胚胎注射用于CRISPR介导的诱变在蚂蚁Harpegnathos盐化剂中

Summary

昆虫真社会性的许多特征依赖于殖民地内的交流和分工。通过显微注射和CRISPR介导的诱变对蚂蚁胚胎中关键调控基因的遗传操作为真社会昆虫利他行为的本质提供了见解。

Abstract

真社会性昆虫的独特性状，如社会行为和生殖分工，受其遗传系统控制。为了解决基因如何调节社会性状的问题，我们通过在合胞阶段将CRISPR复合物递送到年轻胚胎中来开发突变蚂蚁。在这里，我们提供了Harpegnathos saltator中CRISPR介导的诱变方案， Harpegnathos盐酸盐是一种具有显着表型可塑性的ponerine ant物种。 盐蚂蚁 很容易在实验室环境中饲养。收集胚胎用于用Cas9蛋白显微注射，并使用自制石英针在 体外 合成小向导RNA（sgRNA）。注射后胚胎在菌落外饲养。在第一批幼虫出现后，所有胚胎和幼虫都被运送到一个巢箱中，由一些护理人员进行进一步发育。该协议适用于诱导诱变，以分析蚂蚁的种姓特异性生理和社会行为，但也可以应用于更广泛的膜翅目动物和其他昆虫。

Introduction

昆虫的真社会性进化，即膜翅目和Blottodea目（以前称为等翅目）的进化，导致了独特且通常复杂的行为特征，这些特征在个体和群体水平上都表现出来。生殖分工是最先进的社会昆虫群体的特征，通常涉及由几个行为上和通常形态上不同的群体组成的种姓系统。种姓之间的这种行为和形态多样性不仅受其遗传系统的控制，而且通常^{受环境控制}1，²，³，^4，使真社会昆虫成为遗传和表观遗传研究的有吸引力的对象。

操纵真社会昆虫遗传系统的能力已被证明具有挑战性，因为许多物种不在实验室环境中交配和繁殖。大多数真社会昆虫在一个群体中的生殖个体也很少，限制了可以产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量⁵。此外，与通常用于遗传研究的昆虫（如 果蝇）相比，许多真社会昆虫的生成时间较长，增加了建立^遗传系的难度5。然而，一些真社会物种可以在殖民地中产生很大比例的生殖活跃个体，这减轻了挑战并为建立突变或转基因系提供了机会。

就蚂蚁种类Harpegnathos saltator而言，所有....

Protocol

1. 定期维护 哈伯纳索斯盐菌 菌落

1. 在22-25°C和12小时光照:12小时黑暗（12L:12D）照明时间表的蚂蚁饲养室的透明塑料盒中保持H . saltator 的野生型菌落。
   1. 使用小箱子（9.5 x 9.5 cm²）饲养个体工蜂或小蜂群。使用中等箱子（19 x 13.5 cm 2）或大箱子（27 x 19 cm²）来培养较大的菌落（图1）。
   2. 要创建巢箱，请使用石膏为巢箱铺地板。当湿石膏在介质和大盒子中干燥时，将泡沫块压入石膏中，深度为几厘米，距离盒子背面几厘米，以指定较低的巢穴区域。石膏干燥后，用一块方形玻璃覆盖指定的巢穴区域。
      注意:在小盒子中，无需指定较低的巢穴区域。如果蚂蚁忽略了使用指定的下巢区域，则用一块方形的红色玻璃纸覆盖玻璃杯可能会有所帮助。这给人的印象是一个黑暗的地下空间，类似于 H. saltator 在野外使用的巢穴，并可能鼓励它们将育雏移动到指定区域。
2. 每周两次用活蟋蟀喂养殖民地。
   注意:菌落的喂食量应足以在下次喂食之前消耗掉所有蟋蟀。每周用常规蚁群的工人预先蜇伤的蟋蟀喂养任何孤立的蚂蚁和突变蚁群 2-3 次。
3. 使用洗手瓶定期将水涂抹在石膏巢箱地板上。
   注意:石膏应足够湿润，摸起来不会有灰尘，....

Results

使用此处提供的协议，成功地在 Harpegnathos盐胚胎 中进行基因组编辑。这些结果通过聚合酶链反应和pGEM克隆从注射胚胎中提取的DNA进行验证，然后进行DNA测序。使用该协议的体细胞诱变效率达到约40%。F1突变雄性与野生型雌配以产生杂合的F2雌性，如果不交配，则产生F3雄性。突变的F3雄性与杂合雌配以产生F4纯合突变雌性。通过这些F4纯合子女性个体的质谱进一步确认了目标肽的缺失。用显微解剖剪刀从雄性身上剪下翅膀，用于基因分型目的。由于工人没有翅膀，他们通常在实验后被牺牲和基因分型。由于成功的诱变，观察到异常行为，这与靶基因的丢失有关。 orco 的丧失导致与信息素感应丧失，无法检测猎物，繁殖力受损以及从殖民地徘徊有关的异常行为。此外， orco 突变蚂蚁表现出气味受体神经元和触角叶肾小球的数量减少，这表明蚂蚁的神经解剖结构依赖于气味受体功能¹⁰。

Discussion

昆虫（包括蚂蚁，蜜蜂，黄蜂和白蚁）之间真社会性的进化导致了新的行为和形态特征的出现，其中许多被认为受到环境和^{遗传因素的组合}影响1，²，^3，4。不幸的是，真社会昆虫作为遗传学领域研究模型的吸引力和有用性受到与该群体中诱变相关的困难的阻碍。这种障碍是由于生殖分工而发生的，这是真社会昆虫的一个关键特征，其中只有少数群体成员可以繁殖。这种性状限制了突变后代的数量，并使遗传系的发展具有挑战性⁵。蚂蚁种类Harpegnathos saltator为这一困境提供了解决方案，因为所有雌性^在隔离时都能够成为生殖游戏者5。在这里，我们提供了使用CRISPR / Cas9系统在H. saltator中诱变的方法，通过胚胎显微注射传递。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗生素 - 抗真菌 （100X）	ThermoFisher	15240-062
Cas9 蛋白与 NLS，高浓度	PNA Bio	CP02
玻璃纸卷 20 英寸 X 5 英尺	Hypogloss 产品	B00254CNJA	该产品有许多颜色变化。购买红色的它用于制作蚂蚁巢。
Eclipse Ci-S 正置显微镜	Nikon	Ci-S
轻量级镊子， 窄头	BioQuip	4748
FemtoJet ll 显微注射器	Eppendorf	920010504	Eppendorf 不再销售或支持本产品。可以使用类似的显微注射器代替。
Microloader 移液器吸头	Eppendorf	930001007
NCBI 数据库	国家生物技术信息中心	基因 ID： 105183395
P-2000 微量移液器拉拔器	Sutter Instruments	P-2000/G
塑料盒 （19 X 13.5 cm2）	Pioneer Plastics	079C
塑料盒 （27 X 19 cm2）	Pioneer Plastics	195C
塑料盒 （9.5 X 9.5 cm2）	Pioneer Plastics	028C
无细丝石英玻璃	Sutter Instruments	Q100-50-7.5
Vannas 剪刀，8.5 厘米	World Precision Instruments	500086
Winsor &Newton Cotman 水彩系列 111 短柄合成刷 - 圆形 #000	Winsor 和 Newton	5301030