昆虫真社会性的许多特征依赖于巢群内部的交流与劳动分工。通过显微注射和CRISPR介导的突变技术对蚂蚁胚胎中的关键调控基因进行遗传操作，有助于揭示真社会性昆虫利他行为的本质。
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摘要
摘要
真社会性昆虫的独特性状，例如社会行为和生殖分工，由其遗传系统所控制。为了探究基因如何调控这些社会性性状，我们通过在胚胎合胞体阶段向早期胚胎递送CRISPR复合物，成功构建了突变型蚂蚁。本文提供了一种基于CRISPR介导的诱变技术的实验方案 Harpegnathos saltator一种表现出显著表型可塑性的细腰亚科蚂蚁物种。 H. saltator 蚂蚁在实验室环境中易于饲养。收集胚胎后，用Cas9蛋白进行显微注射。 体外 使用自制石英针合成小向导RNA（sgRNAs）并进行显微注射。注射后的胚胎在蚁群外培养。首只幼虫孵化后，将所有胚胎和幼虫转移至育幼巢箱，并配备少量工蚁继续抚育发育。本方案适用于诱导蚂蚁中与品级特异性生理及社会行为相关的基因突变分析，也可拓展应用于更广泛的膜翅目及其他昆虫类群。
引言
昆虫中真社会性的演化，尤其是膜翅目和蜚蠊目（前称等翅目）昆虫，导致了在个体和群体水平上均表现出独特且常常复杂的生物学行为特征。生殖上的劳动分工是高等社会性昆虫类群的典型特征，通常涉及由若干行为上乃至形态上各具特点的群体组成的品级系统。品级之间在行为和形态上的多样性不仅受其遗传系统的调控，还常常受到环境因素的影响1,2,3,4，这使得真社会性昆虫成为遗传学和表观遗传学研究的理想对象。
对真社会性昆虫的遗传系统进行操控已被证明具有挑战性，因为许多物种在实验室环境中无法交配和繁殖。大多数真社会性昆虫在一个群体中的繁殖个体数量极少，限制了可产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量5。此外，与常用于遗传研究的昆虫（如Drosophila）相比，许多真社会性昆虫的世代时间较长，这进一步增加了建立遗传品系的难度5。然而，某些真社会性物种能够在群体中产生大量具有生殖活性的个体，这缓解了上述困难，并为建立突变体或转基因品系提供了可能。
对于猛蚁亚科的蚂蚁物种Harpegnathos saltator而言，当蚁后死亡或发生社会隔离时，所有雌性工蚁均可转变为具有生殖能力的个体。这些工蚁被称为"gamergates"，可用于建立新的蚁群6。此外，一个蚁群中可能存在多个gamergate，从而提高后代的繁殖数量5,7,8。迄今为止，已在欧洲蜜蜂Apis mellifera以及蚂蚁物种H. saltator、Ooceraea biroi和Solenopsis invicta中成功构建了突变体和/或转基因品系9,10,11,12,13,14,15。对社会性蜜蜂和蚂蚁进行的遗传学分析为深入理解真社会性（eusociality）奠定了基础，提供了大量研究基因及其对真社会性昆虫行为和级型特异性生理影响的机会。
在此，我们提供了一种通过CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的实验方案 H. saltator特别是，该技术被用于在生殖系中产生基因突变 orco，编码所有气味受体（ORs）必需共受体的基因10. 或 基因在膜翅目真社会性昆虫中显著扩增16，以及 orco 在昆虫嗅觉中发挥关键作用；若缺失该成分，气味受体（ORs）无法正常组装或发挥功能。ORco 的突变 orco 因此，该基因会破坏嗅觉感知、神经发育及相关社会行为9,10.
