请注意，红线焊接在阳极"A+"上。（D） 在烙铁头上添加大量焊料。（E） 烙铁头压在导线上，熔化 LED 底座上的焊料和导线以及 LED 下方的焊膏。（F）烫LED底座焊接后冷却。（G） 焊接了电线和 LED 的 LED 底座。（H，I）红色箭头指向焊盘。焊接后，焊料呈金属/光泽（与焊接前的灰色相比（补充图16D））。

补充图 21:将 LED 线连接到公头线对线连接器。 （A）剥线和热缩管旁边的公线对线连接器切成两半（1/8英寸和3/16英寸）。（B） 焊接前将收缩管放置在电线上。（C） 焊接前将电线绞合在一起。（D）从电线到线对线连接器的焊接连接。（E） 红线和黑线焊接在一起。（F） 将 1/8 英寸收缩管放置在焊接连接上。（G）用热风枪收缩后的收缩管。（H） 将 3/16 英寸收缩管放置在较小的收缩管上。（I）用收缩管焊接密封的连接。

补充图 22:使用环氧树脂将电线和 LED 固定到 LED 基座上。 （A）使用木制涂抹器将环氧树脂放入LED底座中。下面放置一个胶带以捕捉任何滴落的环氧树脂。（B）环氧树脂均匀分布在整个表面上。（C） 将 LED 放置过夜以固化。

补充图 23:在盒盖内安装 LED。 （A） 带有触摸紧固件的 LED，便于安装。（B） 使用触摸紧固件安装在黑匣子内部的不同颜色 LED。（C） 黑匣子盖上的凹口由高速旋转工具制成，为LED线腾出空间。（D） 一个黑匣子，用于用用于安装 LED 的触摸紧固件刺激电池。（E） 在 LED 盒的触摸紧固件版本内放置一个多孔培养皿。

补充图 24:在盒盖外安装 LED。 （A） 用高速旋转工具的凹口在黑匣子的盖子上钻孔，为电线腾出空间（红色箭头）。（B）LED用导线放入孔中，用电工胶带固定到位。（C） 另外使用两片胶带固定 LED。散热器的背面暴露在外，以最大限度地提高热交换。（D） 将隐私膜贴在放置 LED 的孔上。红色箭头指向隐私胶片。（E） 一个黑匣子，用于刺激细胞，安装在盒子外面的 LED 和用于扩散照明的隐私膜。（F）在外部LED+隐私膜版LED盒内放置一个多孔培养皿。

补充图 25:在电源开关和电位计的盒盖上钻孔。 （A） 带有盒盖注释尺寸的 CAD 图纸。（B）带有电位器和电源开关孔的箱盖。

补充图26:准备导线出口孔。 （A） 带有注释尺寸的 CAD 图纸。（B） 带有钻头的钻孔图像。（C）用高速旋转工具或锉刀平滑出口孔。（D） 将索环放在出水孔中。

补充图27:微控制器和PCB在盒子中的放置。 （A） 微控制器支架（橙色）和盒子内的PCB支架。（B）将微控制器和PCB固定在盒子里。

补充图28:电位计和电源开关的位置。 （A） 带有电源开关和四个 POT 的盒盖的前视图。（B） 添加了电位计旋钮的盒盖前视图。（C） 带有附加组件的盒盖的后视图。

补充图29:组装好的LED控制系统。 （A） 一个打开的控制盒，电线上贴有标签打印机和拉链，以便整理。（B） 盒子完全组装后，每个锅都标有 PIN 码。

补充图30:压接线对线连接器的位置。 （A） 用于四 LED 微控制器系统的压接线对线连接器的图片。（B） 将压接连接器放入微控制器端口。

补充图 31:放置跳线。 （A） 标有红色跳线坐标的电路板。（B） 标有黄色跳线坐标的电路板。

补充图 32:放置跳线。 显示黄色跳线坐标的电路板。

补充图33:添加稳压器。 LM317T 稳压器被添加到电路中，其坐标在图表中标出。

补充图34:插入820Ω电阻。 R1电阻被添加到电路中，其坐标在图表中标出。

补充图35:插入晶体管。 将2N2222A晶体管添加到电路中，并在图中标记其坐标。

补充图 36:插入用于 POT 连接的线对线母连接器和电阻器（可选）。 导线和电阻器被添加到电路中，并在图中标记其坐标。（A） 插入红线，然后插入R2电阻（560Ω）（仅用于低压电路）。（B） 将电阻的另一端插入指示的接地孔。（C）将黑线插入标记的孔中以接地。注意:R2 （560Ω）与电位计并联。

