方法文章

3D细胞打印缺氧肿瘤芯片用于模拟实体癌的病理进展

DOI：

10.3791/61945

⸱

2021年1月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2Department of Creative IT Engineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 3Department of Rural and Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences, Chonnam National University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

缺氧是肿瘤微环境的显著特征，在癌症进展中发挥关键作用。本文介绍了一种基于3D细胞打印技术的缺氧肿瘤芯片的制备过程，用于模拟与缺氧相关的癌症病理特征。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤微环境对疾病进展具有重要影响。特别是缺氧，是驱动肿瘤存活、侵袭和化疗耐药的关键因素。尽管已开发出多种体外模型用于研究与缺氧相关的肿瘤病理过程，但由于缺乏精确的空间控制，目前尚未能重现体内所观察到的肿瘤微环境的复杂相互作用 。为此，人们提出了三维生物制造方法，以构建微生理系统，更真实地模拟肿瘤生态，并实现更准确的抗癌治疗评估。本文中，我们提出一种三维细胞打印方法，用于构建一种缺氧肿瘤芯片。芯片中诱导缺氧的结构参数基于氧气分布的计算机模拟确定。利用含有胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞的生物墨水，打印出肿瘤-间质同心环结构，以模拟一种实体瘤。所构建的芯片成功实现了肿瘤中心区域的缺氧状态，并伴随典型病理生理标志物的形成，导致肿瘤恶性程度加剧。总体而言，该构建实体瘤模拟微生理系统的方法有望弥合肿瘤研究中体内与体外模型之间的差距。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤微环境是驱动肿瘤进展的关键因素。多种组分，包括生化、生物物理和细胞信号，共同决定了肿瘤的病理特征。其中，缺氧与肿瘤的存活、增殖和侵袭密切相关1。由于肿瘤细胞无限生长和分裂，营养物质和氧气被持续消耗，从而形成缺氧梯度。在低氧条件下，细胞会激活缺氧诱导转录因子（HIF）相关的分子级联反应。该过程可诱导坏死核心的形成，触发代谢改变，并启动血管增生和转移2,3。随后，肿瘤细胞中的缺氧状态会导致邻近正常组织的破坏。此外，缺氧还通过多种因素与实体瘤的治疗耐药性密切相关。缺氧可能严重阻碍放射治疗的效果，因为活性氧物质的生成受限，导致放射敏感性降低1,4。此外，缺氧会降低肿瘤微环境的pH值，从而减少药物的蓄积1。因此，在体外重现与缺氧相关的病理特征，是推动科学发现和临床前研究的一种有前景的策略。

构建特定的癌症微环境对于理解癌症的发生发展及探索合适的治疗方法至关重要。尽管动物模型因其较强的生理相关性而被广泛使用，但仍存在物种差异和伦理问题5。此外，虽然传统的二维（2D）和三维（3D）模型能够对癌细胞进行操控和实时成像，从而实现深入分析，但其结构和细胞复杂性无法被完全重现。例如，癌症类球体模型已被广泛应用，因为癌细胞在类球体中的聚集可自然形成核心区域的缺氧环境。此外，已有研究利用基于塑料或硅胶的多孔系统成功制备出大量大小均一的细胞类球体6,7。然而，传统平台在精确模拟癌组织异质性结构方面灵活性较低，因此亟需建立先进的生物制造技术，以构建高度仿生的实验平台，推动癌症研究的进步8。

三维微生理系统（MPSs）是重现癌细胞复杂几何结构和病理进展过程的有用工具9。当癌细胞感知系统中复制的生长因子和趋化因子的生化梯度以及机械异质性时，可在体外研究癌症发展的重要特征。例如，已有研究利用MPSs探讨了在不同氧浓度条件下癌细胞的存活能力、转移性恶性行为以及耐药性10,11。尽管近年来取得了进展，但体外模型中缺氧环境的构建仍依赖于复杂的制备工艺，包括连接物理气体泵。因此，亟需简单且灵活的方法来构建癌症特异性的微环境。

