本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。
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摘要
摘要
生理电场（EF）在细胞迁移、分化、分裂和死亡过程中发挥着重要作用。本文介绍了一种用于长期细胞分化研究的显微镜下微流控细胞培养系统。该微流控系统主要包括以下核心组件：光学透明的电趋化芯片、透明氧化铟锡（ITO）加热器、培养基填充泵、电源、高频功率放大器、电场多路复用器、可编程的X-Y-Z电动载物台，以及配备数字相机的倒置相差显微镜。该微流控系统有助于简化整体实验装置，从而减少试剂和样品的消耗。本研究涉及通过直流（DC）脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）的分化。在干细胞维持培养基中，小鼠NPCs（mNPCs）经直流脉冲刺激后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明，简单的直流脉冲处理能够调控mNPCs的细胞命运，并有望用于开发神经系统疾病治疗策略。该系统可用于多通道细胞培养、长期电场刺激、细胞形态观察以及自动延时图像采集。该微流控系统不仅缩短了实验所需时间，还提高了对微环境控制的精确性。
引言
神经前体细胞（NPCs，也称为神经干细胞和祖细胞）可作为神经退行性疾病治疗策略的潜在候选方案1。未分化的NPCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及增殖能力2,3。先前的研究报道，细胞外基质和分子介质可调控NPC的分化。表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够促进NPC的增殖，从而维持其未分化状态4。
既往研究报道，电刺激可调控细胞的生理活动，如分裂5、迁移6,7,8、分化1,9,10以及细胞死亡11。电场（EFs）在中枢神经系统发育与再生过程中发挥着重要作用12,13,14。2009年至2019年期间，本实验室在微流控系统中研究了细胞对电场刺激的应用响应1,6,7,8,15,16,17。设计了一种多通道、光学透明的趋电性（MOE）芯片，适用于共聚焦显微镜下的免疫荧光染色。该芯片具有高光学透明性和良好的耐用性，可在单次实验中同时进行三个独立的刺激实验以及多种免疫染色条件的检测。微流控系统有助于简化整体实验装置，从而减少试剂和样品的消耗。本文描述了一种用于长期细胞分化研究的微流控细胞培养系统的开发过程。
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方案
1. MOE芯片的设计与制备
- 使用合适的软件绘制单个聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层和双面胶带的图案（图1A，材料表）。使用CO2激光切割机对PMMA板材和双面胶带进行切割（图1B）。
- 开启CO2激光刻划仪并将其连接至个人计算机。使用相应软件打开设计好的图案文件。
- 将PMMA板材（275 mm × 400 mm）或双面胶带（210 mm × 297 mm）放置在激光刻划仪的工作台上（图2A）。使用自动对焦工具将激光聚焦于PMMA板材或双面胶带表面。
- 选择激光刻划仪作为打印机，然后“打印”图案，启动激光在PMMA板材或双面胶带上直接进行刻蚀，获得所需的单个图案（图2B）。
- 从PMMA板材上移除保护膜，并使用氮气清洁表面。
注：PMMA图案的绘制与PMMA板材的直接加工依据先前报道的方法进行17。 - 为将多层PMMA板材粘合，将三片1 mm厚的PMMA板材（第1、2、3层）堆叠，在热压键合机中于110 °C、5 kg/cm2压力下压合30分钟，形成流体/电刺激通道组件（图2C）。
注：不同批次的商品化PMMA板材的玻璃化转变温度（Tg）略有差异。最佳键合温度需在接近Tg的范围内以5 °C为增量进行测试确定。 - 使用快干型氰基丙烯酸酯胶将12个接头粘接到MOE芯片组件第1层的各个开口处。
