缺氧是肿瘤微环境的显著特征，在癌症进展中发挥关键作用。本文介绍了一种基于3D细胞打印技术的缺氧肿瘤芯片的制备过程，用于模拟与缺氧相关的癌症病理特征。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤微环境对疾病进展具有重要影响。特别是缺氧，是驱动肿瘤存活、侵袭和化疗耐药的关键因素。尽管已开发出多种体外模型用于研究与缺氧相关的肿瘤病理过程，但由于缺乏精确的空间控制，目前尚未能重现体内所观察到的肿瘤微环境的复杂相互作用 。为此，人们提出了三维生物制造方法，以构建微生理系统，更真实地模拟肿瘤生态，并实现更准确的抗癌治疗评估。本文中，我们提出一种三维细胞打印方法，用于构建一种缺氧肿瘤芯片。芯片中诱导缺氧的结构参数基于氧气分布的计算机模拟确定。利用含有胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞的生物墨水，打印出肿瘤-间质同心环结构，以模拟一种实体瘤。所构建的芯片成功实现了肿瘤中心区域的缺氧状态，并伴随典型病理生理标志物的形成，导致肿瘤恶性程度加剧。总体而言，该构建实体瘤模拟微生理系统的方法有望弥合肿瘤研究中体内与体外模型之间的差距。
引言
肿瘤微环境是驱动肿瘤进展的关键因素。多种组分，包括生化、生物物理和细胞信号，共同决定了肿瘤的病理特征。其中，缺氧与肿瘤的存活、增殖和侵袭密切相关1。由于肿瘤细胞无限生长和分裂，营养物质和氧气被持续消耗，从而形成缺氧梯度。在低氧条件下，细胞会激活缺氧诱导转录因子（HIF）相关的分子级联反应。该过程可诱导坏死核心的形成，触发代谢改变，并启动血管增生和转移2,3。随后，肿瘤细胞中的缺氧状态会导致邻近正常组织的破坏。此外，缺氧还通过多种因素与实体瘤的治疗耐药性密切相关。缺氧可能严重阻碍放射治疗的效果，因为活性氧物质的生成受限，导致放射敏感性降低1,4。此外，缺氧会降低肿瘤微环境的pH值，从而减少药物的蓄积1。因此，在体外重现与缺氧相关的病理特征，是推动科学发现和临床前研究的一种有前景的策略。
构建特定的癌症微环境对于理解癌症的发生发展及探索合适的治疗方法至关重要。尽管动物模型因其较强的生理相关性而被广泛使用，但仍存在物种差异和伦理问题5。此外，虽然传统的二维（2D）和三维（3D）模型能够对癌细胞进行操控和实时成....
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方案
1. 氧气梯度形成的计算机模拟
- 用于缺氧肿瘤芯片打印的三维几何模型构建
- 运行一款三维计算机辅助设计（CAD）软件。
- 绘制缺氧肿瘤芯片的几何模型。点击草图，并选择所需的绘图平面。参考绘图（图2A）中各部分的具体尺寸。
- 通过点击特征-凸台/基体设置几何体的厚度。在空白框中输入所需厚度（参考图2A），然后选择绿色对勾图标以生成三维几何体。
注：肿瘤芯片的尺寸根据培养基和水凝胶的预期体积确定。在本实验中，基于以往挤出式生物打印机操作经验，培养基和水凝胶的预期体积分别约为1,500 µL和500 µL。 - 将几何模型文件保存为三维CAD文件格式（.prt 或 .stl）。
- 确定诱导缺氧核心的细胞密度
- 运行物理扩散模拟程序。
- 点击LiveLink并选择所使用的CAD程序。点击同步，将缺氧肿瘤芯片的几何结构导入模拟程序中。在实际实验条件下，腔室内部空间将充满培养基，氧气将在腔室内部空间及由载细胞水凝胶构成的细胞结....
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结果
利用计算机辅助的3D细胞打印技术开发了缺氧肿瘤芯片，以模拟缺氧环境及相关癌症病理特征（图1）。通过3D几何模型模拟了氧气的运输与消耗过程。该芯片设计为同心环结构，以模拟肿瘤组织中氧气的径向扩散与耗竭（图2A）。在确定氧气扩散并被细胞消耗的空间控制体积后，通过计算有限元分析确定了产生中心缺氧所需的适当细胞密度（图2B、C）。
基于先前结果生成了缺氧肿瘤芯片的3D打印路径代码（图3）。牺牲性PEVA模具和肿瘤结构的CAD文件被转换为STL文件格式（图3A、B）。通过自主开发的软件程序将打印路径编.......
