方法文章

基于曲线波变换工具量化纤维状胶原组织结构

DOI：

10.3791/61931

⸱

2020年11月11日

 , 
1Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, Center for Quantitative Cell Imaging, University of Wisconsin-Madison, 2Departments of Medical Physics and Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 3Morgridge Institute for Research, Madison, Wisconsin, 4test, test

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用基于曲线波变换的开源MATLAB软件工具，定量分析正常和病变组织细胞外基质中纤维状胶原排列的方法。该工具可应用于含有胶原纤维或其他类型线状结构的图像。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纤维状胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分，其拓扑结构的变化已被证实与多种疾病的发展相关，包括乳腺癌、卵巢癌、肾癌和胰腺癌。目前公开可用的纤维定量软件工具主要集中在纤维排列或取向的计算上，且存在诸多局限性，例如需要手动操作步骤、在噪声背景中难以准确检测纤维边缘，或缺乏对局部特征的表征能力。本方案所描述的胶原纤维定量工具采用基于曲线波变换（curvelet transform, CT）的最优多尺度图像表征方法。该算法能够去除纤维状胶原图像中的噪声，并增强纤维边缘，从而直接从单根纤维获取其位置和取向信息，而非依赖其他工具所获得的间接的像素级或窗口级信息。该基于CT的分析框架包含两个独立但相互关联的软件包，分别命名为“CT-FIRE”和“CurveAlign”，可在整体、感兴趣区域（ROI）或单根纤维的层面上量化纤维组织结构。该定量框架已发展十余年，现已演变为一个全面且以用户需求为导向的胶原定量平台。利用该平台，用户可测量多达约三十种纤维特征，包括单根纤维的长度、角度、宽度和直度等个体属性，以及密度和排列等整体性测量参数。此外，用户还可测量纤维相对于手动或自动分割边界的取向角度。该平台还提供多个附加模块，包括ROI分析、自动边界生成和后处理功能。使用该平台无需具备编程或图像处理的先验经验，且能够处理包含数百甚至数千张图像的大型数据集，从而为生物学或生物医学应用提供高效的胶原纤维组织结构定量分析能力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

纤维状胶原是突出的细胞外基质（ECM）结构成分。其排列结构的变化会影响组织功能，并可能与多种疾病的进展相关，包括成骨不全症1、心脏功能障碍2、伤口愈合3以及多种癌症，如乳腺癌4,5,6、卵巢癌7,8、肾癌9和胰腺癌10。目前已有多种成熟的成像技术可用于可视化纤维状胶原，例如二次谐波生成显微技术11、结合明场或荧光显微镜、偏振光显微镜使用的染料或染色剂12、基于液晶的偏振显微技术（LC-PolScope）13以及电子显微镜技术14。随着纤维状胶原排列结构重要性的日益明确，以及这些方法的广泛应用，对更优胶原纤维分析方法的需求也不断增长。

人们已做出许多努力，以开发用于纤维状胶原自动测量的计算方法。现有的免费软件工具主要侧重于通过采用像素的一阶导数或结构张量15,16，或基于傅里叶变换的图像块频谱分析17，来计算纤维的排列或取向。然而，这些工具均存在一定的局限性，例如需要人工干预步骤、在噪声背景中对纤维边缘的检测不准确，或缺乏对局部特征的表征能力。

与其他可免费获取的开源软件工具相比，本方案所述方法采用剪切波变换（CT）——一种最优的、多尺度的、具有方向性的图像表征方法——来去除纤维状胶原图像中的噪声，并增强或追踪纤维边缘。纤维的位置和方向信息可直接从纤维本身获取，而无需依赖间接的逐像素或逐窗口信息来推断纤维组织的度量参数。这一基于CT的分析框架18,19,20,21 可在整体、感兴趣区域（ROI）或单根纤维层面上量化纤维组织结构，主要通过两个独立但相互关联的软件包实现，分别为“CT-FIRE”18,21 和“CurveAlign”19,21。在软件实现方面，CT-FIRE利用多个尺度上的CT系数重建图像，以增强边缘并降低噪声；随后，在CT重建图像上应用单根纤维提取算法，用于追踪纤维，确定其代表性中心点，从中心点延伸纤维分支，并连接分支形成纤维网络。在CurveAlign中，用户可指定某一尺度的CT系数用于追踪局部纤维方向，提取并分组curvelet的方向与位置信息，以估计相应位置处的纤维取向。该量化分析框架已发展十余年，在功能、用户界面和模块化等方面均经历了显著改进。例如，该工具可可视化局部纤维取向，并允许用户测量多达三十种纤维特征，包括单根纤维的长度、角度、宽度和直线度等个体属性，以及密度和排列程度等整体参数。此外，用户还可测量纤维角度相对于手动或自动分割边界的相对取向，这在乳腺癌22 和胰腺癌研究10 的基于图像的生物标志物开发中具有重要作用。该平台提供多个功能模块，包括感兴趣区域分析、自动边界生成和后处理模块。ROI模块可用于标注不同形状的感兴趣区域，并进行相应的 ROI分析。作为应用示例，自动边界生成模块可用于将苏木精-伊红（H&E）明场图像与二次谐波生成（SHG）图像配准，并从配准后的H&E图像中生成肿瘤边界的图像掩膜。后处理模块有助于对单个图像输出的数据文件进行处理和整合，以便进行可能的统计分析。