在本实验方案中，通过显微注射将Cas9蛋白和小向导RNA（sgRNA）导入蚂蚁胚胎，以实现对目标基因的诱变。本文将详细描述显微注射的操作步骤，并提供有关蚁群饲养及注射后胚胎护理的指导。这些方法适用于在H. saltator蚂蚁中对多种不同基因进行诱变，也可推广应用于更广泛的膜翅目昆虫。
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方案
1. 跳跃蚂蚁（Harpegnathos saltator）群体的常规维护
- 在蚂蚁饲养室中，将 H. saltator 的野生型种群维持于透明塑料盒内，环境温度为 22–25 °C，光照周期为 12 小时光照：12 小时黑暗（12L:12D）。
- 使用小型盒子（9.5 × 9.5 cm2）饲养单个工蚁或小型蚁群；使用中型盒子（19 × 13.5 cm2）或大型盒子（27 × 19 cm2）饲养较大蚁群（图 1）。
- 制作巢穴盒时，用石膏铺设盒底。当石膏在中型和大型盒子中湿润并逐渐干燥时，将一块泡沫压入石膏内，深度几厘米，距离盒子后壁几厘米，以划定一个较低的巢区。待石膏完全干燥后，用一块方形玻璃覆盖该指定的巢区。
注意：小型盒子中无需划定低处巢区。若蚂蚁未充分利用指定的低处巢区，可在玻璃上覆盖一块方形红色玻璃纸，以营造类似地下黑暗空间的环境，模拟 H. saltator 在野外使用的巢穴，从而促进其将幼体转移至该区域。
- 每周两次以活体蟋蟀喂养蚁群。
注意：喂食量应适中，确保蚂蚁在下次喂食前消耗完所有蟋蟀。对于单独饲养的蚂蚁或突变型蚂蚁种群，应使用来自正常蚁群工蚁预先蜇刺过的蟋蟀，每周喂食 2–3 次。 - 定期使用洗瓶向石膏巢盒底部加水。
注意：石膏应保持足够湿润，触摸时不产生粉尘感，但又需足够干燥，使所加水分能被完全吸收。切忌过度加水。通常情况下，巢盒平均每周需添加少量水一次。 - 每次喂食时，清除垃圾及死亡个体。所有废弃物和死蚁应在 -30 °C 冷冻过夜后，作为普通垃圾处理。
- 定期向蚁群中添加少量干燥木屑；这有助于幼虫化蛹，并帮助工蚁保持巢盒清洁。
2. 石英玻璃显微注射针的制备
- 使用微量移液器拉制仪来拉制玻璃显微注射针。
- 选择待拉制的玻璃管。确保所使用的玻璃管储存在无尘且洁净的环境中。
注意：此处使用外径为 1.0 mm、内径为 0.5 mm、长度为 7.5 cm 的薄壁带丝石英玻璃管来制备显微注射针。若注射柔软的胚胎，硼硅酸盐玻璃针也可能适用，但硼硅酸盐针无法穿透坚硬的卵膜。 - 设置拉制仪的参数。采用两步法为 H. saltator 胚胎制备显微注射针：第一步参数包括加热值 575、细丝值 3、速度 35、延迟 145、拉力 75；第二步参数包括加热值 425、细丝值 0、速度 15、延迟 128、拉力 200。完成第二步后，应确保所得针尖具有 2 mm 的锥形部分和 0.5 µm 的尖端直径（图 2）。
注意：该组参数以及其他类型针的参数可在操作手册17中找到。移液器拉制仪的手册通常会提供适用于多种技术的推荐参数。可能需要经过若干次尝试与调整，才能确定最适合特定需求的参数组合。对于 H. saltator 的注射而言，较短的锥形部分更为理想，因其可穿透 H. saltator 胚胎坚硬的卵膜。若注射较柔软的胚胎（如已去卵膜的胚胎，例如 Drosophila），则约 10 mm 的较长锥形可能获得更佳效果。移液器拉制仪的操作手册通常会提供适用于不同用途的特定拉针参数。在操作玻璃毛细管和拉制针头时务必佩戴手套，若未戴手套，手上的油脂可能会污染玻璃表面。 - 参数设定完成后，使用微量移液器拉制仪拉制用于显微注射的针头。确保针头在使用前始终保存在无尘且洁净的环境中。
注意：建议使用 freshly pulled（新鲜拉制）的显微注射针。若使用预先拉制好的针头，应妥善存放于盒中，以防针尖受损或受到污染。长期储存的针头不建议用于胚胎注射。
3. 显微注射仪的制备
- 使用显微注射仪将目标物质注入蚂蚁胚胎中。
- 制备Cas9蛋白与 体外 合成的小向导RNA（sgRNAs）10将混合物置于冰上，直至准备上样至显微注射针时。不使用时，将显微注射混合物储存在 -80 °C。
