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方法文章

用于CRISPR/Cas9诱变的沙蝇（Phlebotomus papatasi）胚胎显微注射

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DOI：

10.3791/61924

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2020年11月17日

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1Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2University of Maryland Insect Transformation Facility, The Institute for Bioscience and Biotechnology Research

本文内容

摘要

本方案详细介绍了在白蛉中进行CRISPR/Cas9靶向诱变的步骤：胚胎收集、显微注射、昆虫饲养，以及目标突变的鉴定与筛选。

摘要

沙蝇是利什曼原虫的天然传播媒介 利什曼原虫 物种，由原生动物寄生虫引起，症状范围广泛，从皮肤病变到内脏病理变化不等。解析媒介/寄生虫相互作用的本质对于深入理解具有重要意义 利什曼原虫 传播给宿主。在控制沙蝇传播能力（即其携带和传播病原体的能力）的诸多参数中，沙蝇自身的内在参数被证明起着关键作用。例如，昆虫的免疫反应会影响沙蝇对病原体的传播能力 利什曼原虫此类参数的研究一直受限于缺乏适用于这些非模式生物的基因表达修饰方法。尽管可通过小干扰RNA（siRNA）实现基因下调，但该技术不仅操作上具有挑战性，且仅能导致部分功能丧失，且无法将沉默效应遗传至下一代。近年来，CRISPR/Cas9技术介导的靶向诱变已被应用于 Phlebotomus papatasi 白蛉。该技术可在特定选择的基因位点产生可遗传的突变，从而实现对目标基因的研究。CRISPR/Cas9 系统依赖于诱导靶向的DNA双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源介导修复（HDR）进行修复。NHEJ 是一种简单的断裂闭合过程，常导致小片段的插入或缺失。相比之下，HDR 则利用与靶标DNA具有同源性的供体DNA分子作为修复模板。本文介绍一种利用NHEJ途径进行CRISPR/Cas9靶向诱变的白蛉胚胎显微注射方法，这是迄今为止唯一适用于白蛉媒介的基因组编辑技术。

引言

虫媒疾病是持续演变的重大公共卫生威胁。据世界卫生组织统计，数百种分布于不同系统发育类群（例如蚊子、蜱虫、跳蚤）的媒介生物负责传播大量微生物病原体，每年导致超过70万人死亡。在媒介昆虫中，白蛉亚科的沙蝇（双翅目，毛蚊科）是一个庞大的类群，已确认有80种具有传播能力的沙蝇，它们在不同地理区域分布，表现出不同的表型特征和传病能力。这些沙蝇是利什曼原虫属（Leishmania）原虫寄生虫的传播媒介，每年引起约130万例新发利什曼病病例，以及2万至3万例死亡。利什曼病的临床表现多样，症状范围从自限性皮肤病变到内脏播散，后者若不治疗可导致死亡。

白蛉是完全陆生的昆虫。其生命周期相对于其他双翅目昆虫较长，可持续长达三个月，具体时长取决于温度、湿度和营养等不同参数。该周期包括一个胚胎期（6至11天）、四个幼虫期（总共持续23至25天）和一个蛹期（9至10天），随后经历变态发育成为成虫。白蛉的饲养需要温暖潮湿的环境。雄性和雌性白蛉均以糖类为食，在自然环境中从花蜜中获取营养。只有雌性白蛉吸血，因为它们需要从血液中获取蛋白质以进行卵的发育1。

研究的一个重要方向是明确导致可传播感染形成的媒介/寄生虫相互作用的本质。与其他媒介昆虫类似，白蛉自身的一些内在参数已被证明会影响其媒介能力，媒介能力是指其携带并将病原体传播给宿主的能力。例如，Phlebotomus papatasi 白蛉中肠细胞表达的半乳糖凝集素可作为识别寄生虫表面组分的受体，直接影响其对Leishmania major的媒介能力2,3。昆虫免疫应答通路中的免疫缺陷（IMD）通路，对于Phlebotomus papatasi白蛉对Leishmania major的媒介能力也至关重要4。类似地，媒介昆虫免疫应答通路在调控其传播感染性病原体过程中的关键作用，也在埃及伊蚊（Aedes aegypti）5,6,7、须舌蝇（Glossina morsitans）8以及冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）9,10中被报道过。