该定量分析平台无需编程或图像处理的前期经验，可处理包含数百甚至数千张图像的大型数据集，从而为生物学或生物医学应用中的胶原组织高效定量提供支持。该平台已被全球众多研究人员广泛应用于不同研究领域，包括我们自己的研究团队。关于CT-FIRE和CurveAlign的主要出版物共有四篇18,19,20,21，其中前三篇截至2020年5月4日已被Google Scholar引用272次。对引用该平台（CT-FIRE或CurveAlign）的文献进行综述表明，约有110篇期刊论文直接使用该平台进行分析，其中约35篇为与我们课题组的合作研究，其余约75篇由其他研究团队独立完成。例如，该平台已被用于以下研究：乳腺癌22,23,24、胰腺癌10,25、肾癌9,26、伤口愈合3,27,28,29,30、卵巢癌8,31,7、子宫骶骨韧带32、低磷性牙本质33、基底细胞癌34、缺氧性肉瘤35、软骨组织36、心脏功能障碍37、神经元38、胶质母细胞瘤39、淋巴管收缩40、纤维支架41、胃癌42、微管43以及膀胱纤维化44。图1展示了CurveAlign在癌症成像中的应用，用于从二次谐波（SHG）图像中识别乳腺癌相关的胶原特征19。图2描述了该平台的典型工作流程示意图。尽管这些工具已在技术层面被综述过18,19,21，并且已有使用CurveAlign进行取向分析的标准操作流程20可供参考，但一份展示所有关键功能的可视化操作指南仍具有重要价值。本文所提供的可视化操作流程将有助于用户更高效地学习使用该平台，并更有效地解答用户可能遇到的问题与疑虑。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：本方案描述了使用 CT-FIRE 和 CurveAlign 进行胶原蛋白定量的方法。这两种工具的主要目标互补但有所不同，并在一定程度上相互关联。除高级后期处理和 ROI 分析外，大多数操作均可通过 CurveAlign 界面启动 CT-FIRE 来完成。如需完整使用 CT-FIRE 的功能，应单独启动该程序。

1. 图像采集与图像要求

注意：该工具可处理任何包含线状结构的图像文件，只要该文件可由 MATLAB 读取，而无论采集图像所用的成像方式如何。

  1. 使用8位灰度作为图像类型，因为默认运行参数基于此格式。
    注意：二次谐波成像（SHG）是一种广泛使用的无标记、高分辨率纤维状胶原成像方法。此处将采用一项乳腺癌研究中的SHG图像19进行演示说明。

2. 软件安装与系统要求

注意：独立应用程序版本和源代码版本均可免费获取。源代码版本需要安装完整的 MATLAB 软件，并包含信号处理、图像处理、统计分析和并行计算工具箱。要运行源代码版本，必须将所有必要的文件夹（包括部分第三方来源的文件夹）添加到 MATLAB 路径中。建议大多数用户使用独立应用程序（APP），该程序需要安装指定版本的免费 MATLAB Compiler Runtime（MCR）。下文将介绍安装和启动该应用程序的步骤。

  1. 从 https://eliceirilab.org/software/ctfire/ 和 https://eliceirilab.org/software/curvealign/ 分别下载 CT-FIRE 3.0 版本（CTF3.0）和 CurveAlign 5.0 版本（CA5.0）的 APP 软件包。
    注意：每个软件包均包含独立运行的 APP 程序、使用手册以及测试图像。
  2. 根据上述网站提供的详细系统要求和安装说明，安装 MATLAB MCR 2018b。
  3. 启动 APP 程序。
    1. 对于 64 位 Windows 系统，双击 APP 图标以启动程序。
    2. 对于 Mac 系统，请按照以下步骤启动程序：右键点击 APP（按住 ctrl 键并点击）| 显示包内容 | Contents | MacOS | applauncher（右键点击并选择“打开”）。
      注意：其他详细信息可参见 2.1 中列出的软件网站。

