本方案可对斑马鱼进行长达8周的非侵入性高血糖诱导。利用该方案，可深入研究高血糖的不良影响。
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摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）是研究2型糖尿病（T2DM）典型特征——慢性高血糖——影响的理想模型。该交替浸浴方案是一种无创、逐步诱导高血糖的方法，可持续长达八周。成年斑马鱼交替暴露于糖（葡萄糖）和水中，每次各持续24小时。斑马鱼首先在1%葡萄糖溶液中处理2周，随后在2%溶液中处理2周，最后在3%溶液中处理剩余的4周。与水处理（应激对照）和甘露醇处理（渗透压对照）的对照组相比，葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平显著升高。葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平达到对照组的3倍，表明在处理4周和8周后均可成功诱导高血糖。持续性高血糖与视网膜中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平升高、核因子κB（NF-kB） 水平升高、生理反应减弱以及认知功能缺陷相关，提示该方案可用于模拟糖尿病并发症。
引言
斑马鱼（Danio rerio）正迅速成为研究疾病和认知功能的常用动物模型1。由于其易于进行遗传操作，且在早期发育阶段胚胎具有透明性，因此非常适合用于研究具有明确遗传基础的人类疾病。例如，斑马鱼已被用于研究霍特-奥拉姆综合征、心肌病、肾小球囊性肾病、肌营养不良以及糖尿病（DM）等多种疾病1。此外，由于该物种体型小、易于饲养且繁殖力高，斑马鱼模型尤为理想2,3。
斑马鱼的胰腺在解剖结构和功能上均与哺乳动物胰腺相似4。因此，斑马鱼因其体型小、繁殖力高以及内分泌结构相似等独特特性，成为研究糖尿病（DM）相关并发症的合适候选模型。在斑马鱼中，有两种实验方法可用于诱导糖尿病特征性的长期高血糖状态：葡萄糖负荷（模拟2型糖尿病）和胰岛素分泌终止（模拟1型糖尿病）5,6。实验上，可通过注射链脲佐菌素（STZ）或阿洛酮（Alloxan）化学破坏胰腺β细胞，从而阻断胰岛素分泌。STZ已在啮齿类动物和斑马鱼中成功应用，可导致视网膜病变7,....
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方案
所有实验程序均经美国大学机构动物护理与使用委员会批准。
1. 准备溶液罐
- 获取六个水箱，每个实验组（葡萄糖、甘露醇和水）各两个。将其中一箱标记为“饲养箱”（用于饲养鱼类），另一箱标记为“溶液箱”（用于盛放溶液）。
注意：甘露醇处理组作为渗透压对照组，水处理组作为操作/应激对照组。每个处理组的水箱、通气管/气石、盖子和清洁用品必须分开使用。 - 若使用的鱼总数少于20条，使用2 L的水箱；若使用的鱼总数多于20条，使用4 L的水箱。
注意：每个采样时间点每种处理组使用5-10个样本。 - 将水箱置于28-29 °C的水浴中以维持水温。
- 第1天，将鱼放入各自对应的处理溶液（葡萄糖、甘露醇、水）中处理24小时（“水至处理”）。第2天，将鱼从处理溶液转移至水中24小时（“处理至水”）。第3天，将鱼从水转移至处理溶液中（“水至处理”）。此交替暴露处理持续至实验结束图1). 将经水处理的对照组鱼每天从水中转移至水中。
- 确保在整个实验期间，每天在相同的2小时时间段内对鱼类进行喂食和转移。
2. 准备鱼类
- 使用成年斑马鱼（4个月至1年）5....
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结果
使用本方案（图1），经4周和8周处理后，血糖值均显著升高（图2A），其中高血糖定义为水处理组和甘露醇处理组对照平均值的3倍。水处理对照组每天被转移入和移出水中，以提供应激/操作对照。在体外葡萄糖研究中，甘露醇作为渗透压对照19,20，因为甘露醇是一种与葡萄糖类似的六碳糖，但不会被细胞摄取。为了与这些研究以及其他斑马鱼研究21保持一致，我们以与葡萄糖相同的浓度给予甘露醇，以确定所观察到的效应是由于葡萄糖暴露引起的高渗透压所致，还是葡萄糖特异性的效应。
通过使用0.02%三卡因将鱼麻醉至鳃部运动减缓，然后进行断头处理，以采集血液样本。血糖水平通过血糖仪（图2B）测定，将血糖仪试纸直接接触穿刺后的心脏（即心腔血液）进行检测。
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讨论
糖尿病是一个全国性的问题。研究表明，到2030年，预计有约4亿人将患有某种形式的糖尿病。在啮齿类动物模型中，2型糖尿病（Type 2 DM）通常通过基因操作进行研究。在大鼠中，Zucker糖尿病性肥胖大鼠（ZDF）和Otsuka Long-Evans Tokushima肥胖大鼠（OLETF）为研究2型糖尿病的影响提供了更多信息10。此外，高脂饮食已被用于在啮齿类动物中诱导高血糖。这与本文提出的非侵入性方法类似。通过使用我们的非侵入性方案，我们可以在原本健康的斑马鱼中诱导长达8周的高血糖状态，从而模拟持续性高血糖。
在测量血糖后，可采集组织（视网膜和脑）用于后续分析。生理学差异，例如视网膜电图（ERG）记录，可直接从视网膜眼杯中测量21,30。行为反应（如视动反应）或认知差异（Rowe et al., 2020）可在测量血糖前进行评估。用于通过Western Blot检测蛋白水平时，将组织置于RIPA裂解液中，或进行速冻.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢VPC、CJR和MCP在本实验方案开发过程中的贡献。EMM获得了美国大学文理学院研究生支持基金的资助，以开展本项研究。 本工作还得到了美国大学教师梅隆奖以及美国大学文理学院经费的支持（均授予VPC）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 输气管 | petsmart | 5291863 | 可用于水族箱中空气的循环 |
| 气泵 | petsmart | 5094984 | 可用于水族箱中空气的循环 |
| 气石 | petsmart | 5149683 | 可用于水族箱中空气的循环 |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8270-5KG | |
| D-甘露醇 | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite 血糖仪 | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite 测试条 | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| 捞网 | petsmart | 5175115 | |
| 水族箱 | Amazon | B0002APZO4 |
参考文献
- Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 24....
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重印与许可
