方法文章

微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

DOI：

10.3791/61917

⸱

2021年4月14日

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生理电场（EF）在细胞迁移、分化、分裂和死亡过程中发挥着重要作用。本文介绍了一种用于长期细胞分化研究的显微镜下微流控细胞培养系统。该微流控系统主要包括以下核心组件：光学透明的电趋化芯片、透明氧化铟锡（ITO）加热器、培养基填充泵、电源、高频功率放大器、电场多路复用器、可编程的X-Y-Z电动载物台，以及配备数字相机的倒置相差显微镜。该微流控系统有助于简化整体实验装置，从而减少试剂和样品的消耗。本研究涉及通过直流（DC）脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）的分化。在干细胞维持培养基中，小鼠NPCs（mNPCs）经直流脉冲刺激后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明，简单的直流脉冲处理能够调控mNPCs的细胞命运，并有望用于开发神经系统疾病治疗策略。该系统可用于多通道细胞培养、长期电场刺激、细胞形态观察以及自动延时图像采集。该微流控系统不仅缩短了实验所需时间，还提高了对微环境控制的精确性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经前体细胞（NPCs，也称为神经干细胞和祖细胞）可作为神经退行性疾病治疗策略的潜在候选方案1。未分化的NPCs具有自我更新能力、多向分化潜能以及增殖能力2,3。先前的研究报道，细胞外基质和分子介质可调控NPC的分化。表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能够促进NPC的增殖，从而维持其未分化状态4。

既往研究报道，电刺激可调控细胞的生理活动，如分裂5、迁移6,7,8、分化1,9,10以及细胞死亡11。电场（EFs）在中枢神经系统发育与再生过程中发挥着重要作用12,13,14。2009年至2019年期间，本实验室在微流控系统中研究了细胞对电场刺激的应用响应1,6,7,8,15,16,17。设计了一种多通道、光学透明的趋电性（MOE）芯片，适用于共聚焦显微镜下的免疫荧光染色。该芯片具有高光学透明性和良好的耐用性，可在单次实验中同时进行三个独立的刺激实验以及多种免疫染色条件的检测。微流控系统有助于简化整体实验装置，从而减少试剂和样品的消耗。本文描述了一种用于长期细胞分化研究的微流控细胞培养系统的开发过程。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MOE芯片的设计与制备

  1. 使用适当的软件绘制单个聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层和双面胶带的图案（图1A，材料表）。使用CO2激光刻划机对PMMA板材和双面胶带进行切割（图1B）。
    1. 打开CO2激光刻划机并将其连接至个人计算机。使用相应软件打开设计好的图案文件。
    2. 将PMMA板材（275 mm × 400 mm）或双面胶带（210 mm × 297 mm）放置在激光刻划机的工作台上（图2A）。使用自动对焦工具将激光聚焦到PMMA板材或双面胶带的表面。
    3. 选择激光刻划机作为打印机，然后“打印”图案，启动激光对PMMA板材或双面胶带的直接烧蚀，从而获得PMMA板材或胶带上的独立图案（图2B）。
  2. 从PMMA板材上移除保护膜，并使用氮气清洁表面。
    注：PMMA图案的绘制与PMMA板材的直接加工依据先前报道的方法进行17。
  3. 为将多层PMMA板材粘合在一起，堆叠三片1 mm厚的PMMA板材（第1、2、3层），在热压机中以5 kg/cm2的压力、110 °C条件下加热30分钟，形成流体/电刺激通道组件（图2C）。
    注：不同批次的商用PMMA板材玻璃化转变温度（Tg）略有差异。应在接近Tg的温度下以5 °C为增量测试最佳粘合温度。
  4. 使用快干型氰基丙烯酸酯胶将12个接头粘接到MOE芯片组件第1层的各个开口处。
    注：接头由PMMA通过注塑成型制成。底部的平面用于连接MOE芯片。带有1/4W-28内螺纹的接头可用于连接白色手紧插头、平底连接器或鲁尔接头。使用快干型氰基丙烯酸酯胶时需小心，避免溅入眼睛。
  5. 在组装芯片前，使用紫外（UV）照射对1 mm PMMA基底（第1–3层）、双面胶带（第4层）以及3 mm光学级PMMA（第5层）进行30分钟的消毒处理（图1A）。
  6. 使用双面胶带（第4层）将1 mm PMMA基底（第1–3层）粘接到3 mm光学级PMMA（第5层）上，完成PMMA组件（第1–5层）的组装（图1A）。
  7. 为芯片组装准备洁净的盖玻片。
    1. 在染色缸中加入稀释10倍的洗涤剂（参见材料表），并将盖玻片放入其中，使用超声波清洗器清洗15分钟。
    2. 在流动的自来水下彻底冲洗染色缸，去除所有残留的洗涤剂。
    3. 继续用蒸馏水冲洗以去除自来水残留，并重复步骤1.7.2两次。
    4. 使用氮气吹干清洗后的盖玻片。
  8. 在生物安全柜内，使用紫外照射对PMMA组件（第1–5层）、双面胶带（第6层）以及盖玻片（第7层）进行30分钟的消毒处理，然后进行芯片组装（图1A）。
  9. 使用双面胶带（第6层）将清洁后的盖玻片（第7层）粘接到PMMA组件（第1–5层）上（图1A）。
  10. 将MOE芯片置于真空干燥箱中过夜孵育；随后使用MOE芯片组件进行后续实验操作（图3）。