3. 使用 CT-FIRE 进行单根纤维提取

注意：CT-FIRE 使用 CT 技术对图像进行去噪处理，增强纤维边缘，然后利用纤维提取算法追踪单根纤维。针对单根纤维计算其长度、角度、宽度和直线度。

  1. 单张图像或多张图像的 CT-FIRE 分析
    1. 按照 2.3 节所述启动应用程序。
    2. 点击主图形用户界面（GUI，图 3A）中的 打开文件(s) 按钮，然后在弹出窗口中选择一个或多个图像/图像堆栈。使用适用于操作系统的多选方法在对话框中选择多个图像（例如，在 Windows 系统中，按住 CTRL 键的同时选择多个文件）。
      注意：如果选择了两个或更多图像文件，则所有图像必须使用相同的运行参数进行分析。请确保所有图像均在相同或相似条件下获取。
    3. 对于多图像分析，勾选右上角的 并行计算 复选框以选择并行计算选项。
    4. 对于图像堆栈，移动文件列表框下方的切片滑块以选择待分析的切片。
    5. 设置运行属性。初次分析部分图像时可使用默认参数。若使用默认参数，请跳至步骤 3.1.6。如需设置不同参数，请点击 参数 面板中的 更新 按钮，并参照手册正确调整参数。
      注意：最常调整的参数包括背景阈值（thresh_im2）和成核搜索半径（s_xlinkbox）。若背景噪声水平较高，应将 thresh_im2 设为较大值；s_xlinkbox 与纤维的平均半径相关，设置较小值可检测细纤维。
    6. 点击 运行 按钮。
      注意：进度信息将在信息窗口和命令窗口中同时显示。分析完成后，输出表格将被显示（图 3B）。
    7. 点击输出表格中的任意条目，查看该图像中纤维测量值的直方图（图 3C 和 图 3F），包括长度、宽度、角度和直线度。
      注意：纤维图像中，纤维将叠加在原始图像上显示（图 3E）。
    8. 检查图像文件夹下名为 ctFIREout 的子文件夹，其中包含输出文件，如叠加图像的“.tiff”文件、“.csv”文件和“.mat”文件。
  2. CT-FIRE 区域兴趣（ROI）分析
    1. 使用 ROI 管理器进行 ROI 标注
      1. 在主 GUI（图 3A）中点击 打开文件(s) 按钮，加载一张或多张图像。
      2. 在文件列表中选择待标注的图像。
      3. 在 ROI 选项 面板的下拉菜单中选择 ROI 管理器。
      4. 点击 运行 按钮以启动 ROI 管理器 模块（图 3A）。
      5. 在 ROI 管理器 GUI（图 4A）中，点击 绘制 ROI 菜单(d) 下方的下拉菜单，逐个绘制 ROI。
        注意：ROI 形状可以是矩形、自由手绘、椭圆、多边形或指定矩形。请按照屏幕提示完成 ROI 的绘制、保存和退出标注。
      6. 选择 ROI 绘制方法后，将原始图像上出现的黄色矩形拖动到所需位置，然后点击 保存 ROI(s) 按钮或按下 s 键，将此 ROI 添加至 ROI 列表。该 ROI 将自动命名。
      7. 通过将前一个 ROI 拖动到新位置并按 3.2.1.6 所述方式保存，或重复步骤 3.2.1.5–3.2.1.6，绘制新的 ROI。
      8. 按下 x 键，或在 ROI 形状下拉菜单中选择 新建 ROI？ 以退出 ROI 标注。
      9. 勾选 显示全部 和 标签 复选框，以在列表中显示所有已定义的 ROI，并在原始图像上显示其名称。
      10. 在 ROI 列表中选择 ROI，执行基本 ROI 操作，包括 重命名 ROI、删除 ROI、保存 ROI 文本、从文本加载 ROI、保存 ROI 掩膜、从掩膜加载 ROI 和 合并 ROI。
      11. 检查原始图像文件夹下名为 ROI_management 的子文件夹中保存的 ROI 管理器输出文件（“.mat” 文件）。
      12. 若需对已打开文件列表中的另一张图像进行标注，请重复步骤 3.2.1.2–3.2.1.11。
      13. 标注完成后，关闭 ROI 管理器 GUI，并在主 GUI 中点击 重置 按钮以重置主界面。
    2. 在 ROI 管理器中对单张图像进行 ROI 分析
      1. 若已完成整幅图像的 CT-FIRE 分析且结果已保存至默认目录，请在 ROI 列表中点击一个或多个 ROI，然后点击 ctFIRE ROI 分析器 按钮以启动 ROI 后分析模块。
        注意：结果将自动保存在位于 \\[图像文件夹]\ CTF_ROI\Individual\ROI_post_analysis\. 的子文件夹中。
      2. 在弹出窗口中点击 检查纤维 按钮，以显示所选 ROI 内的纤维（图 4B）。
      3. 点击 绘制统计图 以显示每个 ROI 的直方图（图 4C）。相应的输出图像将被显示。
      4. 若尚未进行整幅图像的 CT-FIRE 分析，请在 ROI 列表中点击一个或多个 ROI，然后点击 在 ROI 上应用 ctFIRE 按钮，直接对所选 ROI 进行 CT-FIRE 分析。
      5. 按照提示窗口中的说明运行分析。
        注意：CT-FIRE 的运行参数通过主 GUI 传递，用户可根据需要按照步骤 3.1.5 所述更新运行参数。分析完成后，纤维测量值的汇总统计信息将在输出表格中显示。结果将自动保存在位于 \\[图像文件夹]\ CTF_ROI\Individual\ROI_analysis\ 的子文件夹中。