注：接头由PMMA通过注塑成型制成，底部的平面用于与MOE芯片连接。带有1/4W-28内螺纹的接头可用于连接白色手紧接头、平底连接器或鲁尔接头。使用快干型氰基丙烯酸酯胶时需谨慎，避免溅入眼睛。 - 在组装芯片前，使用紫外（UV）照射对1 mm PMMA基底（第1–3层）、双面胶带（第4层）以及3 mm光学级PMMA（第5层）进行30分钟的消毒处理（图1A）。
- 将1 mm PMMA基底（第1–3层）通过双面胶带（第4层）粘接到3 mm光学级PMMA（第5层）上，完成PMMA组件（第1–5层）的组装（图1A）。
- 为芯片组装准备洁净的盖玻片。
- 在染色缸中加入稀释十倍的清洗剂（参见材料表），并将盖玻片置于其中，使用超声波清洗器清洗15分钟。
- 在流动的自来水下彻底冲洗染色缸，以去除所有清洗剂残留。
- 继续用去离子水冲洗以去除自来水残留，并重复步骤1.7.2两次。
- 使用氮气吹干已清洗的盖玻片。
- 在生物安全柜内，使用紫外（UV）照射对PMMA组件（第1–5层）、双面胶带（第6层）以及盖玻片（第7层）进行30分钟的消毒处理，然后进行芯片组装（图1A）。
- 将已清洁的盖玻片（第7层）通过双面胶带（第6层）粘接到PMMA组件（第1–5层）上（图1A）。
- 将MOE芯片置于真空干燥箱中过夜孵育；随后使用该MOE芯片组件进行后续实验操作（图3）。
2. 在细胞培养区域的基底上包被聚-L-赖氨酸（PLL）
- 准备聚四氟乙烯管、平底连接器、锥形连接器、锥形-鲁尔接头、白色指旋塞（也称为塞子）、鲁尔接头、鲁尔锁注射器和黑色橡胶塞（图4A，材料表）。将上述所有组件在121 °C下高压灭菌30分钟。
- 使用白色指旋塞密封琼脂桥接头的开口（图1A）。通过培养基进样口和出样口接头将平底连接器连接到MOE芯片组件上（图4B）。将锥形-鲁尔接头连接至三通旋塞阀。
- 使用连接至培养基进样口三通旋塞阀的3 mL注射器加入2 mL的0.01% PLL溶液（图4B-
）。 - 将一个空的3 mL注射器连接至培养基出样口的三通旋塞阀（图4B-
）。 - 用PLL溶液填充细胞培养区域。手动缓慢地来回推动包被溶液。关闭两个三通旋塞阀，使溶液密封在培养区域内。
- 将MOE芯片置于充满5% CO2气氛的培养箱中，在37 °C下孵育过夜。
3. 盐桥网络的制备
- 完成步骤 2.6 后，打开两个三通旋塞，使用两个注射器在通道内手动来回推动包被溶液，以冲洗掉通道中的气泡。
- 将 3 mL 完全培养基（干细胞维持培养基，包含 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham 营养混合物 F-12 (DMEM/F12)、2% B-27 添加剂、20 ng/mL EGF 和 20 ng/mL bFGF）吸入一个连接至培养基入口三通旋塞的 3 mL 注射器中（图 4B- 和 图 4B-
）。 - 加入 3 mL 完全培养基，以替换细胞培养区域中的包被溶液。将一个空的 5 mL 注射器连接至培养基出口的三通旋塞（图 4B-
）。 - 制备盐桥网络（图 5）。
- 切割黑色橡胶塞以形成缝隙，将银（Ag）/氯化银（AgCl）电极穿过黑色橡胶塞并插入鲁尔锁注射器中（图 4A）。
- 用鲁尔接头替换白色手紧塞，并注入 3% 热琼脂糖以填充鲁尔接头。
注：制备热琼脂糖时，将 3 g 琼脂糖粉末溶解于 100 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。 - 将鲁尔锁注射器连接至鲁尔接头。使用带针头的注射器通过黑色橡胶塞注入 3% 热琼脂糖，以填充鲁尔锁注射器。让琼脂糖冷却并凝固 10 至 20 分钟。
注：为了增加琼脂糖的体积容量，将鲁尔锁注射器安装在鲁尔接头上（图 4 和 图 5）。然后将较大的电极插入鲁尔锁注射器中。该电极能够为长期实验提供稳定的电刺激。
4. mNPCs 的制备
- 在含有5% CO2的培养箱中，于37 °C条件下，将mNPCs1在完全培养基中接种于25T细胞培养瓶中进行培养。每3-4天传代一次，并使用从原始来源传代3-8次的细胞进行所有实验。