2. 在细胞培养区域的基底上包被多聚-L-赖氨酸（PLL）

  1. 准备聚四氟乙烯管、平底连接器、锥形连接器、锥形-鲁尔接头、白色指旋塞（也称为塞子）、鲁尔接头、鲁尔锁注射器和黑色橡胶塞（图4A，材料表）。将上述所有组件在121 °C下高压灭菌30分钟。
  2. 使用白色指旋塞密封琼脂桥接头的开口（图1A）。通过培养基入口和出口接头将平底连接器连接到MOE芯片组件上（图4B）。将锥形-鲁尔接头连接至三通旋塞阀。
  3. 使用连接至培养基入口三通旋塞阀的3 mL注射器加入2 mL的0.01% PLL溶液（图4B-静力平衡，ΣFx=0示意图，物理概念，力矢量，力学平衡分析）。
  4. 将一个空的3 mL注射器连接至培养基出口的三通旋塞阀（图4B-静力平衡，ΣFx=0方程，平衡示意图，力学研究，力矢量分析）。
  5. 用PLL溶液填充细胞培养区域。手动缓慢地来回推动包被溶液。关闭两个三通旋塞阀，以将溶液密封在培养区域内。
  6. 将MOE芯片置于充满5% CO2气氛的培养箱中，在37 °C下孵育过夜。

3. 盐桥网络的制备

  1. 完成步骤 2.6 后，打开两个三通旋塞，使用两个注射器手动来回推动包被溶液，将通道中的气泡冲洗排出。
  2. 吸取 3 mL 完全培养基（干细胞维持培养基，包含 DMEM/F12 培养基、2% B-27 添加剂、20 ng/mL EGF 和 20 ng/mL bFGF）至一个连接到培养基入口三通旋塞的 3 mL 注射器中（图 4B-静力平衡，ΣFx=0 示意图，物理概念，力矢量，力学平衡分析。 和 图 4B-静力平衡方程 ΣFx=0 示意图；强调物理学教育中的力平衡概念。）。
  3. 加入 3 mL 完全培养基，以替换细胞培养区域中的包被溶液。将一个空的 5 mL 注射器连接至培养基出口的三通旋塞（图 4B-静力平衡，ΣFx=0 示意图，显示力的平衡，箭头指示矢量方向。）。
  4. 制备盐桥网络（图 5）。
    1. 将黑色橡胶塞切开形成缝隙，将银（Ag）/氯化银（AgCl）电极穿过黑色橡胶塞并插入鲁尔锁式注射器中（图 4A）。
    2. 用鲁尔接头替换白色手拧塞，并注入 3% 热琼脂糖以填满鲁尔接头。
      注：制备热琼脂糖时，将 3 g 琼脂糖粉末溶解于 100 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 121 °C 高压灭菌器中灭菌 30 分钟。
    3. 将鲁尔锁式注射器连接至鲁尔接头。使用带针头的注射器通过黑色橡胶塞注入 3% 热琼脂糖，以填满鲁尔锁式注射器。静置 10 至 20 分钟，使琼脂糖冷却并凝固。
      注：为了增加琼脂糖的容量，将鲁尔锁式注射器安装在鲁尔接头上（图 4 和 图 5）。随后将较大的电极插入鲁尔锁式注射器中。该电极能够为长期实验提供稳定的电刺激。