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讨论
本研究描述了一种基于3D细胞打印技术的缺氧肿瘤芯片的制备过程。通过计算机模拟预测了所设计芯片中缺氧梯度的形成。结合3D打印的透气屏障与玻璃盖片的简单策略，成功再现了可诱导异质性缺氧梯度的微环境。在芯片构建的缺氧梯度条件下，重现了胶质母细胞瘤相关的缺氧病理特征，包括假栅栏样结构及少量癌干细胞群体。
为了提高生产效率和可重复性，与先前发表的模型相比，对两个主要的制备步骤进行了依次改进15。首先，间接制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）屏障，以克服含有固化剂的PDMS因实时固化而导致的打印性能差的问题，而非采用一步式直接打印方法。因此，选用具有更高打印性能的生物相容性聚乙烯-醋酸乙烯酯（PEVA）来制备牺牲模具，并填充PDMS以形成透气屏障。其次，将载玻片类型更换为具有亲水涂层的载玻片，有利于生物墨水的沉积并保持形状保真度。最后，通过在芯片两端构建培养基储液池，实现了高效的培养基交换。
通过3D生物打印制备缺氧肿瘤芯片的每一步骤中的关键因素都应谨慎控制。在浇铸过程中，聚二甲基硅氧烷（PDMS.......
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致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由教育部门（编号：2020R1A6A1A03047902 和 NRF-2018H1A2A1062091）以及韩国政府（MSIT）（编号：NRF-2019R1C1C1009606 和 NRF-2019R1A3A3005437）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞 | |||
| 人脐静脉内皮细胞 | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG 细胞 | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| 一次性耗材 | |||
| 0.2 μm 注射器滤器 | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL 一次性注射器 | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL 玻璃小瓶 | Hubena | A0039 | |
| 10 mL 血清移液管吸头 | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL 锥形管 | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G 塑料针头 | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G 塑料锥形分配吸头 | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22x50 玻璃盖玻片 | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL 血清移液管吸头 | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL 一次性注射器 | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm 细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 5 mL 血清移液管吸头 | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL 锥形管 | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL 血清移液管吸头 | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N 精密喷嘴 | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| 铝箔 | SINKWANG | ||
| 毛细管吸头 | Gilson | CP1000 | |
| 细胞刮刀 | SPL lifescience | 90030 | |
| 共聚焦培养皿 | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM996 | |
| 预包被组织学载玻片 | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| 试剂槽 | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 细胞培养瓶 | SPL lifescience | 70075 | |
| 设备 | |||
| 3DX 打印机 | T&R Biofab | ||
| 高压灭菌器 | JEIOTECH | AC-12 | |
| 离心机 | Cyrozen | 1580MGR | |
| 共聚焦激光显微镜 | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| 荧光显微镜 | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| 镊子 | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| 手持计数器 | KTRIO | ||
| 血细胞计数板 | MARIENFIELD | 0650030 | |
| 培养箱 | Panasonic | MCO-170AIC | |
| 超净工作台 | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| 金属注射器 | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| 手术剪刀 | Hirose | HC.13-122 | |
| 烘箱 | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| 正向置换移液器 | GILSON | NJ05652 | |
| 冰箱 | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex 混匀仪 | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| 水浴锅 | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| 纯水仪 | WASSER LAB | DI-GR | |
| 材料 | |||
| 0.25 % 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% 多聚甲醛 | Biosesang | ||
| 70% 乙醇 | Daejung | 4018-4410 | |
| 抗 CD31 抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 抗 HIF-1 alpha 抗体 | Abcam | ab16066 | |
| 抗 SHMT2/SHMT 抗体 | Abcam | ab88664 | |
| 抗 SOX2 抗体 | Abcam | ab75485 | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo scientific | J10857-22 | |
| 猪皮来源胶原蛋白 | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | Thermofisher | D1306 | |
| 内皮细胞生长培养基-2 | Promocell | C22011 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483-020 | |
| 山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Theromofisher | A-11001 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 标记 | Theromofisher | A-11012 | |
| 高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Hyclone | SH30243-0 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| 活/死细胞检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 | |
| 小鼠 IgG1，κ 单克隆抗体 [15-6E10A7] - 同型对照 | Abcam | ab170190 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| 聚（乙烯-醋酸乙烯酯） | Poly science | 06108-500 | |
| 聚二甲基硅氧烷 | Dowhitech | sylgard 184 | |
| 兔 IgG，多克隆 - 同型对照 | Abcam | ab37415 | |
| 氢氧化钠溶液 | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 软件 | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | 内部开发软件 | ||
| SolidWorks 软件包 | Dassault Systems SolidWorks Corporation |
参考文献
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157(2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Ce....
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重印与许可
