交替葡萄糖浸泡法诱导斑马鱼持续高血糖

摘要

本方案可对斑马鱼进行长达8周的非侵入性高血糖诱导。利用该方案，可深入研究高血糖的不良影响。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）是研究2型糖尿病（T2DM）典型特征——慢性高血糖——影响的理想模型。该交替浸浴方案是一种无创、逐步诱导高血糖的方法，可持续长达八周。成年斑马鱼交替暴露于糖（葡萄糖）和水中，每次各持续24小时。斑马鱼首先在1%葡萄糖溶液中处理2周，随后在2%溶液中处理2周，最后在3%溶液中处理剩余的4周。与水处理（应激对照）和甘露醇处理（渗透压对照）的对照组相比，葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平显著升高。葡萄糖处理组斑马鱼的血糖水平达到对照组的3倍，表明在处理4周和8周后均可成功诱导高血糖。持续性高血糖与视网膜中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平升高、核因子κB（NF-kB） 水平升高、生理反应减弱以及认知功能缺陷相关，提示该方案可用于模拟糖尿病并发症。

引言

斑马鱼（Danio rerio）正迅速成为研究疾病和认知功能的常用动物模型¹。由于其易于进行遗传操作，且在早期发育阶段胚胎具有透明性，因此非常适合用于研究具有明确遗传基础的人类疾病。例如，斑马鱼已被用于研究霍特-奥拉姆综合征、心肌病、肾小球囊性肾病、肌营养不良以及糖尿病（DM）等多种疾病¹。此外，由于该物种体型小、易于饲养且繁殖力高，斑马鱼模型尤为理想^2,3。

斑马鱼的胰腺在解剖结构和功能上均与哺乳动物胰腺相似⁴。因此，斑马鱼因其体型小、繁殖力高以及内分泌结构相似等独特特性，成为研究糖尿病（DM）相关并发症的合适候选模型。在斑马鱼中，有两种实验方法可用于诱导糖尿病特征性的长期高血糖状态：葡萄糖负荷（模拟2型糖尿病）和胰岛素分泌终止（模拟1型糖尿病）^5,6。实验上，可通过注射链脲佐菌素（STZ）或阿洛酮（Alloxan）化学破坏胰腺β细胞，从而阻断胰岛素分泌。STZ已在啮齿类动物和斑马鱼中成功应用，可导致视网膜病变^7,8,9、认知功能障碍¹⁰以及肢体再生受损¹¹等并发症。然而，在斑马鱼中，β细胞在处理后会再生，因此需要多次“加强注射”STZ以维持糖尿病状态¹²。另一种方法是手术切除斑马鱼胰腺⁶。这两种方法均为高度侵入性操作，需多次注射且恢复时间较长。

相反，可通过接触外源性葡萄糖无创地诱导高血糖。在本方案中，将鱼类浸入高浓度葡萄糖溶液中24小时^5,13，或持续2周^14,15,16。外源性葡萄糖通过皮肤、摄食和/或鳃部吸收，导致血糖水平升高。由于这种非侵入性技术并不直接操控胰岛素水平，因此不能声称可诱导2型糖尿病（Type 2 DM）。然而，该方法可用于研究由高血糖引起的并发症，而高血糖正是2型糖尿病的主要症状之一。

最近，研究人员通过操控胰腺和十二指肠同源框基因1（pancreatic and duodenal homeobox 1）构建了斑马鱼pdx1^-/-突变体，该基因与人类2型糖尿病（DM）的遗传病因相关。利用该突变体，研究人员能够模拟胰腺发育异常、高血糖，并研究高血糖诱导的糖尿病性视网膜病变^17,18。

本文介绍了一种利用交替浸泡方案实现无创性高血糖诱导的方法。该方案可维持高血糖状态长达8周，并观察到后续出现的并发症。简言之，将成年斑马鱼置于糖溶液中24小时，随后转入清水溶液中24小时。与持续浸泡于外源性葡萄糖溶液不同，糖液与清水交替处理可模拟糖尿病中血糖水平的波动变化。此外，采用葡萄糖交替处理方案还能延长高血糖诱导的时间，因为斑马鱼在交替暴露于高浓度外源性葡萄糖环境时，其代偿能力较弱。为验证该方法的可行性，我们提供了实验数据，表明采用此方案诱导的高血糖会改变视网膜的化学成分与生理状态。

方案

所有实验程序均经美国大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 准备溶液罐

1. 获取六个水箱，每个实验组（葡萄糖、甘露醇和水）各两个。将其中一箱标记为“饲养箱”（用于饲养鱼类），另一箱标记为“溶液箱”（用于盛放溶液）。
   注意：甘露醇处理组作为渗透压对照组，水处理组作为操作/应激对照组。每个处理组的水箱、通气管/气石、盖子和清洁用品必须分开使用。
2. 若使用的鱼总数少于20条，使用2 L的水箱；若使用的鱼总数多于20条，使用4 L的水箱。
   注意：每个采样时间点每种处理组使用5-10个样本。
3. 将水箱置于28-29 °C的水浴中以维持水温。
4. 第1天，将鱼放入各自对应的处理溶液（葡萄糖、甘露醇、水）中处理24小时（“水至处理”）。第2天，将鱼从处理溶液转移至水中24小时（“处理至水”）。第3天，将鱼从水转移至处理溶液中（“水至处理”）。此交替暴露处理持续至实验结束图1). 将经水处理的对照组鱼每天从水中转移至水中。
5. 确保在整个实验期间，每天在相同的2小时时间段内对鱼类进行喂食和转移。