    3. 使用 ROI 分析器对多张图像进行 ROI 分析
      1. 按照步骤 3.2.1 对待分析图像进行 ROI 标注。
      2. 点击 打开文件(s) 按钮，打开一张或多张图像。
      3. 当整幅图像分析结果可用时，点击 运行选项 面板中的下拉菜单，选择 CTF 后 ROI 分析器 选项，以运行 ROI 后分析。
      4. 点击 运行 按钮，对所有已加载图像进行 ROI 分析。
      5. 在 GUI 底部的消息窗口和命令窗口中查看显示的进度信息。
      6. 分析完成后，检查输出表格中显示的每个 ROI 的汇总统计信息。
        注意：详细输出文件将自动保存在位于 \\ [图像文件夹]\CTF_ROI\Batch\ROI_post_analysis\ 的子文件夹中。
      7. 当整幅图像分析结果不可用时，执行直接分析：遵循步骤 3.2.3.1–3.2.3.6，但在步骤 3.2.3.3 中选择 CTF ROI 分析器 选项；在步骤 3.2.3.4 中，点击 运行 按钮前，按照步骤 3.1.5 所述更新运行参数。点击 运行 按钮后，在弹出的对话框中选择 矩形 ROI 或 任意形状的 ROI 掩膜。
        注意：若所有已标注的 ROI 均为矩形，用户可选择“矩形 ROI”。在步骤 3.2.3.6 中，ROI 分析结果将保存在位于 \\[图像文件夹]\CTF_ROI\Batch\ROI_analysis\ 的子文件夹中。
  3. CT-FIRE 的后处理
    注意：在完成 3.1 节所述的常规 CT-FIRE 分析后，用户可进行进一步的后处理。无需重新运行耗时的纤维提取过程，3.3.1 节所述的常规后处理可更新部分基本输出图像属性，而 3.3.2 节所述的高级后处理则可可视化单根纤维及其属性，对全部四种纤维属性进行复杂阈值筛选，生成所选纤维的汇总统计信息，并使用自定义颜色映射可视化所选纤维。
    1. CT-FIRE 的常规后处理
      1. 启动 CT-FIRE 应用程序，或在其他操作后点击 重置 按钮以初始化 CT-FIRE 主 GUI（图 3A）。
      2. 勾选主 GUI 顶部的 .mat 复选框。
      3. 点击 打开文件(s) 按钮，选择 ctFIREout 子文件夹中的 CT-FIRE 输出 .mat 文件。
        注意：若选择多个文件，批量 复选框将自动被勾选。对应图像的文件名将在列表框中显示。
      4. 更新 输出图像控制 面板中的选项。
      5. 保持 输出选项 中的默认设置，以确保所有输出文件将根据 3.3.1.4 中设置的新参数集进行更新。
      6. 点击 后处理 按钮。在主 GUI 底部的消息窗口以及命令窗口中查看进度信息。
      7. 分析完成后，点击输出表格中的任意条目，查看图像中纤维测量值的直方图，包括长度、宽度、角度和直线度。
        注意：新的输出文件将覆盖 ctFIREout 子文件夹中的旧文件。
    2. CT-FIRE 的高级后处理
      1. 启动 CT-FIRE 应用程序，或在其他操作后点击 重置 按钮以初始化 CT-FIRE 主 GUI（图 3A）。
      2. 勾选主 GUI（图 3A）顶部的 OUT.adv 复选框。
      3. 点击 后处理 按钮，启动名为“分析模块”的高级后处理 GUI（图 5A）。
      4. 点击 选择文件 按钮以选择一张图像。
      5. 点击 可视化纤维 按钮，根据标签页图像 原始-纤维 中的标签输入纤维编号。
        注意：所选纤维的测量值将在输出表格中显示（图 5B），相应纤维将叠加在标签页图像 已测量-纤维 所示的原始图像上（图 5C）。
      6. 点击 确认/更新 按钮，进入阈值筛选操作。
      7. 勾选阈值筛选框以启用阈值设置。
      8. 从下拉菜单中选择四种阈值选项之一。
      9. 在 阈值 面板中为一个或多个纤维属性输入所需的阈值。
      10. 点击 立即阈值化 按钮以应用上述阈值条件。
      11. 查看名称以 metrics visualization 结尾的提示图像，以观察使用自定义颜色映射叠加在原始图像上的所选纤维（如 图 5E 所示）。
      12. 重复步骤 3.3.2.9–3.3.2.11，设置理想的阈值。
      13. 点击 保存纤维 按钮以保存所选纤维的信息。
        注意：相应的所选纤维将在标签页图像 阈值化后 中显示。
      14. 点击 生成统计 按钮，然后在弹出窗口中点击 确定 按钮以生成汇总统计信息。
        注意：输出表格（图 5D）将显示所选纤维的平均值。其他统计信息将保存在 Excel 文件中，其位置显示在该 GUI 底部的 状态 窗口中。
      15. 若需将所选单根纤维信息包含在输出文件中，请在点击 确定 按钮前勾选 为原始数据生成工作表 选项。
      16. 若需合并多张图像的结果，在步骤 3.3.2.4 中勾选 批量模式 或 堆栈模式，并选择要分析的多张图像或堆栈；跳过步骤 3.3.2.5–3.3.2.6。在步骤 3.3.2.8–3.3.2.9 中设置阈值条件，但由于 立即阈值化 和 保存纤维 按钮不可用，跳过步骤 3.3.2.10–3.3.2.13；最后，按照步骤 3.3.2.14 的说明生成所选纤维的汇总统计信息和单根纤维属性。