注意：不同物种中浓度可能有所不同。浓度过高可能导致高死亡率，而浓度过低则可能降低效率。我们使用 0.2 µg/µL Cas9 蛋白和 0.2 µg/µL sgRNA 用于 H. saltator 胚胎显微注射。我们的sgRNA设计遵循先前已建立的方案18基因序列从DNA数据库中获得。基因组序列为 H. saltator 此前已有报道19,20. - 调整注射参数以 H. saltator 胚胎注射参数：注射压力为140百帕（hPa），恒定压力为70 hPa，注射时间为0.4秒。调节恒定压力，使物质仅单向流动。仅当针头中无物质流入胚胎时，才调节注射压力和时间。
注意：如果注射其他类型的胚胎，可能需要调整的主要参数是恒定压力，该参数可确保胚胎内的液体不会回流至针头中。本方案不控制注射体积。合理设置显微注射仪的参数即可实现一致的注射效果。 - 使用微量移液器吸头将2 µL混合物缓慢吸入显微注射针中，操作时应缓慢进行，以确保混合物中不产生气泡。
注意：如果产生气泡，可能难以保持显微注射的一致性。 - 沿着胶带边缘轻轻折断针尖，仅折断针尖顶端，保持针尖仍具有细窄的锥形。确保针尖折断程度适中，刚好使针尖开口，但不可过度折断导致锥形部分完全脱落。
注意：重要的是，如果针头断裂后开口过宽，用户在将针头安装到加压显微注射仪后、尚未施加注射压力时，即可观察到液体从针头流出。一些显微注射方案建议使用剪刀剪断针尖来开孔，但不推荐此方法，因为剪刀可能导致针尖碎裂。使用碎裂的针头对胚胎进行注射会造成严重损伤。 - 将针头安装到显微操作器上
4. 胚胎注射
- 从合胞体阶段选择用于显微注射的胚胎：即发育过程中细胞核进行分裂但不发生胞质分裂的时期。
注意：根据先前在Drosophila21中的研究，此阶段是通过显微注射进行基因组编辑的理想时期。H. saltator 胚胎在产卵后约36小时通过合胞体阶段并进入细胞化阶段10。使用较年轻的胚胎进行注射可获得更高的效率。 - 将胚胎排列在粘附于玻璃载玻片上的双面胶带上。确保胚胎牢固地固定在胶带上，以防止注射过程中发生移动。将胚胎以垂直方向摆放，使胚胎的侧面位于胶带边缘（图3）。将载玻片及排列好的胚胎放置于指定显微注射工作站的显微镜载物台上。
注意：建议将胚胎排列成可通过移动载物台上的载玻片连续进行注射，而无需在每次注射时调整针头位置。这样可更高效地完成连续注射。 - 使用显微操作器将注射针头与第一个待注射胚胎对齐（图4a）。
- 在显微镜下，沿胚胎的背腹轴方向从侧面将针头刺入第一个胚胎。
- 注入显微注射混合液。观察胚胎是否出现轻微移动，这表明由于液体注入导致内部压力升高。同时注意观察胚胎外膜上是否形成含有可见组织和/或脂质痕迹的小液滴（图4b）。
注意：液滴中出现组织和/或脂质痕迹表明针头已成功穿透胚胎的卵壳和卵黄膜。若未见这些物质痕迹，则说明注射未成功，需重新注射。数秒后，该液滴将被胚胎重新吸收，不再可见。 - 立即轻柔地将针头从胚胎中取出，并通过调整显微镜载玻片的位置移至下一个胚胎。重复此过程，直至所有胚胎均完成注射。
- 当载玻片上的所有胚胎均成功注射后，将载玻片转移至湿润盒中静置1小时，使胚胎有足够时间在从载玻片移出前恢复注射过程造成的损伤。
5. 注射后胚胎的培育
- 1 小时后 在湿盒中孵育后，用超细镊子轻轻将注射后的胚胎从胶带上取下，并转移至含有少量70%乙醇的离心管中。反复倒置离心管数次，使胚胎沉入管底。用70%乙醇再洗涤一次，随后用高压灭菌水洗涤三次。
- 使用小型柔软的画笔将所有已注射的胚胎转移至含有2%抗生素-抗真菌剂的1%琼脂平板上。在琼脂平板冷却后，用细胞涂布器将抗生素-抗真菌剂均匀涂布于平板表面。用封口膜密封琼脂平板，防止琼脂干燥。
注意：注射后的胚胎切勿放回蚁群中，因为工蚁可能会破坏大部分注射过的胚胎。因此，为提高存活率，应将胚胎置于正常蚁群环境之外的琼脂平板上进行发育。 - 在25 °C下孵育琼脂平板约4周，定期检查孵化情况。
- 一旦首个胚胎孵化为幼虫，立即将所有胚胎和幼虫转移至一个带有若干年轻护理工蚁的巢箱中，由工蚁照料新生幼体。使用经较大野生型蚁群预先蜇刺过的蟋蟀进行饲喂，按照第1节所述相同方案清理代谢废物并补充水分。
注意：小盒子（9.5 x 9.5 cm）2) 非常适合此类菌落。 H. saltator 在人工饲养条件下繁殖性能良好，因此突变胚胎可培育至成虫阶段。分离出的突变成虫可诱导其转变为生殖型蚁后阶段。通过受控杂交可建立包含杂合子或纯合子个体的突变品系群体。图5).