由于能够精确控制生物材料的空间排列以重现天然生物结构，3D细胞打印技术已受到广泛关注12。特别是该技术凭借其高度可控性和可行性，可构建肿瘤微环境的空间特征，从而克服了现有3D缺氧模型的局限性。此外，3D打印通过逐层加工实现计算机辅助制造，能够快速、准确且可重复地构建复杂几何结构，以模拟真实组织架构。除了具备现有3D微生理系统（MPS）制造策略的优势外，还可通过调控生化、细胞和生物物理组分的图案化，重现癌症进展的病理生理特征13,14。

本文提出了一种用于构建缺氧型癌症芯片的三维细胞打印策略，以模拟实体肿瘤的异质性（图1）15。通过计算模拟系统中中心缺氧区域的形成，确定了器件的制备参数。利用含有胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞的胶原蛋白生物墨水，打印出癌组织-间质同心环结构，以模拟胶质母细胞瘤（一种实体肿瘤）的病理生理特征。径向氧浓度梯度的形成加剧了肿瘤的恶性程度，表明其侵袭性增强。此外，我们还展望了该芯片在患者特异性临床前模型中的应用前景。所提出的构建实体肿瘤模拟微生理系统的方法，有望弥合体内与体外癌症模型之间的差距。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 氧气梯度形成的计算机模拟

  1. 用于缺氧肿瘤芯片打印的三维几何模型构建
    1. 运行一款三维计算机辅助设计（CAD）软件。
    2. 绘制缺氧肿瘤芯片的几何模型。点击 草图 ，并选择所需的平面以绘制几何图形。参考绘图（图2A）中各部分的具体尺寸。
    3. 通过点击 特征-凸台/基体 设置几何体的厚度。在空白框中输入所需厚度（参考 图2A），然后选择绿色对勾图标以生成三维几何体。
      注：肿瘤芯片的尺寸根据所需的培养基和水凝胶体积确定。在本实验中，基于以往挤出式生物打印机操作经验，培养基和水凝胶的期望体积分别约为 1,500 µL 和 500 µL。
    4. 将几何文件保存为三维CAD文件格式（.prt 或 .stl）。
  2. 确定诱导缺氧核心的细胞密度
    1. 运行物理扩散模拟程序。
    2. 点击 LiveLink 并选择所使用的CAD程序。点击 同步 ，将缺氧肿瘤芯片的几何结构导入模拟程序中。由于在实际实验条件下，腔室内部空间将被培养基填充，氧气将在腔室内部空间及细胞结构（由载细胞水凝胶构成）中扩散。
      注：有关物理参数的详细信息，请参考先前的研究15。
    3. 将导入的三维几何体定义为氧气扩散及细胞耗氧区域的控制体积（图2B）。
    4. 根据用户指南和已建立的方法16,17，运行气体扩散的计算机分析。
    5. 根据用户指南，从计算机分析结果中导出每个时间点沿横截面 A-A' 的估计氧浓度数据。控制方程基于菲克第一定律，如公式（1）所示（图2C）。
      化学反应-扩散方程，∂c/∂t + ∇·(-D∇c) = -Ncell(vO2,maxc)/(Km+c)，公式分析。
      其中 c 为浓度，D 为氧气扩散系数，Ncell 为细胞密度，VO2 max公式，最大摄氧量符号，运动生理学研究中的关键指标。 为氧气最大摄取速率，Km 为米氏常数。各常数的取值依据先前发表的研究15。
      注：每个时间点表示用于观察随时间变化的氧气扩散情况的时间步长。
    6. 评估最低氧水平是否达到缺氧阈值，并通过增加或减少细胞密度重复计算机分析过程。
      注：若在24小时后，水凝胶区域中80%区域的氧浓度低于0.02 mM，则可判定该结构中形成了缺氧梯度。
    7. 结合步骤1.2.5中基于菲克第一定律的计算以及步骤1.2.6的模拟结果，确认在中心区域诱导缺氧氧梯度所需的细胞数量。
      注：在本方案中，每个结构的细胞数量为 2 × 106 个细胞。