4. 使用 CurveAlign 进行纤维分析

注意：CurveAlign 最初被开发用于自动测量纤维相对于用户定义边界的夹角。当前版本的 CurveAlign 除了可通过加载由 CT-FIRE 提取的单根纤维信息或直接使用曲线小波的局部方向来测量相对角度外，还可用于对基于密度和排列特征进行批量评估。当采用 CT-FIRE 作为纤维追踪方法时，CurveAlign 可计算多达三十种与全局或局部特征相关的参数，主要包括密度、排列以及单根纤维的特性。

  1. 基于小波曲线变换的纤维分析
    1. 按照 2.3 节所述启动应用程序。
    2. 如果已执行其他操作，请点击 重置 按钮，将应用程序恢复至初始状态。
    3. 在主图形用户界面（图 6A）中，勾选 纤维分析方法 选项，确保已选择 CT（默认选项）。
      注：在此模式下，将对图像执行小波曲线变换（CT），每条小波曲线的方向代表对应位置处纤维的方向。
    4. 点击 边界处理方法 下拉菜单，从下拉选项中选择边界处理模式：无边界、CSV 边界或 TIFF 边界。
      注：若无需边界，可跳过此步骤。有关如何相对于边界计算纤维角度，请参见 4.3 节。
    5. 在主图形用户界面（图 6A）中点击 获取图像 按钮，然后在弹出窗口中选择一个或多个图像或图像堆栈。使用适用于操作系统的多选方法在对话框中选择多个图像（例如，在 Windows 系统中，按住 CTRL 键并选择多个文件）。
      注：若选择两个或更多图像文件，所有图像必须使用相同的运行参数进行分析。请确保所有图像均在相同或相似条件下获取。
    6. 对于图像堆栈，移动文件列表框下方的切片滑块，以选择待分析的切片。
    7. 输入 保留系数的比例。该值表示在纤维分析中将使用的小波曲线变换最大系数的比例。
      注：若图像中纤维强度或对比度变化较大，建议标注具有均匀对比度的感兴趣区域用于纤维分析，因为此模式仅能检测图像中最亮的纤维。此外，图像尺寸越大，该比例应设置得越小。
    8. 保持 输出选项 及 高级 选项中的所有参数为默认设置；这些输出文件可能在后续操作中需要。
    9. 点击主图形用户界面底部的 运行 按钮（图 6A）。
      注：处理进度信息将以绿色高亮显示在底部的消息窗口中。处理完成后，每幅图像的摘要统计信息将显示在输出表格中（图 6B），所有输出文件将自动保存在原始图像所在目录下的名为 CA_Out 的子文件夹中。
    10. 点击输出表格中的任意条目（图 6B），查看纤维角度的直方图（图 6E）或罗盘图（图 6F）。
      注：纤维取向或角度的叠加图像（图 6C）和热图（图 6D）也将同时显示。
    11. 点击 重置 按钮以执行其他操作，或关闭主图形用户界面以退出应用程序。
  2. 基于 CT-FIRE 的单根纤维分析
    注：本流程与 4.1 节所述步骤相同，但需在步骤 4.1.3 中选择 CT-FIRE 相关的纤维分析模式，并跳过步骤 4.1.7（该步骤在 CT-FIRE 模式下不适用且已被禁用）。具体而言，在步骤 4.1.3 中，从以下三种基于 CT-FIRE 的单根纤维分析方法中选择其一：
    1. 选择 CT-FIRE 纤维，使用纤维中心点和纤维角度来表征纤维。
      注：此选项不考虑纤维沿长度方向上的取向变化。
    2. 选择 CT-FIRE 端点，使用纤维的两个端点及其对应的纤维角度来表征纤维。
      注：与 4.2.1 相比，此选项使用两个位置点（而非 一个）来表示纤维（即纤维中心点）。
    3. 选择 CT-FIRE 分段，使用纤维的多个分段来表征纤维。
      注：每个分段具有相等长度（CT-FIRE 中默认为 5 像素），以及各自的取向和位置，能够反映整根弯曲纤维沿长度方向的取向变化。此选项耗时最长，但在三种基于 CT-FIRE 的纤维分析方法中，是追踪弯曲纤维局部取向变化的最佳选择。
  3. 结合边界的相对取向分析
    注：与 4.2 和 4.3 节所述的无边界条件常规分析相比，结合边界条件的相对取向分析需要以下步骤：
    1. 在步骤 4.1.3 中，选择 TIFF 边界条件。
      注：用户需为每幅图像或每个图像堆栈提供相应的边界文件。根据屏幕提示，手动标注 CSV（基于逗号分隔值格式的 x-y 坐标）边界文件或 Tiff 边界文件。在 CurveAlign 中创建的边界文件将根据手册中描述的文件目录结构和命名规范自动保存。若提供了一对 H&E 明场与 SHG 图像，可使用 4.4 节所述的自动边界生成模块创建边界文件。
    2. 在 主要参数 面板中，输入距最近边界的距离，仅分析该距离范围内的纤维。
    3. 在 输出选项 面板中，勾选边界关联框 Bdry Assoc，以可视化与纤维、纤维分段或小波曲线相关联的边界上的点。
  4. 自动边界生成
    1. 按照 2.3 节所述启动应用程序。
    2. 如果已执行其他操作，请点击 重置 按钮，将应用程序恢复至初始状态。
    3. 点击 BD Creation 按钮，启动自动边界生成模块。
    4. 根据屏幕提示或线索，基于一对 H&E 明场与 SHG 图像为一幅或多幅图像创建边界文件。
    5. 关闭模块窗口，或点击主图形用户界面（图 6A）中的 重置 按钮以退出该模块。
  5. CurveAlign 感兴趣区域分析
    1. 使用 ROI Manager 进行感兴趣区域标注
      1. 在主图形用户界面（图 6A）中点击 获取图像 按钮，加载一幅或多幅图像。
      2. 在文件列表中选择待标注的图像。
      3. 点击 ROI Manager，启动 ROI Manager 模块（图 7A）。
      4. 执行 3.2.1 节中的步骤 3.2.1.5–3.2.1.13。
    2. 在 ROI Manager 中对单幅图像进行 ROI 分析
      1. 若已完成整幅图像的 CurveAlign 分析且结果已保存在默认目录中，可在 ROI 列表中点击一个或多个 ROI，然后点击 CA ROI Analyzer 按钮以执行 ROI 后处理分析。
        注：分析完成后，摘要统计信息将显示在输出表格中（图 7C），并以直方图形式展示角度分布（图 7D）。
      2. 点击输出表格中的任意条目，可视化特定 ROI 内的纤维（图 7B）以及纤维角度的直方图。
      3. 检查保存在子文件夹 \\[图像文件夹]\ CA_ROI\Individual\ROI_post_analysis\ 中的输出文件。
      4. 若尚未进行全图 CA 分析，可在 ROI 列表中选择一个或多个 ROI，点击 Apply CA on ROI 按钮，直接对所选 ROI 执行 CA 分析。根据弹出窗口中的提示运行分析。
        注：CA 分析的参数通过主图形用户界面传递；根据需要更新步骤 4.1.7 中描述的运行参数。分析完成后，纤维测量的摘要统计结果将显示在输出表格中，并自动保存在 \\[图像文件夹]\ CA_ROI\Individual\ROI_analysis\ 子文件夹中。
    3. 使用 ROI Analyzer 对多幅图像进行 ROI 分析
      1. 按照 4.5.1 节的步骤为待分析图像标注 ROI。
      2. 点击 获取图像 按钮，打开一幅或多幅图像。
      3. 当整幅图像分析结果可用时，点击 ROI Analysis 按钮并选择 ROI 后处理 选项，以执行 ROI 后分析。
      4. 查看 GUI 底部消息窗口和命令窗口中显示的进度信息。
      5. 分析完成后，检查输出表格中每个 ROI 的摘要统计信息。
        注：详细输出文件将自动保存在 \\ [图像文件夹]\CA_ROI\Batch\ROI_post_analysis\ 子文件夹中。
      6. 当整幅图像分析结果不可用时，若需使用 CT 模式直接进行分析，请执行步骤 4.5.3.1–4.5.3.5，但需进行以下修改：在步骤 4.5.3.3 中选择 对裁剪的矩形 ROI 执行 CA 或 对任意形状 ROI 的掩膜执行 CA。若所有标注的 ROI 均为矩形，可选择 矩形 ROI 选项。在步骤 4.5.3.2 之后，根据 4.1.7 节描述更新运行参数。
        注：ROI 分析结果将保存在 \\ [图像文件夹]\CA_ROI\Batch\ROI_analysis\. 子文件夹中。
  6. CurveAlign 后处理
    1. 按照 2.3 节所述启动应用程序。
    2. 如果已执行其他操作，请点击 重置 按钮，将应用程序恢复至初始状态。
    3. 点击 后处理 按钮，启动后处理模块。
    4. 根据屏幕提示或线索，合并来自不同图像的输出特征或数值。
    5. 关闭模块窗口，或点击主图形用户界面（图 6A）中的 重置 按钮以退出该模块。