4. mNPCs 的制备

  1. 将mNPCs1在含有完全培养基的25T细胞培养瓶中，于37 °C、5% CO2的培养箱中进行培养。每3-4天传代一次，所有实验均使用从原始来源传代3-8次的细胞。
  2. 将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，在100 × g条件下离心5分钟以沉淀神经球。吸除上清液，并用1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤神经球。再次在100 × g条件下离心5分钟。
  3. 吸除1× DPBS，然后将神经球重悬于完全培养基中，轻轻混匀。
  4. 使用连接至出口三通旋塞的1 mL注射器加入1 mL神经球悬液（图4B-静力平衡，ΣFx=0方程，平衡示意图，力学研究，力矢量分析）。

5. 用于直流脉冲刺激的微流控系统设置（图6）

  1. 将接种细胞的MOE芯片安装到固定在可编程X-Y-Z电动平台上的透明ITO加热器上。
    注意：ITO表面温度由比例-积分-微分控制器控制，并维持在37 °C。将K型热电偶夹在芯片与ITO加热器之间，用于监测芯片内细胞培养区域的温度。MOE芯片安装在可编程X-Y-Z电动平台上，适用于在各个通道截面进行自动延时图像采集。ITO加热器的制备及细胞培养加热系统的设置此前已有描述18,19。
  2. 通过手动泵送，将mNPCs经由培养基出口注入MOE芯片中。将接种细胞的MOE芯片在37 °C的ITO加热器上孵育4小时。
  3. 4小时后，使用注射泵以20 µL/h的流速经由培养基入口向MOE芯片中泵入完全培养基。
    注意：在施加电场刺激前，mNPCs在芯片中继续培养并维持24小时，以促进细胞贴附与生长。废液被收集至连接于出口三通旋塞的空5 mL注射器中，如图6A中“waste”所示。MOE微流控系统配置如图6所示。该微流控系统可为细胞持续提供营养物质。新鲜完全培养基持续泵入MOE芯片，以维持恒定的pH值。因此，细胞可在CO2培养箱外进行培养。
  4. 使用导线将电场多路复用器通过芯片上的Ag/AgCl电极连接至MOE芯片。将电场多路复用器和函数发生器连接至放大器，输出幅值为300 mV/mm、频率为100 Hz、占空比为50%（50%开启时间与50%关闭时间）的方波直流脉冲（图6B）。
    1. 将导线连接至电场多路复用器。通过芯片上的Ag/AgCl电极将导线连接至MOE芯片。
    2. 使用导线将电场多路复用器连接至放大器。将函数发生器连接至放大器和数字示波器。
      注意：电场多路复用器是一种电路，其将培养室的阻抗纳入电路中，并将所有独立培养室连接成并联电子网络。每个三个培养室在电路中依次串联一个可变电阻（Vr）和一个电流表（如图6A中µA所示）。通过调节Vr来改变流经每个培养室的电流，电流值显示在对应的电流表上。各细胞培养区域中的电场强度根据欧姆定律I = σEA计算，其中I为电流，σ（对于DMEM/F12设定为1.38 S·m-120）为培养基的电导率，E为电场，A为电趋化室的横截面积。对于图1所示的细胞培养区域尺寸，直流电场和占空比为50%的直流脉冲电场下的电流分别约为87 mA和44 mA。
  5. 对mNPCs施加幅值为300 mV/mm、频率为100 Hz的方波直流脉冲，持续48小时。以10 µL/h的速率持续泵入完全培养基，为细胞提供充足的营养物质，并维持培养基中恒定的pH值。