2. 准备鱼类

1. 使用成年斑马鱼（4个月至1年）⁵。
2. 鱼类到达实验室后，每天投喂碾碎的Tetramin鱼粮。
3. 记录所有鱼缸的pH值和温度，并记录鱼类的一般状况。

3. 转移鱼类

1. 使用标准的鱼网将每个处理组的鱼从饲养箱转移到相应的溶液箱中。
2. 将装有鱼的箱子放回水浴中，并重新安装气石和箱盖。此时该箱成为“饲养箱”，而先前盛放鱼的箱子则成为“溶液箱”。
3. 弃去旧溶液，并清洗箱子以及箱盖、通气管、气石和鱼网，以防止葡萄糖和甘露醇的残留积累。
   注意：请勿使用肥皂清洗器具。应使用清水，并为每种处理条件配备专用的刷子或海绵，以彻底清洁箱子。
4. 用纸巾将新清洗完毕的“溶液箱”擦干。使用该箱配制次日所需的溶液。确保其他器具也已擦干，并按相应的处理组分开存放。
   注意：应记录每天鱼类转移所离开和进入的溶液，以及为次日配制的溶液。例如：鱼类从葡萄糖溶液转移至H₂O，为明天配制新的1%葡萄糖溶液。

4. 转移后溶液的配制

1. 配制糖溶液
   1. 向每个溶液罐中加入 2 L（或 4 L）系统用水（系统用水定义为已按正确比例添加盐溶液，并且温度与储备罐和处理罐相同的水）。
   2. 使用电子天平和各自的称量舟，分别称取所需量的葡萄糖和甘露醇（参见下文步骤 5）。
   3. 将称量好的葡萄糖或甘露醇等分试样加入相应且已清洁的溶液罐中，罐内仅含系统用水。
   4. 使用不同的玻璃搅拌棒分别搅拌葡萄糖和甘露醇溶液，直至糖完全溶解。
   5. 将溶液罐放回水浴中，并盖上相应的盖子。
2. 配制水溶液
   1. 向实验罐（2 L 或 4 L）中加入系统用水。
   2. 将这些“溶液罐”放回水浴中，并盖上相应的盖子。

5. 百分比的变化

1. 在治疗的前两周内，将鱼维持在1%的溶液中：在4 L水箱中加入40 g葡萄糖或甘露醇。
2. 在治疗的第3周和第4周，将鱼维持在2%的溶液中：在4 L水箱中加入80 g葡萄糖或甘露醇。
3. 在治疗的最后4周内，将鱼维持在3%的溶液中：在4 L水箱中加入120 g葡萄糖或甘露醇。

6. 测量血糖水平和采集组织

1. 每次使用0.02%的三卡因溶液麻醉两条鱼。
2. 使用剃刀在鳃后方直接切断鱼头。
3. 测量血糖值。
   注意：我们使用血糖仪（例如Freestyle Lite）测量血糖，并将试纸直接接触暴露的心脏（心脏血液样本）。
4. 从鱼体内解剖所需组织（如脑、肌肉等）。
5. 将采集的组织置于干冰上速冻后保存于-80 °C冰箱中，或用4%多聚甲醛固定，或放入缓冲液中以备立即使用。

结果

使用本方案（图1），经4周和8周处理后，血糖值均显著升高（图2A），其中高血糖定义为水处理组和甘露醇处理组对照平均值的3倍。水处理对照组每天被转移入和移出水中，以提供应激/操作对照。在体外葡萄糖研究中，甘露醇作为渗透压对照^19,20，因为甘露醇是一种与葡萄糖类似的六碳糖，但不会被细胞摄取。为了与这些研究以及其他斑马鱼研究²¹保持一致，我们以与葡萄糖相同的浓度给予甘露醇，以确定所观察到的效应是由于葡萄糖暴露引起的高渗透压所致，还是葡萄糖特异性的效应。

通过使用0.02%三卡因将鱼麻醉至鳃部运动减缓，然后进行断头处理，以采集血液样本。血糖水平通过血糖仪（图2B）测定，将血糖仪试纸直接接触穿刺后的心脏（即心腔血液）进行检测。

讨论

糖尿病是一个全国性的问题。研究表明，到2030年，预计有约4亿人将患有某种形式的糖尿病。在啮齿类动物模型中，2型糖尿病（Type 2 DM）通常通过基因操作进行研究。在大鼠中，Zucker糖尿病性肥胖大鼠（ZDF）和Otsuka Long-Evans Tokushima肥胖大鼠（OLETF）为研究2型糖尿病的影响提供了更多信息¹⁰。此外，高脂饮食已被用于在啮齿类动物中诱导高血糖。这与本文提出的非侵入性方法类似。通过使用我们的非侵入性方案，我们可以在原本健康的斑马鱼中诱导长达8周的高血糖状态，从而模拟持续性高血糖。

在测量血糖后，可采集组织（视网膜和脑）用于后续分析。生理学差异，例如视网膜电图（ERG）记录，可直接从视网膜眼杯中测量^21,30。行为反应（如视动反应）或认知差异（Rowe et al., 2020）可在测量血糖前进行评估。用于通过Western Blot检测蛋白水平时，将组织置于RIPA裂解液中，或进行速冻...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
输气管	petsmart	5291863	可用于水族箱中空气的循环
气泵	petsmart	5094984	可用于水族箱中空气的循环
气石	petsmart	5149683	可用于水族箱中空气的循环
D-葡萄糖	Sigma	G8270-5KG
D-甘露醇	Acros Organics	AC125340050
Freestyle Lite 血糖仪	Amazon	B01LMOMLTU
Freestyle Lite 测试条	Amazon	B074ZN3H2Z
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