5. 预计运行时间

  1. 等待处理一幅尺寸为 1024 像素 × 1024 像素、纤维密度中等的图像所需的预估运行时间。实际计算时间通常取决于多种因素，包括文件大小、分析模式、所部署的特征、中央处理器（CPU）类型以及可用随机存取存储器（RAM）的容量。CT-FIRE 单根纤维提取需数分钟。CurveAlign CT 模式（无边界）需数秒。CurveAlign CT-FIRE 纤维或纤维末端模式（无边界）需数十秒。CurveAlign CT-FIRE 纤维模式（无边界）需数百秒。CurveAlign 分析（含边界）则需数十秒至数分钟，具体取决于边界的复杂程度。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些方法已在众多研究中成功应用。一些典型的应用包括：1）Conklin 等人22使用 CurveAlign 计算肿瘤相关胶原特征，发现胶原纤维在导管原位癌（DCIS）病灶中更倾向于垂直于导管周长排列；2）Drifka 等人10利用 CurveAlign 中的 CT-FIRE 模式量化胰腺导管腺癌以及正常/慢性胰腺炎组织中的间质胶原排列，发现癌组织中的胶原排列程度高于正常/慢性组织；3）Alkmin 等人7使用 CurveAlign 对卵巢间质胶原的 SHG 图像中 F-肌动蛋白纤维的角度分布和总体胶原排列进行量化，表明基质形态在驱动细胞运动性和 F-肌动蛋白排列中起重要作用；4）LeBert 等人3将 CT-FIRE 应用于斑马鱼伤口修复模型的 SHG 图像，发现急性损伤后胶原纤维厚度增加；5）Devine 等人45在不同动物模型的声带胶原 SHG 图像中使用 CurveAlign 的 CT-FIRE...