6. 脉冲直流电刺激后mNPCs的免疫荧光检测

注意：在此步骤中，所有试剂均通过介质入口使用注射泵泵入。

  1. 接种后在体外培养 3、7 或 14 天（DIV）时，以 25 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 20 分钟1。
  2. 使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞。以 25 µL/min 的流速将 4% PFA 泵入芯片，持续 20 分钟以替换 1× PBS。随后以 25 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 20 分钟，以替换 4% PFA。
  3. 以 50 µL/min 的流速将 0.1% Triton X-100 泵入芯片 6 分钟，以通透细胞。随后将流速降低至 50 µL/h，继续反应 30 分钟。以 50 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 6 分钟，以替换 0.1% Triton X-100。
  4. 使用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 封闭细胞，以减少非特异性抗体结合。以 50 µL/min 的流速将 1% BSA 泵入芯片 6 分钟，随后将流速降低至 100 µL/h，继续泵入 1 小时。
  5. 以 50 µL/min 的流速将用于双重免疫荧光染色的一抗溶液泵入芯片 6 分钟，随后将芯片在 4 °C 下孵育 18 小时。以 50 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 15 分钟。
  6. 以 50 µL/min 的流速将 Alexa Fluor 标记的二抗泵入芯片 6 分钟。随后将流速降低至 50 µL/h，在室温避光条件下继续泵入 1 小时。以 50 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 15 分钟。
  7. 进行细胞核染色时，以 20 µL/min 的流速在室温避光条件下将 Hoechst 33342 泵入芯片 10 分钟。随后以 50 µL/min 的流速用 1× PBS 洗涤细胞 15 分钟。
  8. 完成免疫荧光染色后，使用共聚焦荧光显微镜观察细胞。

7. 图像分析与数据处理

  1. 使用带有内置测量工具的软件分析荧光图像（参见材料表）。
  2. 比较对照组和处理组中经Hoechst复染的细胞核（细胞总数），并计算表达每种表型标志物的细胞百分比。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MOE芯片的详细结构如图1所示。该微流控芯片为缩小实验装置尺寸、减少样品体积和试剂用量提供了一种有效的方法。MOE芯片可在单次研究中同时进行三项独立的电场刺激实验和多种免疫染色条件的检测（图3）。此外，MOE芯片具有高光学透明性，适用于共聚焦显微镜观察。该芯片还设计用于在单次实验中同时研究不同细胞培养条件（例如，多种电场刺激、多种药物、不同包被基质、多系列细胞）的影响。

将mNPCs暴露于方波直流脉冲（强度为300 mV/mm，频率为100 Hz）中，并持续刺激48小时。分化后的细胞使用Tuj1（神经元特异性III类β-微管蛋白）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，用于鉴定星形胶质细胞）以及少突胶质细胞标志物O4进行免疫染色。直流脉冲处理后，在DIV 7时，mNPCs中表达神经元（Tuj1+细胞）的数量显著增加。在DIV 3时，刺激组中星形...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在制备MOE芯片过程中，使用快干型氰基丙烯酸酯胶水将接头固定在MOE芯片的第一层上。胶水涂抹于接头的四个角落，然后对接头均匀施加压力。必须避免使用过量胶水，以确保胶水完全聚合。此外，将组装完成的MOE芯片置于真空腔室中孵育。此步骤有助于去除聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）层、双面胶带和盖玻片之间的气泡。

选择电极材料的依据是，培养基中大量存在的氯离子是流经细胞培养区域的电解产物。在电场刺激实验过程中，电极周围的pH值保持恒定。若采用铂（Pt）作为电极材料的简单构型，会电解水并在正极和负极分别产生氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-），从而引起培养区域的pH值变化。避免使用铂电极可规避电场刺激实验中pH值变化的问题。

