本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
生理电场（EF）在细胞迁移、分化、分裂和死亡过程中发挥着重要作用。本文介绍了一种用于长期细胞分化研究的显微镜下微流控细胞培养系统。该微流控系统主要包括以下核心组件：光学透明的电趋化芯片、透明氧化铟锡（ITO）加热器、培养基填充泵、电源、高频功率放大器、电场多路复用器、可编程的X-Y-Z电动载物台，以及配备数字相机的倒置相差显微镜。该微流控系统有助于简化整体实验装置，从而减少试剂和样品的消耗。本研究涉及通过直流（DC）脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）的分化。在干细胞维持培养基中，小鼠NPCs（mNPCs）经直流脉冲刺激后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明，简单的直流脉冲处理能够调控mNPCs的细胞命运，并有望用于开发神经系统疾病治疗策略。该系统可用于多通道细胞培养、长期电场刺激、细胞形态观察以及自动延时图像采集。该微流控系统不仅缩短了实验所需时间，还提高了对微环境控制的精确性。
引言
神经前体细胞（NPCs，也称为神经干细胞和祖细胞）可作为神经退行性疾病治疗策略的潜在候选方案1。未分化的NPCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及增殖能力2,3。先前的研究报道，细胞外基质和分子介质可调控NPC的分化。表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够促进NPC的增殖，从而维持其未分化状态4。
既往研究报道，电刺激可调控细胞的生理活动，如分裂5、迁移6,7,8、分化1,9,10以及细胞死亡11。电场（EFs）在中枢神经系统发育与再生过程中发挥着重要作用12,13
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方案
1. MOE芯片的设计与制备
- 使用合适的软件绘制单个聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层和双面胶带的图案（图1A，材料表）。使用CO2激光切割机对PMMA板材和双面胶带进行切割（图1B）。
- 开启CO2激光刻划仪并将其连接至个人计算机。使用相应软件打开设计好的图案文件。
- 将PMMA板材（275 mm × 400 mm）或双面胶带（210 mm × 297 mm）放置在激光刻划仪的工作台上（图2A）。使用自动对焦工具将激光聚焦于PMMA板材或双面胶带表面。
- 选择激光刻划仪作为打印机，然后“打印”图案，启动激光在PMMA板材或双面胶带上直接进行刻蚀，获得所需的单个图案（图2B）。
- 从PMMA板材上移除保护膜，并使用氮气清洁表面。
注：PMMA图案的绘制与PMMA板材的直接加工依据先前报道的方法进行17。 - 为将多层PMMA板材粘合，将三片1 mm厚的PMMA板材（第1、2、3层）堆叠，在热压键合机中于110 °C、5 ....
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结果
MOE芯片的详细构型如图1所示。该微流控芯片为缩小实验装置尺寸、减少样品体积和试剂用量提供了一种有效的方法。MOE芯片设计用于在单次研究中同时进行三个独立的电场刺激实验以及多种免疫染色条件的检测（图3）。此外，MOE芯片具有高光学透明性，适用于共聚焦显微镜检测。该芯片还可在单次实验中同时研究不同细胞培养条件（例如多种电场刺激、多种药物、不同包被基质、多系列细胞）的影响。
将mNPCs暴露于方波直流脉冲（强度为300 mV/mm，频率为100 Hz）中，并持续刺激48小时。随后，使用Tuj1（神经元特异性III类β-微管蛋白）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，用于鉴定星形胶质细胞）以及少突胶质细胞标志物O4对分化后的细胞进行免疫染色。直流脉冲处理后，在DIV 7时，mNPCs中表达神经元（Tuj1+细胞）的数量显著增加。在DIV 3时，刺激.......