补充图 37:插入用于微控制器连接和电源的公线对线连接器。 导线被添加到电路中，并在图中标记其坐标。（A） 将红线插入指示的孔中。（B） 将黑线插入标记的孔中。

补充图 38:添加 LED 线对线连接器。 （A） 红色引线坐标突出显示的母线对线连接器。（B） 高亮显示黑色引线坐标的母线对线连接器。

补充图39:设置PhyB-PIF3基因切换实验。 （A） 用于内部控制的含有Renilla的预混液示例表。（B）用于为PhyB-PIF3光遗传学实验的双荧光素酶报告基因测定设置DNA混合物的示例表。（C）设置PEI转染试剂并将混合物等分到细胞上（滴注）的示例表。（D） 用于设置 LED 亮度的测光表的位置。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里描述的LED系统已被我们的实验室用于优化，表征和使用几种光遗传学工具。在Kyriakakis等人4中，我们并行测试了许多PhyB-PIF基因开关的组合。然后，我们使用该系统测试不同频率的光脉冲，以测量基因开关动力学和有效光强度。该系统还用于优化和表征两个使用蓝光进行刺激的光遗传学系统5，6。由于只需要一个LED足够亮才能激活大多数光遗传学工具，因此并不总是需要购买每个孔上具有大量LED的系统。这种设置价格低廉、可靠、易于重新配置，并且不需要事先的电气专业知识即可遵循组装协议。

在补充 补充图31–38中，我们描述了如何将多达四个LED集成到系统中。虽然这可能会限制一些需要大量并联条件的实验，但可以通过用更高瓦数的电源替换该协议中使用的 9 伏电源来添加更多 LED。同样，几个较低功率的LED可以并联到每个电路。在后一种安排中，某些LED不会单独控制，但是当需要许多LED覆盖更大的区域时，这可能很有用。一旦熟悉了该系统的电子设备，就有很多方法可以对其进行定制。定制系统的其他策略包括将LED放置在离样品更远或更近的地方，并通过滤光片/扩散器照明均匀的照明条件或防止加热，如（补充图23）和Allen等人5所示。我们 LED 设计的另一个显着特点是它封装在环氧树脂中，背面有一个触摸紧固件;这使得 LED 几乎可以轻松安全地放置在任何地方:孵化器、鱼缸、动物笼子、墙壁等。

许多使用光遗传学来控制基因、信号通路和其他细胞活动的实验通常需要脉冲、跨越大时间尺度或需要在培养箱中进行，因此需要在没有显微镜的情况下进行自动化或远程操作。该 LED 系统已在加湿的 CO2 培养箱内连续测试了几个月，没有任何问题。此外，对于可逆系统（如PhyB光遗传学系统），实验者可能需要对特定的脉冲照明时间表进行编程。在我们之前的工作4中，我们使用脉冲程序通过用户界面测试哺乳动物细胞中PhyB-PIF3开关的可逆性动力学。使用本手稿中描述的方法，对脉冲协议进行编程很容易，以用户友好的方式提供许多类型的光遗传学实验所需的灵活性和自主性。

构建该系统的最关键步骤包括将电路放在PCB板上并连接组件，详见第1节和第2节。在焊接每个组件之前，必须仔细遵循这些部分中的每个步骤，并逐行仔细检查针孔编号。第2节介绍如何设置将连接到电路的组件。为了使组件以正确的方向连接，确保线对线连接器上的黑色和红色电线的颜色匹配尤为重要。这两个部分中的小疏忽很可能会影响系统的功能。实际上，对此方法进行故障排除的第一步是检查电路是否正确构建以及所有连接是否到位。其次，检查连接松动的焊接质量以及可能使电路短路的扩口线毛的导线尤为重要。第三步是确保 LED 正常工作，这可以使用电源或 1.5 V 电池来完成，方法是用鳄鱼夹夹住 LED 的两个端子。另一个潜在的关键考虑因素是防止加热（在高功率下使用LED时）或漫射光以获得更广泛的照明。为了解决这些考虑因素，LED可以安装在黑匣子外面，内部有"隐私膜"，如 补充图23 和Allen等人5所述。由于该系统的简单性，将其拆开以验证、修改、升级或修复模块化组件并不困难。

诱导基因系统的另一个关键因素是考虑需要多少激活或被控制的生物系统可以接受多少泄漏。如图 6所示，这些可以随报告基因DNA的数量而变化。此外，转染效率以及每个细胞中报告基因构建体的拷贝数也会有所不同。对于某些实验来说，制造具有固定量的报告基因或PhyB基因转换组分的细胞系并筛选具有所需诱导表达范围的克隆可能是有利的，就像药物诱导系统通常所做的那样。由于慢病毒质粒pPK-2304的大小和不稳定性，我们还在pcDNA骨架pPK-351（Addgene #157921）和pPK-352（Addgene #157922）中制作了PhyB开关的非慢病毒质粒版本。

通过按照该协议构建此LED照明系统，用户拥有在体外和体内进行各种光遗传学实验所需的所有组件。结合在哺乳动物细胞中使用PhyB-PIF3的说明，该协议将允许非工程师和生物学家灵活有效地在各种情况下使用基于PhyB的光遗传学。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢Yingxiao （Peter） Wang，Ziliang Huang和Molly Allen在开发过程中测试了不同版本的LED系统。这项工作得到了加州大学圣地亚哥分校Kavli脑与心研究所和索尔克研究所，国家科学基金会通过NSF信息科学中心在Grant CCF-0939370，NIH Grant NS060847和NIH Grant R21DC018237下的支持。

材料

本文使用的材料清单
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设备名称
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Dremil 切割和研磨工具AmazonDremel 200-1/15任何类似的 Dremil 都可以。
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