昆虫真社会性的许多特征依赖于巢群内部的交流与劳动分工。通过显微注射和CRISPR介导的突变技术对蚂蚁胚胎中的关键调控基因进行遗传操作，有助于揭示真社会性昆虫利他行为的本质。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
真社会性昆虫的独特性状，例如社会行为和生殖分工，由其遗传系统所控制。为了探究基因如何调控这些社会性性状，我们通过在胚胎合胞体阶段向早期胚胎递送CRISPR复合物，成功构建了突变型蚂蚁。本文提供了一种基于CRISPR介导的诱变技术的实验方案 Harpegnathos saltator一种表现出显著表型可塑性的细腰亚科蚂蚁物种。 H. saltator 蚂蚁在实验室环境中易于饲养。收集胚胎后，用Cas9蛋白进行显微注射。 体外 使用自制石英针合成小向导RNA（sgRNAs）并进行显微注射。注射后的胚胎在蚁群外培养。首只幼虫孵化后，将所有胚胎和幼虫转移至育幼巢箱，并配备少量工蚁继续抚育发育。本方案适用于诱导蚂蚁中与品级特异性生理及社会行为相关的基因突变分析，也可拓展应用于更广泛的膜翅目及其他昆虫类群。
引言
昆虫中真社会性的演化，尤其是膜翅目和蜚蠊目（前称等翅目）昆虫，导致了在个体和群体水平上均表现出独特且常常复杂的生物学行为特征。生殖上的劳动分工是高等社会性昆虫类群的典型特征，通常涉及由若干行为上乃至形态上各具特点的群体组成的品级系统。品级之间在行为和形态上的多样性不仅受其遗传系统的调控，还常常受到环境因素的影响1,2,3,4，这使得真社会性昆虫成为遗传学和表观遗传学研究的理想对象。
对真社会性昆虫的遗传系统进行操控已被证明具有挑战性，因为许多物种在实验室环境中无法交配和繁殖。大多数真社会性昆虫在一个群体中的繁殖个体数量极少，限制了可产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量5。此外，与常用于遗传研究的昆虫（如Drosophila）相比，许多真社会性昆虫的世代时间较长，这进一步增加了建立遗传品系的难度5。然而，某些真社会性物种能够在群体中产生大量具有生殖活性的个体，这缓解了上述困难，并为建立突变体或转基因品系提供了可能。
对于猛蚁亚科的蚂蚁物种Har....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 跳跃蚂蚁（Harpegnathos saltator）群体的常规维护
- 在蚂蚁饲养室中，将 H. saltator 的野生型种群维持于透明塑料盒内，环境温度为 22–25 °C，光照周期为 12 小时光照：12 小时黑暗（12L:12D）。
- 使用小型盒子（9.5 × 9.5 cm2）饲养单个工蚁或小型蚁群；使用中型盒子（19 × 13.5 cm2）或大型盒子（27 × 19 cm2）饲养较大蚁群（图 1）。
- 制作巢穴盒时，用石膏铺设盒底。当石膏在中型和大型盒子中湿润并逐渐干燥时，将一块泡沫压入石膏内，深度几厘米，距离盒子后壁几厘米，以划定一个较低的巢区。待石膏完全干燥后，用一块方形玻璃覆盖该指定的巢区。
注意：小型盒子中无需划定低处巢区。若蚂蚁未充分利用指定的低处巢区，可在玻璃上覆盖一块方形红色玻璃纸，以营造类似地下黑暗空间的环境，模拟 H. saltator 在野外使用的巢穴，从而促进其将幼体转移至该区域。
- 每周两次以活体蟋蟀喂养蚁群。
注意：喂食量应适中，确保蚂蚁在下次喂食前消耗完所有蟋蟀。对于单独饲养的蚂蚁或突变型蚂蚁种群，应使用来自正常蚁群工蚁预先蜇刺过的蟋蟀，每周喂食 2–3 次。
....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用本方案，成功实现了对Harpegnathos saltator胚胎的基因组编辑。通过提取注射后胚胎的DNA进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，并将产物克隆至pGEM载体后进行DNA测序，验证了实验结果。采用该方案进行体细胞突变的效率约为40%。将F1代突变雄蚁与野生型雌蚁交配，获得杂合子F2代雌蚁；若F2代雌蚁不交配，则可产下F3代雄蚁。将突变型F3代雄蚁与杂合子雌蚁交配，可获得F4代纯合突变雌蚁。通过质谱分析F4代纯合雌性个体，进一步确认了目标肽段的缺失。使用显微解剖剪剪取雄蚁翅膀用于基因分型。由于工蚁无翅膀，通常在实验结束后将其处死并进行基因型鉴定。成功实现基因突变后，观察到一些异常行为，这些行为与目标基因的缺失相关。orco基因的缺失导致蚂蚁出现信息素感知能力丧失、无法识别猎物、繁殖力下降以及离开蚁群游走等异常行为。此外，orco突变型蚂蚁的嗅觉受体神经元数量减少，触角叶小球结构也减少，表明蚂蚁的神经解剖结构依赖于嗅觉受体的功能10。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