由于缺乏适用于这类昆虫的基因表达修饰方法，人们对白蛉与Leishmania（利什曼原虫）相互作用的研究一直受到限制。直到最近，仅有通过小干扰RNA（siRNA）实现的基因下调被成功实施11,12,13,14。该技术因显微注射成年雌虫导致的高死亡率而受限，仅能实现部分功能缺失，且无法将该效应遗传至下一代。

CRISPR/Cas9 技术彻底改变了媒介昆虫等非模式生物的功能基因组学研究。该系统源自原核生物用于抵御噬菌体的适应性免疫系统15,16，现已被迅速改造为一种高效的基因组编辑工具，广泛应用于包括昆虫在内的高等真核生物。CRISPR/Cas9 靶向基因组编辑的原理基于单链向导 RNA（sgRNA）与特定基因组位点之间的序列互补性。Cas9 核酸酶与 sgRNA 结合后，在 sgRNA 与其互补序列配对的基因组 DNA 位置产生双链 DNA（dsDNA）断裂。Cas9-sgRNA 复合物通过 sgRNA 中 17 至 20 个与目标位点互补的碱基引导至靶序列，随后 dsDNA 断裂可通过两种独立的修复途径进行修复：非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）17。NHEJ 修复通常仅简单地连接断裂末端，但常导致小片段的插入或缺失突变。而 HDR 修复则以一段与靶标 DNA 具有同源性的供体 DNA 分子作为修复模板。昆虫体内同时具备这两种修复机制。

CRISPR/Cas9 技术可通过 NHEJ 修复途径在选定的基因座中产生突变；而对于更复杂的基因组编辑策略（例如基因敲入或表达报告系统），则可通过 HDR 途径并结合适当的供体模板实现。在白蛉中，已通过 NHEJ 介导的 CRISPR 技术在 Phlebotomus papatasi4 中成功生成了免疫应答因子 Relish 的无效突变等位基因。在另一项研究中，研究人员向白蛉胚胎注射了靶向编码 Yellow 蛋白基因的 CRISPR/Cas9 混合物，但仍未能获得携带该突变的成虫18。本文详细描述了一种通过 NHEJ 介导的 CRISPR/Cas9 技术实现白蛉靶向诱变的方法，特别聚焦于胚胎显微注射这一关键实验步骤。

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方案

使用小鼠血液作为白蛉饲喂来源的操作严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议。该方案已获得NIH国家过敏与传染病研究所（NIAID）动物护理与使用委员会的批准（方案编号：LPD 68E）。无脊椎动物不在NIH指南的适用范围内。

1. 针头准备（图1）

  1. 按照 Meuti 和 Harrell19 所述方法拉制针头并进行斜面处理。简而言之，使用双级玻璃微电极拉制仪拉制针头，并采用硼硅酸盐玻璃毛细管。
  2. 使用超细磨石在微电极斜面仪上通过湿法斜面处理对针头进行 sharpening。