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讨论

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本方案描述了使用 CT-FIRE 和 CurveAlign 进行纤维状胶原定量分析的方法，可应用于任何包含胶原纤维或其他适合通过 CT-FIRE 或 CurveAlign 进行分析的线状或纤维状细长结构的图像。例如，弹性蛋白或弹性纤维也可在该平台上以类似方式处理。我们已在计算机生成的合成纤维图像上测试了这两种工具21。用户应根据具体应用选择最适合其数据的分析模式。CT 纤维分析模式可直接利用 CT 中的curvelet来表征纤维的位置和取向，对局部纤维结构的变化具有较高敏感性。该模式适用于在复杂条件下定位纤维及其方向，例如噪声水平较高、纤维呈弯曲形态或纤维厚度变异较大的情况。然而，由于 CT 模式仅能检测图像中最亮的部分，在图像强度差异较大时，可能会遗漏部分强度较低的纤维。

此外，CT 模式无法提供单根纤维的信息。与 CT 模式不同，CT-FIRE 模式可计算单根纤维的特性，并能分析所有强度超过指定阈值的纤维。CT-FIRE 模式面临的挑战包括：1）当纤维沿长度方向的强度或图像中纤维厚度存在较大变化时，完整纤维提取的准确性可能降低或受...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢多年来为 CT-FIRE 和 CurveAlign 做出贡献的众多贡献者和用户，包括 Rob Nowak 博士、Carolyn Pehlke 博士、Jeremy Bredfeldt 博士、Guneet Mehta、Andrew Leicht、Adib Keikhosravi 博士、Matt Conklin 博士、Jayne Squirrell 博士、Paolo Provenzano 博士、Brenda Ogle 博士、Patricia Keely 博士、Joseph Szulczewski 博士、Suzanne Ponik 博士，以及 Swati Anand 和 Curtis Rueden 提供的额外技术支持。本研究得到了半导体研究公司、Morgridge 研究所，以及美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01CA199996、R01CA181385 和 U54CA210190 对 K.W.E. 的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CT-FIRE威斯康星大学麦迪逊分校N/A开源软件，可从 https://eliceirilab.org/software/ctfire/ 获取
CurveAlign威斯康星大学麦迪逊分校N/A开源软件，可从 https://eliceirilab.org/software/curvealign/ 获取