在制备盐桥网络时，热的琼脂糖和无气泡的琼脂糖至关重要。热琼脂糖具有较高的流动性，可轻松注入盐桥网络中。将3%的热琼脂糖注入鲁尔锁接头后，立即将鲁尔锁注射器连接到该接头上。此步骤中，琼脂糖会被推入鲁尔锁注射器内，从而实现盐桥网络无气泡的牢固连接。盐桥中的气泡会增加电阻力，导致无法...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢中国台湾中央研究院生物医学科学研究所唐克·唐教授在提供小鼠神经干细胞和祖细胞（mNPCs）方面给予的帮助。作者还感谢唐克·唐教授和李英珊女士就mNPCs分化问题提出的宝贵讨论意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mm PMMA基底（第1-3层）BHTK2R20聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA），http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL 塑料管Protech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TW带盖锥形底管，已组装，预灭菌
3 mL注射器TERUMODVR-34133 mL 口服注射器，无针头
3 mm 光学级 PMMA（第 5 层）奇美实业股份有限公司ACRYPOLY PMMA 板材光学级PMMA
三通旋塞阀NIPRONCN-3L无菌一次性三通旋塞阀
5 mL 注射器TERUMODVR-34105 mL 口服注射器，无针头
适配器东中有限公司定制化PMMA 适配器
琼脂糖Sigma-AldrichA9414低熔点琼脂糖
放大器A.A. Lab Systems LtdA-304高压放大器
AutoCAD 软件Autodesk教育版起草
B-27添加剂Gibco12587-010B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） PeprotechAF-100-18B又称重组人碱性成纤维细胞生长因子
黑色橡胶塞TERUMODVR-3413从3 mL口服注射器（无针头）中
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichB4287封闭剂 
离心HSIANGTAICV2060离心
CO2 激光划片机Laser Tools and Technics Corp. ILS-II购自 http://www.lttcorp.com/index.htm
锥形连接器IDEX Health &与科学F-120X一体式手拧接头，10-32 锥形螺纹，适用于 1/16" OD自然值
锥形-鲁尔接头IDEX Health &与科学P-659Luer 接头 10-32 母型转母型 Luer，PEEK材质
共聚焦荧光显微镜徕卡显微系统TCS SP5Leica TCS SP5 用户手册，http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
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数字示波器TektronixTDS2024随时间测量电子电路或元件中的电压或电流信号，以显示其幅度和频率。
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杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物）Gibco12400024DMEM/F-12，粉末，含 HEPES
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco21600010DPBS，粉末，无钙，无镁
EF多路复用器Asiatic Sky有限公司定制化监测并控制各个通道中的电流
表皮生长因子（EGF）PeprotechAF-100-15又称重组人表皮生长因子
快速作用的氰基丙烯酸酯胶水3M 7004T瞬间强力胶（液体）
平底连接器IDEX Health &与科学P-206无法兰阳螺母，Delrin材质，1/4-28平底，适用于1/16" OD 蓝色
函数发生器安捷伦科技33120A高性能15 MHz合成器 函数发生器 内置任意波形生成功能
山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488）Abcamab150117山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488）预吸附
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555）Abcamab150086山羊抗兔IgG多克隆二抗 - H&L（Alexa Fluor 555），预吸附
Hoechst 33342InvitrogenH3570细胞核染色
ImageJ 软件美国国立卫生研究院1.48v分析荧光图像 
铟–锡–氧化铟锡（ITO）玻璃默克300739用于ITO加热器
倒置相差显微镜OLYMPUSCKX41用于细胞形态观察
K型热电偶TecpelTPK-02A温度 热电偶
鲁尔接头IDEX Health &与科学P618-01鲁尔接头，雌性鲁尔接头转1/4-28雄性聚丙烯
鲁尔锁式注射器TERUMODVR-3413用于琼脂盐桥
小鼠抗GFAPeBioscience14-9892星形胶质细胞标志物
少突胶质细胞  标记物  O4  抗体R&D SystemsMAB1326少突胶质细胞标志物
多聚甲醛（PFA）Sigma-AldrichP6148固定 试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）基础生命BL2651洗涤液
聚-L-赖氨酸（PLL）SIGMAP4707包被液
精密盖玻片厚度 No. 1.5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
可编程X-Y-Z电动载物台谭连公司定制化购自 http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
成比例的–完整的–比例-积分-微分（PID）控制器Toho ElectronicsTTM-J4-R-AB温度控制器 
PTFE 管Professional Plastics Inc. 中国台湾分公司外径 1/16 英寸白色半透明聚四氟乙烯管
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注射泵New Era Systems IncNE-1000NE-1000 可编程单通道注射泵
TFD4 去垢剂FRANKLABTFD4盖玻片清洁剂
热压键合机Kuan-MIN Tech 公司定制化购自 http://kmtco.com.tw/
Triton X-100Sigma-AldrichT8787透化溶液
超声波清洗机LEOLEO-300S超声波灭菌清洗器
真空室DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.DOV-30真空干燥箱
白色指旋插头IDEX Health &与科学P-3161/4-28 平底，https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

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