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结果
利用本方案，成功实现了对Harpegnathos saltator胚胎的基因组编辑。通过提取注射后胚胎的DNA进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，并将产物克隆至pGEM载体后进行DNA测序，验证了实验结果。采用该方案进行体细胞突变的效率约为40%。将F1代突变雄蚁与野生型雌蚁交配，获得杂合子F2代雌蚁；若F2代雌蚁不交配，则可产下F3代雄蚁。将突变型F3代雄蚁与杂合子雌蚁交配，可获得F4代纯合突变雌蚁。通过质谱分析F4代纯合雌性个体，进一步确认了目标肽段的缺失。使用显微解剖剪剪取雄蚁翅膀用于基因分型。由于工蚁无翅膀，通常在实验结束后将其处死并进行基因型鉴定。成功实现基因突变后，观察到一些异常行为，这些行为与目标基因的缺失相关。orco基因的缺失导致蚂蚁出现信息素感知能力丧失、无法识别猎物、繁殖力下降以及离开蚁群游走等异常行为。此外，orco突变型蚂蚁的嗅觉受体神经元数量减少，触角叶小球结构也减少，表明蚂蚁的神经解剖结构依赖于嗅觉受体的功能10。
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讨论
昆虫中真社会性的演化，包括蚂蚁、蜜蜂、胡蜂和白蚁，导致了多种新颖行为和形态特征的出现，其中许多特征被认为受到环境和遗传因素共同影响1,2,3,4。然而，真社会性昆虫作为遗传学研究模型的吸引力和实用性，因该类群中诱变技术的困难而受到限制。这一障碍源于真社会性昆虫的关键特征——生殖分工，即一个群体中仅有少数个体能够繁殖。这一特征限制了突变后代的数量，使得遗传品系的建立变得困难5。蜂形蚁属物种Harpegnathos saltator为解决这一难题提供了可能，因为当雌性个体被隔离时，所有雌性均能转变为具有生殖能力的蚁后（gamergate）5。本文介绍了利用CRISPR/Cas9系统通过胚胎显微注射在H. saltator中实现诱变的方法。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 感谢纽约大学Danny Reinberg实验室和Claude Desplan实验室，以及亚利桑那州立大学Jürgen Liebig实验室在蚂蚁遗传学研究方面提供的支持。Hua Yan的研究得到了美国国家科学基金会I/UCRC、节肢动物管理技术中心（资助号：IIP-1821914）以及产业合作伙伴的支持。Maya Saar得到了美国－以色列双边农业研究与发展基金（BARD）的资助，获得Vaadia-BARD博士后奖学金（编号：FI-595-19）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗生素-抗真菌素（100倍浓度） | ThermoFisher | 15240-062 | |
| 带核定位信号（NLS）的Cas9蛋白，高浓度 | PNA Bio | CP02 | |
| 赛璐玢卷膜，20英寸 × 5英尺 | Hypogloss Products | B00254CNJA | 该产品有多种颜色。请选购红色版本，用于制作蚂蚁巢穴。 |
| Eclipse Ci-S 直立显微镜 | Nikon | Ci-S | |
| 轻质镊子，窄头 | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet II 显微注射仪 | Eppendorf | 920010504 | 该产品已不再由Eppendorf销售或提供支持。可使用性能相当的显微注射仪替代。 |
| Microloader移液器吸头 | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI数据库 | 美国国家生物技术信息中心 | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| 塑料盒（19 × 13.5 cm2） | Pioneer Plastics | 079C | |
| 塑料盒（27 × 19 cm2） | Pioneer Plastics | 195C | |
| 塑料盒（9.5 × 9.5 cm2） | Pioneer Plastics | 028C | |
| 无丝石英玻璃毛细管 | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas剪刀，8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| 温莎&牛顿Cotman水彩系列111短柄合成圆头画笔 - 000号 | Winsor and Newton | 5301030 |
参考文献
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