- 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在100 × g条件下离心5分钟以沉淀神经球。吸除上清液，并用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤神经球，随后在100 × g条件下再次离心5分钟。
- 吸除1× DPBS，然后将神经球重悬于完全培养基中，充分而轻柔地混匀。
- 使用1 mL注射器吸取1 mL神经球悬液，并将其加入出口三通旋塞中（图4B-）。
5. 用于直流脉冲刺激的微流控系统设置（图6）
- 将接种细胞的 MOE 芯片安装到固定在可编程 X-Y-Z 电动平台上的透明 ITO 加热器上。
注意：ITO 表面温度由比例-积分-微分控制器控制，并维持在 37 °C。将 K 型热电偶夹在芯片与 ITO 加热器之间，用于监测芯片内细胞培养区域的温度。MOE 芯片安装在可编程 X-Y-Z 电动平台上，适用于在各个通道截面进行自动延时图像采集。ITO 加热器的制备及细胞培养加热系统的设置此前已有描述18,19。 - 通过手动泵送方式，将 mNPCs 经由培养基出口注入 MOE 芯片中。将接种细胞的 MOE 芯片在 37 °C 的 ITO 加热器上孵育 4 小时。
- 4 小时后，使用注射泵以 20 µL/h 的流速经由培养基入口向 MOE 芯片中泵入完全培养基。
注意：在施加电场刺激前，mNPCs 在芯片中继续培养并维持 24 小时，以促进细胞贴附与生长。废液被收集至连接在出口三通旋塞上的空 5 mL 注射器中，如图 6A中“waste”所示。MOE 微流控系统配置如图 6所示。该微流控系统可为细胞持续提供营养物质。新鲜完全培养基持续泵入 MOE 芯片，以维持恒定的 pH 值。因此，细胞可在 CO2 培养箱外进行培养。 - 使用导线将电场多路复用器通过芯片上的 Ag/AgCl 电极连接至 MOE 芯片。将电场多路复用器和函数发生器连接至放大器，输出幅值为 300 mV/mm、频率为 100 Hz、占空比为 50%（50% 开启时间与 50% 关闭时间）的方波直流脉冲（图 6B）。
- 将导线连接至电场多路复用器。通过芯片上的 Ag/AgCl 电极将导线连接至 MOE 芯片。
- 使用导线将电场多路复用器连接至放大器。将函数发生器连接至放大器和数字示波器。
注意：电场多路复用器是一种电路，其将培养室的阻抗纳入电路中，并将所有独立培养室连接成并联电子网络。每个三个培养室在电路中依次串联一个可变电阻（Vr）和一个电流表（如图 6A中 µA 所示）。通过调节 Vr 控制流经每个培养室的电流，电流值显示在对应的电流表上。各细胞培养区域中的电场强度根据欧姆定律 I = σEA 计算，其中 I 为电流，σ（DMEM/F12 的设定值为 1.38 S·m-120）为培养基的电导率，E 为电场，A 为电趋化室的横截面积。对于图 1所示的细胞培养区域尺寸，直流电场和占空比为 50% 的直流脉冲电场下的电流分别约为 87 mA 和 44 mA。
- 对 mNPCs 施加幅值为 300 mV/mm、频率为 100 Hz 的方波直流脉冲，持续 48 小时。以 10 µL/h 的速率持续泵入完全培养基，为细胞提供充足的营养，并维持培养基中恒定的 pH 值。
6. 脉冲直流电刺激后 mNPCs 的免疫荧光检测
注意：在此步骤中，所有试剂均通过中等入口使用注射泵输送。
- 接种后体外培养 3、7 或 14 天（DIV）1，用1×PBS以设定的流速冲洗细胞 25 µL/min 20 分钟。
- 用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞。以一定流速将4% PFA泵入芯片中 25 µL/min 20分钟，以置换1×PBS。为置换4%PFA，以1×PBS在流速下洗涤细胞 25 µL/min 20 分钟。
- 以 0.1% Triton X-100 溶液注入芯片，流速为 50 µL/min 6 分钟以透化细胞。将流速降低至 50 µL/h 再孵育30分钟以与细胞充分反应。为替换0.1% Triton X-100，以1x PBS在设定流速下洗涤细胞 50 µL/min 6 分钟。