2. 肿瘤细胞与间质细胞的细胞培养

  1. 避免生理应激的细胞培养基制备
    1. 对于U-87 MG细胞（永生化人胶质母细胞瘤细胞系），在T-75细胞培养瓶中加入12 mL含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle培养基，置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育30分钟，以最大程度减少培养基对细胞的热效应和碱性影响。
      注：选择胶质母细胞瘤作为实体癌类型，因其在缺氧环境中具有侵袭性特征。该模型也可适用于其他多种类型的癌症。
    2. 对于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），在T-75细胞培养瓶中加入12 mL内皮细胞生长培养基，置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育30分钟。
      注：选择HUVECs是因为其是最具代表性的内皮细胞系之一。该模型也可适用于多种类型的间质细胞。
  2. 冻存癌细胞和间质细胞的快速解冻及其培养维持
    1. 将装有5 × 105个U-87 MG细胞和HUVECs的冻存管从液氮罐转移至超净工作台。立即松开并重新拧紧管盖，以释放内部压力。
    2. 将冻存细胞轻轻放入37 °C水浴中解冻2分钟，保持管盖不接触水。在超净工作台中用70%乙醇冲洗冻存管表面，以防污染。
    3. 将解冻后的细胞转移至步骤2.1中所述的已准备好的细胞培养基所在的培养瓶中，并将含细胞的培养瓶置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中进行细胞复苏。
    4. 每2天更换一次细胞培养基，维持细胞生长。
    5. 解冻24小时后更换细胞培养基，以避免用于细胞冻存的二甲基亚砜（DMSO）产生的细胞毒性。使用传代次数少于6次的HUVECs。

3. 胶原蛋白预凝胶溶液的制备

  1. 用0.1 N盐酸（HCl）溶解胶原海绵
    1. 配制0.1 N HCl溶液，并使用0.2 µm针头滤器过滤。
    2. 为制备3 mL的1%（w/v）中和胶原预凝胶溶液，将胶原海绵切成5 × 5 mm2的小块，每块重30 mg。
    3. 将切好的胶原碎片转移至一个无菌的10 mL玻璃小瓶中。
      注：考虑到胶原溶液具有黏性，可能导致水凝胶损失，建议按所需胶原水凝胶体积的1.5倍进行制备。
    4. 向含有胶原的玻璃小瓶中加入2.4 mL的0.1 N HCl，在4 °C、15 rpm条件下于摇床上孵育3天。
      注：0.1 N HCl溶液的体积为所需最终胶原水凝胶体积的五分之四。本例中，制备3 mL胶原溶液。
    5. 消化完成后，使用40 µm细胞筛过滤未消化的胶原颗粒。将酸性胶原溶液储存于4 °C，7天内使用完毕。
  2. 1%中和胶原预凝胶溶液的pH调节
    1. 在4 °C条件下，以1224 × g离心酸性胶原溶液5分钟。
    2. 向胶原预凝胶溶液中加入30 µL酚红溶液，使其终浓度为1%（v/v），并加入300 µL 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），使其终浓度为10%（v/v）。
    3. 用1 N氢氧化钠（NaOH）将pH中和至7，通过颜色变化确认中和效果。
      注：根据公式，H+的摩尔数 = H+的摩尔浓度 × H+体积 = OH-的摩尔数 = OH-的摩尔浓度 × OH-体积，需加入240 µL NaOH。
    4. 加入蒸馏水，定容至总体积为3 mL。
    5. pH调节完成后，将1%（w/v）中和胶原预凝胶溶液储存于4 °C，3天内使用完毕。
      注：为预先检测中和胶原预凝胶溶液的凝胶化能力，可使用正向置换移液器在小培养皿中制备50 µL胶原液滴，并在37 °C培养箱中孵育1小时。参考以下三种方法验证胶原液滴的交联情况。
    6. 检查胶原颜色是否由透明变为不透明的白色。
    7. 倾斜容器，观察胶原是否黏附在容器底部。
    8. 向液滴上轻轻加入1× PBS，观察胶原结构在溶液中是否保持完整而不破裂。