2. 胚胎采集与显微操作（图2）

  1. 在注射日前五天，对雌性白蛉进行血饲，操作方法与常规种群维持时相同。关于白蛉种群的饲养流程及所需材料的详细信息，请参见 Lawyer 等人1。在整个发育期间，将昆虫置于培养箱中，保持 70% 湿度和 26 °C 的环境。
    1. 血饲后一天，使用带侧孔的石膏筒，以每组 100–150 只的方式捕获已血饲的雌虫。通过提供糖溶液（30% 蔗糖——足够浸透一小团棉球的量）喂养雌虫，该方法为种群维持的常规操作。
  2. 血饲后第 2–3 天，切勿润湿石膏筒。将雌虫保持在干燥基质上可防止其过早产卵，因为雌虫更倾向于在湿润环境中产卵。
  3. 血饲后第 5 天，进行胚胎收集、显微操作和显微注射。将一张湿润的滤纸放入产卵室中。新产下的胚胎尚未形成完整的卵壳，呈白色。操作过程中使用黑色滤纸，以便更清晰地观察白色胚胎。
  4. 使用口吸器通过侧孔将一小群雌虫从石膏筒转移至产卵室。湿润基质（即滤纸）的存在可诱导雌虫产卵。
  5. 30–60 分钟后，小心地从产卵室中取出带有新产胚胎的滤纸。将滤纸和胚胎置于培养皿中，最多保存 3 小时。在此期间，定期检查滤纸的湿润程度，确保其保持湿润。同时，重复步骤 2.4 至 2.6，使用新的雌虫组收集尽可能多的胚胎。
  6. 准备用于注射的显微镜载玻片：使用极细的画笔手动逐个收集卵，并小心地将其转移至另一张放置在载玻片上的湿润黑色滤纸上，载玻片上方覆盖盖玻片。
    1. 向滤纸添加适量水，以保持胚胎湿润，但避免胚胎漂浮离开盖玻片或被吸入盖玻片下方。将胚胎沿盖玻片边缘排成一行。盖玻片可作为阻挡物，防止注射过程中胚胎滚动移位。

3. 胚胎注射（图3）

  1. 在开始收集卵后2.5至3小时开始注射。在室温和实验室环境湿度下进行注射。
  2. 确保排列整齐的胚胎周围有足够的水分，以保持其湿润。
    注意：在注射过程中保持胚胎湿润至关重要。如果胚胎在注射过程中变干，针头将难以刺入胚胎，导致注射困难。合适的水量应使胚胎周围形成一层水的弯月面，但盖玻片不会浮在水面上，从而避免胚胎被推到盖玻片下方。在注射过程中必须持续监测胚胎周围的水量，并根据需要添加水分以保持胚胎湿润。
  3. 通过将刷子蘸水后，将水转移到滤纸的末端来小心加水。以这种方式加水可实现缓慢且可控的加水过程，仅添加足够保持胚胎湿润的水量。过多的水会导致胚胎漂移而失去排列，增加注射难度。
  4. 将注射混合物从针尾装入显微注射针中。使用手工拉制的硼硅酸盐玻璃针填充器加入约0.5至1 µL的注射混合物，也可使用凝胶加样枪头。注射混合物包含一种或多种靶向特定基因位点的向导RNA（每种80 ng/µL），与商用重组Cas9蛋白（300 ng/µL）混合而成。
  5. 将注射压力初始设定为30 psi，按下注射触发器以排出针尖的空气。这将推动注射混合物到达针尖，使其开始流动。此时，缓慢增加持压/恒定压力，直至注射物质开始流出，随后略微降低持压/恒定压力，使其略低于注射混合物从针尖流出的临界点。门控设置应确保仅注入足够量的物质，使少量物质可见进入胚胎。
    注意：最初尝试在卤代烃油下对白蛉胚胎进行注射，类似于果蝇（Drosophila）和蚊子的其他实验方案，但此类注射的存活率极低。改用上述湿润滤纸上的注射方法后，胚胎存活率显著提高。
  6. 将针头插入胚胎侧面。利用胚胎后方的盖玻片作为支撑，帮助针头刺入胚胎。在轻轻拔出针头前，向胚胎内注入少量注射混合物。
  7. 拔出针头后立即按下注射装置，清除针尖可能回吸的物质，以防止针头堵塞。
  8. 继续对下一个胚胎进行注射。每次注射之间，确保滤纸保持湿润且针头未堵塞。
  9. 完成所有胚胎注射后，统计已注射胚胎的数量，以便持续记录。
  10. 通过向滤纸上加水使盖玻片浮起，从而移除盖玻片。此时，使用探针（顶端粘有昆虫针的木制涂抹棒）固定滤纸，同时用手指将盖玻片从已注射的胚胎上轻轻拉开。
  11. 移除盖玻片后，用吸水纸吸去滤纸上多余的水分。