昆虫中真社会性的演化，包括蚂蚁、蜜蜂、胡蜂和白蚁，导致了多种新颖行为和形态特征的出现，其中许多特征被认为受到环境和遗传因素共同影响1,2,3,4。然而，真社会性昆虫作为遗传学研究模型的吸引力和实用性，因该类群中诱变技术的困难而受到限制。这一障碍源于真社会性昆虫的关键特征——生殖分工，即一个群体中仅有少数个体能够繁殖。这一特征限制了突变后代的数量，使得遗传品系的建立变得困难5。蜂形蚁属物种Harpegnathos saltator为解决这一难题提供了可能，因为当雌性个体被隔离时，所有雌性均能转变为具有生殖能力的蚁后（gamergate）5。本文介绍了利用CRISPR/Cas9系统通过胚胎显微注射在H. saltator中实现诱变的方法。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 感谢纽约大学Danny Reinberg实验室和Claude Desplan实验室，以及亚利桑那州立大学Jürgen Liebig实验室在蚂蚁遗传学研究方面提供的支持。Hua Yan的研究得到了美国国家科学基金会I/UCRC、节肢动物管理技术中心（资助号：IIP-1821914）以及产业合作伙伴的支持。Maya Saar得到了美国－以色列双边农业研究与发展基金（BARD）的资助，获得Vaadia-BARD博士后奖学金（编号：FI-595-19）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗生素-抗真菌素（100倍浓度） | ThermoFisher | 15240-062 | |
| 带核定位信号（NLS）的Cas9蛋白，高浓度 | PNA Bio | CP02 | |
| 赛璐玢卷膜，20英寸 × 5英尺 | Hypogloss Products | B00254CNJA | 该产品有多种颜色。请选购红色版本，用于制作蚂蚁巢穴。 |
| Eclipse Ci-S 直立显微镜 | Nikon | Ci-S | |
| 轻质镊子，窄头 | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet II 显微注射仪 | Eppendorf | 920010504 | 该产品已不再由Eppendorf销售或提供支持。可使用性能相当的显微注射仪替代。 |
| Microloader移液器吸头 | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI数据库 | 美国国家生物技术信息中心 | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| 塑料盒（19 × 13.5 cm2） | Pioneer Plastics | 079C | |
| 塑料盒（27 × 19 cm2） | Pioneer Plastics | 195C | |
| 塑料盒（9.5 × 9.5 cm2） | Pioneer Plastics | 028C | |
| 无丝石英玻璃毛细管 | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas剪刀，8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| 温莎&牛顿Cotman水彩系列111短柄合成圆头画笔 - 000号 | Winsor and Newton | 5301030 |
参考文献
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sc....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