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nadiarnykh, O., et al. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfecta. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 051805(2007).
  2. Kouris, N. A., et al. A nondenatured, noncrosslinked collagen matrix to deliver stem cells to the heart. Regenerative Medicine. 6 (5), 569-582 (2011).
  3. LeBert, D. C., et al. Matrix metalloproteinase 9 modulates collagen matrices and wound repair. Development. 142 (12), 2136-2146 (2015).
  4. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  5. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 1(2008).
  6. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  7. Alkmin, S., et al. Migration dynamics of ovarian epithelial cells on micro-fabricated image-based models of normal and malignant stroma. Acta Biomaterialia. 100, 92-104 (2019).
  8. Campbell, K. R., Campagnola, P. J. Assessing local stromal alterations in human ovarian cancer subtypes via second harmonic generation microscopy and analysis. Journal of Biomedical Optics. 22 (11), 116008(2017).
  9. Best, S. L., et al. Collagen organization of renal cell carcinoma differs between low and high grade tumors. BMC Cancer. 19 (1), 490(2019).
  10. Drifka, C. R., et al. Periductal stromal collagen topology of pancreatic ductal adenocarcinoma differs from that of normal and chronic pancreatitis. Modern Pathology. 28 (11), 1470-1480 (2015).
  11. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  12. Arun Gopinathan, P., et al. Study of collagen birefringence in different grades of oral squamous cell carcinoma using picrosirius red and polarized light microscopy. Scientifica. 2015, 1-7 (2015).
  13. Keikhosravi, A., et al. Quantification of collagen organization in histopathology samples using liquid crystal based polarization microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (9), 4243-4256 (2017).
  14. Quan, B. D., Sone, E. D. Cryo-TEM analysis of collagen fibrillar structure. Methods in Enzymology. 532, 189-205 (2013).
  15. Boudaoud, A., et al. FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).
  16. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  17. Kartasalo, K., et al. CytoSpectre: a tool for spectral analysis of oriented structures on cellular and subcellular levels. BMC Bioinformatics. 16 (1), 1(2015).
  18. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007(2014).
  19. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28(2014).
  20. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods in Molecular Biology. 1627, 429-451 (2017).
  21. Liu, Y., et al. Fibrillar collagen quantification with curvelet transform based computational methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  22. Conklin, M. W., et al. Collagen alignment as a predictor of recurrence after ductal carcinoma in situ. Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers. 27 (2), 138-145 (2018).
  23. Jallow, F., et al. Dynamic interactions between the extracellular matrix and estrogen activity in progression of ER+ breast cancer. Oncogene. 38 (43), 6913-6925 (2019).
  24. Smirnova, T., et al. Serpin E2 promotes breast cancer metastasis by remodeling the tumor matrix and polarizing tumor associated macrophages. Oncotarget. 7 (50), 82289(2016).
  25. Fanous, M., Keikhosravi, A., Kajdacsy-Balla, A., Eliceiri, K. W., Popescu, G. Quantitative phase imaging of stromal prognostic markers in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1354-1364 (2020).
  26. Jiménez-Torres, J. A., Virumbrales-Muñoz, M., Sung, K. E., Lee, M. H., Abel, E. J., Beebe, D. J. Patient-specific organotypic blood vessels as an in vitro model for anti-angiogenic drug response testing in renal cell carcinoma. EBioMedicine. 42, 408-419 (2019).
  27. Govindaraju, P., Todd, L., Shetye, S., Monslow, J., Puré, E. CD44-dependent inflammation, fibrogenesis, and collagenolysis regulates extracellular matrix remodeling and tensile strength during cutaneous wound healing. Matrix Biology. 75, 314-330 (2019).
  28. Henn, D., et al. Cryopreserved human skin allografts promote angiogenesis and dermal regeneration in a murine model. International Wound Journal. 17 (4), 925-936 (2020).
  29. Rico-Jimenez, J., et al. Non-invasive monitoring of pharmacodynamics during the skin wound healing process using multimodal optical microscopy. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 000974(2020).
  30. Israel, J. S., et al. Quantification of collagen organization after nerve repair. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (12), (2017).
  31. Rentchler, E. C., Gant, K. L., Drapkin, R., Patankar, M., Campagnola, P. J. Imaging collagen alterations in STICs and high grade ovarian cancers in the fallopian tubes by second harmonic generation microscopy. Cancers. 11 (11), 1805(2019).
  32. Hu, C., et al. Imaging collagen properties in the uterosacral ligaments of women with pelvic organ prolapse using spatial light interference microscopy (SLIM). Frontiers in Physics. 7, 72(2019).
  33. Guirado, E., et al. Disrupted protein expression and altered proteolytic events in hypophosphatemic dentin can be rescued by dentin matrix protein 1. Frontiers in Physiology. 11, 82(2020).
  34. Kiss, N., et al. Quantitative analysis on ex vivo nonlinear microscopy images of basal cell carcinoma samples in comparison to healthy skin. Pathology & Oncology Research. 25 (3), 1015-1021 (2019).
  35. Lewis, D. M., et al. Collagen fiber architecture regulates hypoxic sarcoma cell migration. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 400-409 (2018).
  36. Moura, C. C., Bourdakos, K. N., Tare, R. S., Oreffo, R. O., Mahajan, S. Live-imaging of Bioengineered Cartilage Tissue using Multimodal Non-linear Molecular Imaging. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  37. Murtada, S. I., et al. Paradoxical aortic stiffening and subsequent cardiac dysfunction in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Journal of The Royal Society Interface. 17 (166), 0066(2020).
  38. Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gómez, T. M. Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons. Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).
  39. Pointer, K. B., et al. Association of collagen architecture with glioblastoma patient survival. Journal of Neurosurgery. 126 (6), 1812-1821 (2016).
  40. Razavi, M. S., Leonard-Duke, J., Hardie, B., Dixon, J. B., Gleason, R. L. Axial stretch regulates rat tail collecting lymphatic vessel contractions. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  41. Xue, Y., et al. Valve leaflet-inspired elastomeric scaffolds with tunable and anisotropic mechanical properties. Polymers for Advanced Technologies. 31 (1), 94-106 (2020).
  42. Zhou, Z. H., et al. Reorganized collagen in the tumor microenvironment of gastric cancer and its association with prognosis. Journal of Cancer. 8 (8), 1466(2017).
  43. Zinn, A., et al. The small GTPase RhoG regulates microtubule-mediated focal adhesion disassembly. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  44. Zwaans, B. M., et al. Radiation cystitis modeling: A comparative study of bladder fibrosis radio-sensitivity in C57BL/6, C3H, and BALB/c mice. Physiological Reports. 8 (4), (2020).
  45. Devine, E. E., Liu, Y., Keikhosravi, A., Eliceiri, K. W., Jiang, J. J. Quantitative second harmonic generation imaging of leporine, canine, and porcine vocal fold collagen. The Laryngoscope. 129 (11), 2549-2556 (2019).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. Zeitoune, A. A., et al. Epithelial ovarian cancer diagnosis of second-harmonic generation images: A semiautomatic collagen fibers quantification protocol. Cancer Informatics. 16, (2017).
  48. Wershof, E., et al. Matrix feedback enables diverse higher-order patterning of the extracellular matrix. PLoS Computational Biology. 15 (10), 1007251(2019).
  49. Mostaço-Guidolin, L. B., et al. Fractal dimension and directional analysis of elastic and collagen fiber arrangement in unsectioned arterial tissues affected by atherosclerosis and aging. Journal of Applied Physiology. 126 (3), 638-646 (2019).
  50. Thain, D., Tannenbaum, T., Livny, M. Distributed computing in practice: the Condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience. 17 (2-4), 323-356 (2005).

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CT FIRE CurveAlign

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