4. 注射后饲养（G0）（图4）

  1. 将带有胚胎的滤纸转移到培养皿中多层湿润滤纸上，以保持湿度。在注射其他胚胎所需的时间内，将胚胎暂时存放于此处。胚胎在此条件下最多可存放3小时。注射后，胚胎会逐渐变为棕色。
  2. 所有胚胎注射完成后，手动将其转移至预先润湿的小型石膏盆中。每个盆中不要放置过多胚胎，并保持个体之间的间距，以避免可能的真菌交叉污染。用筛网覆盖石膏盆，并按照通常饲养白蛉种群卵的方式进行培养，即在70%湿度和26 °C的培养箱中持续培养，直至完成整个发育过程。
  3. 注射后第1天，用画笔清除所有受损和死亡的胚胎。向含有已注射胚胎的石膏盆中逐滴加入100 µL 0.5%丙酸，以抑制真菌污染。注射过程中破裂胚胎释放的细胞质特别有利于真菌生长。
  4. 每天检查石膏盆，及时移除任何异常或死亡的胚胎。若发现真菌污染，应立即移除所有受感染胚胎，并添加数滴0.5%丙酸。
  5. 幼虫通常在注射后第8至12天孵化。每天两次将新孵化的幼虫转移至新的石膏盆中，每组最多5–10条。添加少量食物，并每周检查食物状况2–3次。
    1. 需仔细监控幼虫食物的量，过多会显著增加真菌污染的风险。白蛉幼虫在群体中存活率较高，但若食物不足，可能发生同类相食现象。
  6. 当幼虫化蛹时，按性别分开饲养，以确保雌虫保持处女状态。若存活个体较多，可舍弃雄虫，仅保留雌虫。
    注：雄性和雌性均可携带并传递突变。但由于雌虫在用于杂交前必须保持处女状态，因此使用仅经G0代注射的雌虫更为方便，可避免对野生型昆虫进行性别分离。若成虫存活数量较少，可保留G0代雄虫作为备用，此时将其与筛选出的野生型处女雌虫交配。

5. 突变等位基因的筛选与鉴定（图5）

  1. 将 G0 雌性与野生型雄性在笼中进行大量杂交。像常规种群维持一样，对它们进行集体血餐饲喂。
  2. 血餐后一天，使用口吸器将每只 G0 雌性与 2–3 只野生型雄性分别转移到单独的石膏管中。每天更换附有蔗糖的小棉球以喂养果蝇，并使用注射器加水，确保石膏保持适合产卵的湿度。
  3. 当 G0 雌性产下卵（即 G1 代）后，用带标注的单个离心管分别收集其尸体，用于后续基因型鉴定。胚胎按野生型种群常规方法继续培养。
  4. 采用选定的方法提取 G0 雌性的基因组 DNA。
  5. 通过例如设计包含预期 CRISPR 切割位点两侧序列的引物进行 PCR 扩增，检测 DNA 中是否存在突变。
  6. 仅保留由显示转化证据的 G0 雌性所产的 G1 胚胎。当这些 G1 胚胎发育为蛹时，按性别分离，仅保留雌性个体。将来自同一只 G0 雌性的 G1 雌性与野生型雄性杂交，进行血餐饲喂后，以每组 2–3 只雌性和 4–5 只雄性的规模转移到小型容器中。
    注意：所有 G1 个体均有可能携带独特的突变，因此若存活个体数量不多，建议将 G1 雌性与野生型雄性单独杂交。同一管中出现多只雌性携带不同突变的情况虽罕见但可能发生。若基因分型后发现此类情况，应将相应的 G2 子代雌性与野生型雄性单独交配。该交配策略可避免子代中出现多种突变共存的情况。
  7. 产卵后，收集 G1 雌性个体尸体并进行突变筛查。仅保留至少有一只雌性显示突变证据的管。
  8. 后续世代进行单对个体间的互交。产卵后，对亲本进行突变检测。每一代均重复此过程，直至双亲均为同一突变的纯合子。一旦获得此类个体，即可作为纯合突变品系的建系亲本。

