用于CRISPR/Cas9诱变的沙蝇（Phlebotomus papatasi）胚胎显微注射

摘要

本方案详细介绍了在白蛉中进行CRISPR/Cas9靶向诱变的步骤：胚胎收集、显微注射、昆虫饲养，以及目标突变的鉴定与筛选。

摘要

沙蝇是利什曼原虫的天然传播媒介 利什曼原虫 物种，由原生动物寄生虫引起，症状范围广泛，从皮肤病变到内脏病理变化不等。解析媒介/寄生虫相互作用的本质对于深入理解具有重要意义 利什曼原虫 传播给宿主。在控制沙蝇传播能力（即其携带和传播病原体的能力）的诸多参数中，沙蝇自身的内在参数被证明起着关键作用。例如，昆虫的免疫反应会影响沙蝇对病原体的传播能力 利什曼原虫此类参数的研究一直受限于缺乏适用于这些非模式生物的基因表达修饰方法。尽管可通过小干扰RNA（siRNA）实现基因下调，但该技术不仅操作上具有挑战性，且仅能导致部分功能丧失，且无法将沉默效应遗传至下一代。近年来，CRISPR/Cas9技术介导的靶向诱变已被应用于 Phlebotomus papatasi 白蛉。该技术可在特定选择的基因位点产生可遗传的突变，从而实现对目标基因的研究。CRISPR/Cas9 系统依赖于诱导靶向的DNA双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源介导修复（HDR）进行修复。NHEJ 是一种简单的断裂闭合过程，常导致小片段的插入或缺失。相比之下，HDR 则利用与靶标DNA具有同源性的供体DNA分子作为修复模板。本文介绍一种利用NHEJ途径进行CRISPR/Cas9靶向诱变的白蛉胚胎显微注射方法，这是迄今为止唯一适用于白蛉媒介的基因组编辑技术。

引言

虫媒疾病是持续演变的重大公共卫生威胁。据世界卫生组织统计，数百种分布于不同系统发育类群（例如蚊子、蜱虫、跳蚤）的媒介生物负责传播大量微生物病原体，每年导致超过70万人死亡。在媒介昆虫中，白蛉亚科的沙蝇（双翅目，毛蚊科）是一个庞大的类群，已确认有80种具有传播能力的沙蝇，它们在不同地理区域分布，表现出不同的表型特征和传病能力。这些沙蝇是利什曼原虫属（Leishmania）原虫寄生虫的传播媒介，每年引起约130万例新发利什曼病病例，以及2万至3万例死亡。利什曼病的临床表现多样，症状范围从自限性皮肤病变到内脏播散，后者若不治疗可导致死亡。

白蛉是完全陆生的昆虫。其生命周期相对于其他双翅目昆虫较长，可持续长达三个月，具体时长取决于温度、湿度和营养等不同参数。该周期包括一个胚胎期（6至11天）、四个幼虫期（总共持续23至25天）和一个蛹期（9至10天），随后经历变态发育成为成虫。白蛉的饲养需要温暖潮湿的环境。雄性和雌性白蛉均以糖类为食，在自然环境中从花蜜中获取营养。只有雌性白蛉吸血，因为它们需要从血液中获取蛋白质以进行卵的发育¹。

研究的一个重要方向是明确导致可传播感染形成的媒介/寄生虫相互作用的本质。与其他媒介昆虫类似，白蛉自身的一些内在参数已被证明会影响其媒介能力，媒介能力是指其携带并将病原体传播给宿主的能力。例如，Phlebotomus papatas....

方案

使用小鼠血液作为白蛉饲喂来源的操作严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中的建议。该方案已获得NIH国家过敏与传染病研究所（NIAID）动物护理与使用委员会的批准（方案编号：LPD 68E）。无脊椎动物不在NIH指南的适用范围内。

1. 针头准备（图1）

1. 按照 Meuti 和 Harrell¹⁹ 所述方法拉制针头并进行斜面处理。简而言之，使用双级玻璃微电极拉制仪拉制针头，并采用硼硅酸盐玻璃毛细管。
2. 使用超细磨石在微电极斜面仪上通过湿法斜面处理对针头进行 sharpening。

2. 胚胎采集与显微操作（图2）

1. 在注射日前五天，对雌性白蛉进行血饲，操作方法与常规种群维持时相同。关于白蛉种群的饲养流程及所需材料的详细信息，请参见 Lawyer 等人¹。在整个发育期间，将昆虫置于培养箱中，保持 70% 湿度和 26 °C 的环境。
   1. 血饲后一天，使用带侧孔的石膏筒，以每组 100–150 只的方式捕获已血饲的雌虫。通过提供糖溶液（30% 蔗糖——足够浸透一小团棉球的量）喂养雌虫，该方法为种....