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讨论
在制备MOE芯片过程中，使用快干型氰基丙烯酸酯胶水将接头固定在MOE芯片的第一层上。胶水涂抹于接头的四个角落，然后对接头均匀施加压力。必须避免使用过量胶水，以确保胶水完全聚合。此外，将组装完成的MOE芯片置于真空腔室中孵育。此步骤有助于去除聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层、双面胶带和盖玻片之间的气泡。
选择电极材料的依据是，培养基中大量存在的氯离子是流经细胞培养区域的电解产物。在电场刺激实验过程中，电极周围的pH值保持恒定。若采用铂（Pt）作为电极材料的简单构型，会电解水并在正极和负极分别产生氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-），从而引起培养区域的pH值变化。避免使用铂电极可规避电场刺激实验中pH值变化的问题。
在制备盐桥网络时，热的琼脂糖和无气泡的琼脂糖至关重要。热琼脂糖具有较高的流动性，可轻松注入盐桥网络中。将3%的热琼脂糖注入鲁尔锁接头后，立即将鲁尔锁注射器连接到该接头上。此步骤中，琼脂糖会被推入鲁尔锁注射器内，从而实现盐桥网络无气泡的牢固连接。盐桥中的气泡会增加电阻力，导致无法.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢中国台湾中央研究院生物医学科学研究所唐克·唐教授在提供小鼠神经干细胞和祖细胞（mNPCs）方面给予的帮助。作者还感谢唐克·唐教授和李英珊女士就mNPCs分化问题提出的宝贵讨论意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mm PMMA基底（第1-3层） | BHT | K2R20 | 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL 塑料管 | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | 带盖锥形底管，已组装，预灭菌 |
| 3 mL注射器 | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL 口服注射器，无针头 |
| 3 mm 光学级 PMMA（第 5 层） | 奇美实业股份有限公司 | ACRYPOLY PMMA 板材 | 光学级PMMA |
| 三通旋塞阀 | NIPRO | NCN-3L | 无菌一次性三通旋塞阀 |
| 5 mL 注射器 | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL 口服注射器，无针头 |
| 适配器 | 东中有限公司 | 定制化 | PMMA 适配器 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | 低熔点琼脂糖 |
| 放大器 | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | 高压放大器 |
| AutoCAD 软件 | Autodesk | 教育版 | 起草 |
| B-27添加剂 | Gibco | 12587-010 | B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Peprotech | AF-100-18B | 又称重组人碱性成纤维细胞生长因子 |
| 黑色橡胶塞 | TERUMO | DVR-3413 | 从3 mL口服注射器（无针头）中 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | B4287 | 封闭剂 |
| 离心 | HSIANGTAI | CV2060 | 离心 |
| CO2 激光划片机 | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | 购自 http://www.lttcorp.com/index.htm |
| 锥形连接器 | IDEX Health &与科学 | F-120X | 一体式手拧接头，10-32 锥形螺纹，适用于 1/16" OD自然值 |
| 锥形-鲁尔接头 | IDEX Health &与科学 | P-659 | Luer 接头 10-32 母型转母型 Luer，PEEK材质 |
| 共聚焦荧光显微镜 | 徕卡显微系统 | TCS SP5 | Leica TCS SP5 用户手册，http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| 数码相机 | OLYMPUS | E-330 | 自动延时图像采集 |
| 数字示波器 | Tektronix | TDS2024 | 随时间测量电子电路或元件中的电压或电流信号，以显示其幅度和频率。 |
| 双面胶带 | 3M | PET 8018 | 购自 http://en.thd.com.tw/ |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物） | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12，粉末，含 HEPES |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 21600010 | DPBS，粉末，无钙，无镁 |
| EF多路复用器 | Asiatic Sky有限公司 | 定制化 | 监测并控制各个通道中的电流 |
| 表皮生长因子（EGF） | Peprotech | AF-100-15 | 又称重组人表皮生长因子 |
| 快速作用的氰基丙烯酸酯胶水 | 3M | 7004T | 瞬间强力胶（液体） |
| 平底连接器 | IDEX Health &与科学 | P-206 | 无法兰阳螺母，Delrin材质，1/4-28平底，适用于1/16" OD 蓝色 |
| 函数发生器 | 安捷伦科技 | 33120A | 高性能15 MHz合成器 函数发生器 内置任意波形生成功能 |
| 山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150117 | 山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488）预吸附 |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam | ab150086 | 山羊抗兔IgG多克隆二抗 - H&L（Alexa Fluor 555），预吸附 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 细胞核染色 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | 1.48v | 分析荧光图像 |
| 铟–锡–氧化铟锡（ITO）玻璃 | 默克 | 300739 | 用于ITO加热器 |
| 倒置相差显微镜 | OLYMPUS | CKX41 | 用于细胞形态观察 |
| K型热电偶 | Tecpel | TPK-02A | 温度 热电偶 |
| 鲁尔接头 | IDEX Health &与科学 | P618-01 | 鲁尔接头，雌性鲁尔接头转1/4-28雄性聚丙烯 |
| 鲁尔锁式注射器 | TERUMO | DVR-3413 | 用于琼脂盐桥 |
| 小鼠抗GFAP | eBioscience | 14-9892 | 星形胶质细胞标志物 |
| 少突胶质细胞 标记物 O4 抗体 | R&D Systems | MAB1326 | 少突胶质细胞标志物 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | P6148 | 固定 试剂 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 基础生命 | BL2651 | 洗涤液 |
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | SIGMA | P4707 | 包被液 |
| 精密盖玻片厚度 No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| 可编程X-Y-Z电动载物台 | 谭连公司 | 定制化 | 购自 http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| 成比例的–完整的–比例-积分-微分（PID）控制器 | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | 温度控制器 |
| PTFE 管 | Professional Plastics Inc. 中国台湾分公司 | 外径 1/16 英寸 | 白色半透明聚四氟乙烯管 |
| 兔抗 Tuj1 | Abcam | ab18207 | 神经元标记物 |
| 注射泵 | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 可编程单通道注射泵 |
| TFD4 去垢剂 | FRANKLAB | TFD4 | 盖玻片清洁剂 |
| 热压键合机 | Kuan-MIN Tech 公司 | 定制化 | 购自 http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 透化溶液 |
| 超声波清洗机 | LEO | LEO-300S | 超声波灭菌清洗器 |
| 真空室 | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | 真空干燥箱 |
| 白色指旋插头 | IDEX Health &与科学 | P-316 | 1/4-28 平底，https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
参考文献
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133(2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orient....
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