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结果

本文所述用于产生白蛉突变体的CRISPR/Cas9显微注射方案，此前已在一篇出版物中建立4。该方法实现了高效的诱变效果：在540个个体中，有11个成功存活，其中9个为突变体。在设计CRISPR/Cas9突变的向导RNA时，一个关键的首要步骤是对目标区域周围的序列进行测序。测序所用的模板应来源于将用于胚胎注射的品系。仅依赖已发表的基因组序列来设计向导RNA存在风险，因为已发表的基因组序列与实际用于向导RNA设计前的测序结果之间存在差异的情况并不少见。在某些情况下，基于已发表基因组序列设计的向导RNA，在对目标基因周围区域进行测序时可能并不存在（Harrell，个人观察）。此外，序列中可能包含单核苷酸多态性（SNPs），这些多态性在基因型鉴定过程中可能被误判为真实的CRISPR编辑。因此，确认目标区域的序列对于后续实验步骤的成功至关重要。

昆虫通过显微注射实现成功的遗传修饰主要取决于两个关键方面：在发育的适当时期将材料（蛋白质、质粒或 mRNA）递送至胚胎，并尽可能减少对胚胎的损伤；以及培育健壮、健康的昆虫，使其能够存活并完成实验程序，最...

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讨论

本文介绍了一种新近开发的利用CRISPR/Cas9在Phlebotomus papatasi白蛉中进行靶向诱变的胚胎显微注射方法。昆虫遗传修饰的胚胎显微注射技术最早于20世纪80年代中期在Drosophila中建立21 ，现已被广泛应用于多种昆虫。此外，其他用于递送遗传修饰材料的方法也已开发并应用于昆虫，例如ReMOT20,21,22,23 和电穿孔法23。然而，目前胚胎显微注射仍是递送这些材料最通用且高效的方法。ReMOT作为一种极具前景的递送方法，因其成虫注射操作相对胚胎显微注射更为简便，值得在白蛉中进一步探索应用。但迄今为止，ReMOT尚未成功用于CRISPR/Cas9介导的HDR或转座子转基因。尽管昆虫胚胎显微注射的基本技术与...

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致谢

作者感谢Vanessa Meldener-Harrell对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黑色滤纸 4.25厘米 每包100片VWR28342-012裁剪成约46 × 22毫米的矩形。这些滤纸置于载玻片与盖玻片之间，在注射过程中为胚胎提供湿润的基础层。
盖玻片费舍尔科技公司12-543A
解剖显微镜任何品牌用于排列胚胎
玻璃载玻片费舍尔科技公司12-550-A3显微注射装置的底层（见图2A）
昆虫饲养笼定制或多种商用选项用于成虫饲养与交配的聚碳酸酯笼。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. 访问于2020年8月6日。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
幼虫饲料自制由兔粮和兔粪混合而成。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
微量加样管 100毫升Drummond1-000-1000用于反向填充显微注射针
口吸器John W. Hock公司型号612带HEPA过滤器的口吸器
Olympus SZX12Olympus生命科学显微注射用显微镜
产卵罐Nalge公司由125毫升或500毫升直壁聚丙烯广口瓶改装而成，底部钻有2.5厘米的孔，并填充1厘米厚的熟石膏。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. 访问于2020年8月6日。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
6-0号画笔任何美术用品公司n/a用于排列胚胎
丙酸Sigma-Aldrich402907抗真菌剂
标准玻璃毛细管世界精密仪器公司1B100-3用于制作显微注射针
Trio-MPC100控制器与MP845显微操作器Sutter仪器公司显微注射控制器与显微操作器

参考文献

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