结果

本文所述用于产生白蛉突变体的CRISPR/Cas9显微注射方案，此前已在一篇出版物中建立⁴。该方法实现了高效的诱变效果：在540个个体中，有11个成功存活，其中9个为突变体。在设计CRISPR/Cas9突变的向导RNA时，一个关键的首要步骤是对目标区域周围的序列进行测序。测序所用的模板应来源于将用于胚胎注射的品系。仅依赖已发表的基因组序列来设计向导RNA存在风险，因为已发表的基因组序列与实际用于向导RNA设计前的测序结果之间存在差异的情况并不少见。在某些情况下，基于已发表基因组序列设计的向导RNA，在对目标基因周围区域进行测序时可能并不存在（Harrell，个人观察）。此外，序列中可能包含单核苷酸多态性（SNPs），这些多态性在基因型鉴定过程中可能被误判为真实的CRISPR编辑。因此，确认目标区域的序列对于后续实验步骤的成功至关重要。

昆虫通过显微注射实现成功的遗传修饰主要取决于两个关键方面：在发育的适当时期将材料（蛋白质、质粒或 mRNA）递送至胚胎，并尽可能减少对胚胎的损伤；以及培育健壮、健康的昆虫，使其能够存活并完成实验程序，最.......

讨论

本文介绍了一种新近开发的利用CRISPR/Cas9在Phlebotomus papatasi白蛉中进行靶向诱变的胚胎显微注射方法。昆虫遗传修饰的胚胎显微注射技术最早于20世纪80年代中期在Drosophila中建立²¹ ，现已被广泛应用于多种昆虫。此外，其他用于递送遗传修饰材料的方法也已开发并应用于昆虫，例如ReMOT^20,21,22,23 和电穿孔法²³。然而，目前胚胎显微注射仍是递送这些材料最通用且高效的方法。ReMOT作为一种极具前景的递送方法，因其成虫注射操作相对胚胎显微注射更为简便，值得在白蛉中进一步探索应用。但迄今为止，ReMOT尚未成功用于CRISPR/Cas9介导的HDR或转座子转基因。尽管昆虫胚胎显微注射的基本技术与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黑色滤纸 4.25厘米 每包100片	VWR	28342-012	裁剪成约46 × 22毫米的矩形。这些滤纸置于载玻片与盖玻片之间，在注射过程中为胚胎提供湿润的基础层。
盖玻片	费舍尔科技公司	12-543A
解剖显微镜	任何品牌		用于排列胚胎
玻璃载玻片	费舍尔科技公司	12-550-A3	显微注射装置的底层（见图2A）
昆虫饲养笼	定制或多种商用选项		用于成虫饲养与交配的聚碳酸酯笼。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. 访问于2020年8月6日。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
幼虫饲料	自制		由兔粮和兔粪混合而成。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
微量加样管 100毫升	Drummond	1-000-1000	用于反向填充显微注射针
口吸器	John W. Hock公司	型号612	带HEPA过滤器的口吸器
Olympus SZX12	Olympus生命科学		显微注射用显微镜
产卵罐	Nalge公司		由125毫升或500毫升直壁聚丙烯广口瓶改装而成，底部钻有2.5厘米的孔，并填充1厘米厚的熟石膏。Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. 访问于2020年8月6日。https://doi.org/10.1051/parasite/2017041。
6-0号画笔	任何美术用品公司	n/a	用于排列胚胎
丙酸	Sigma-Aldrich	402907	抗真菌剂
标准玻璃毛细管	世界精密仪器公司	1B100-3	用于制作显微注射针
Trio-MPC100控制器与MP845显微操作器	Sutter仪器公司		显微注射控制器与显微操作器