- 用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭细胞，以减少非特异性抗体结合。以一定流速将1% BSA泵入芯片 50 µL/min 6 分钟。降低流速至 100 µL/h 并泵送1小时。
- 以一定流速将用于双重免疫染色的抗体泵入芯片 50 µL/min 6 分钟，并将芯片在 18 小时内孵育 4 °C用1×PBS以一定的流速洗涤细胞 50 µL/min 15 分钟。
- 以一定流速将Alexa Fluor标记的二抗泵入芯片中 50 µL/min 6 分钟。降低流速至 50 µL/h，于室温避光泵入抗体孵育1小时。以1x PBS按设定流速清洗细胞 50 µL/min 15 分钟。
- 用于细胞核染色，以一定流速将 Hoechst 33342 泵入芯片中 20 µL/min 在室温避光条件下孵育10分钟。以1x PBS按流速 50 µL/min 15分钟。
- 免疫染色后，使用共聚焦荧光显微镜观察细胞。
7. 图像分析与数据处理
- 使用带有内置测量工具的软件分析荧光图像（参见材料表）。
- 比较对照组和处理组中经Hoechst复染的细胞核（细胞总数），并计算表达每种表型标志物的细胞百分比。
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结果
MOE芯片的详细构型如图1所示。该微流控芯片为缩小实验装置尺寸、减少样品体积和试剂用量提供了一种有效的方法。MOE芯片设计用于在单次研究中同时进行三个独立的电场刺激实验以及多种免疫染色条件的检测（图3）。此外，MOE芯片具有高光学透明性，适用于共聚焦显微镜检测。该芯片还可在单次实验中同时研究不同细胞培养条件（例如多种电场刺激、多种药物、不同包被基质、多系列细胞）的影响。
将mNPCs暴露于方波直流脉冲（强度为300 mV/mm，频率为100 Hz）中，并持续刺激48小时。随后，使用Tuj1（神经元特异性III类β-微管蛋白）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，用于鉴定星形胶质细胞）以及少突胶质细胞标志物O4对分化后的细胞进行免疫染色。直流脉冲处理后，在DIV 7时，mNPCs中表达神经元（Tuj1+细胞）的数量显著增加。在DIV 3时，刺激...
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讨论
在制备MOE芯片过程中，使用快干型氰基丙烯酸酯胶水将接头固定在MOE芯片的第一层上。胶水涂抹于接头的四个角落，然后对接头均匀施加压力。必须避免使用过量胶水，以确保胶水完全聚合。此外，将组装完成的MOE芯片置于真空腔室中孵育。此步骤有助于去除聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层、双面胶带和盖玻片之间的气泡。
选择电极材料的依据是，培养基中大量存在的氯离子是流经细胞培养区域的电解产物。在电场刺激实验过程中，电极周围的pH值保持恒定。若采用铂（Pt）作为电极材料的简单构型，会电解水并在正极和负极分别产生氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-），从而引起培养区域的pH值变化。避免使用铂电极可规避电场刺激实验中pH值变化的问题。
在制备盐桥网络时，热的琼脂糖和无气泡的琼脂糖至关重要。热琼脂糖具有较高的流动性，可轻松注入盐桥网络中。将3%的热琼脂糖注入鲁尔锁接头后，立即将鲁尔锁注射器连接到该接头上。此步骤中，琼脂糖会被推入鲁尔锁注射器内，从而实现盐桥网络无气泡的牢固连接。盐桥中的气泡会增加电阻力，导致无法...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢中国台湾中央研究院生物医学科学研究所唐克·唐教授在提供小鼠神经干细胞和祖细胞（mNPCs）方面给予的帮助。作者还感谢唐克·唐教授和李英珊女士就mNPCs分化问题提出的宝贵讨论意见。
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材料
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