4. 气体可渗透屏障的3D打印

  1. 牺牲性聚（乙烯-醋酸乙烯酯）（PEVA）模具的3D打印
    1. 使用3D CAD软件生成步骤1中定义的牺牲性PEVA模具的3D几何结构（图3A）。
      注：3D几何结构及包含尺寸、单位和线型在内的详细模型比例见图2A。
    2. 点击文件 | 另存为STL格式，将3D CAD文件转换为STL文件格式。同时，点击选项 | 输出格式为ASCII，以生成G代码。
    3. 点击文件 | 打开STL文件，选择已保存的STL文件以导入生成的STL文件。点击STL-CAD转换器中的切片模型，自动生牺牲性PEVA模具的G代码（图3B，C）。
      注：打印路径通过STL文件的基本图形与切片平面（即层）之间的交点连接而生成。STL文件中片段的基本图形为包含三维坐标的三角形。在获得三角形与层之间的交点后，通过连接各点并在同一层上避免路径重叠的方式生成打印用G代码18。可使用任何板载软件中的G代码生成算法来为芯片制造生成打印路径。
    4. 准备无菌亲水性组织学载玻片。
      注：亲水性载玻片对聚二甲基硅氧烷（PDMS）在玻璃上的永久键合，以及包封癌细胞和基质细胞的胶原结构的粘附至关重要。
    5. 使用50 G精密喷嘴，在110 °C和500 kPa气压条件下将牺牲性PEVA模具直接打印在载玻片上。
      注：线宽受进料速率、喷嘴规格和材料温度的影响。本实验采用50 G喷嘴，设定进料速率为400，以生成500 µm线宽的牺牲壁。喷嘴规格、气压和进料速率均基于实际实验结果确定19。牺牲壁必须足够厚，以承载下一步中注入的PDMS溶液。
  2. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）屏障的浇铸
    1. 在塑料储液器中将6 mL PDMS基础弹性体与0.6 mL固化剂均匀混合，持续5分钟。考虑到PDMS的黏性导致的损耗，该配比可制备6个缺氧肿瘤芯片。
    2. 将混合后的PDMS溶液装入10 mL一次性注射器，并在注射器前端安装20 G塑料锥形分配尖端。
    3. 用注射器中的混合PDMS溶液填充牺牲性PEVA模具。混合后的PDMS将填满牺牲性PEVA模具，并形成凸面。PDMS屏障的高度将高于PEVA模具。
    4. 将PDMS屏障置于40 °C烘箱中固化超过36小时，以避免PEVA熔化。切勿将温度升至88 °C以上，因该温度为PEVA的熔点。
    5. 使用精密镊子移除牺牲性PEVA模具，并在高压灭菌器中于120 °C对透气屏障进行灭菌处理。

5. 细胞包埋胶原生物墨水的制备

  1. 分离制备好的癌细胞和基质细胞
    注意：考虑到细胞活力，应在细胞脱离后尽快完成整个打印过程。
    1. 使用移液管加入 10 mL 1× PBS 洗涤癌细胞和基质细胞；再加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，混匀后于 37 °C 孵育 3 分钟。
    2. 加入 3 mL 细胞培养基中和胰蛋白酶；将细胞悬液收集至 15 mL 圆锥形离心管中，在 20 °C 下以 516 × g 离心 5 分钟。
    3. 缓慢吸除上清液；将细胞沉淀用 5 mL 细胞培养基重悬，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
    4. 将每种细胞类型的 5 × 106 个细胞转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中，在 20 °C 下以 516 × g 离心 5 分钟。
    5. 吸除上清液，并将细胞沉淀置于湿冰上保存。
  2. 将每种细胞类型与 1% 中和胶原蛋白预凝胶溶液混合
    注意：为避免 1% 中和胶原蛋白预凝胶溶液发生热诱导凝固，该步骤应在湿冰上操作。
    1. 将步骤 5.1.4 中收集的每种细胞沉淀分别用 20 µL 细胞培养基重悬。
    2. 向每种重悬的细胞悬液中加入 1 mL 1% 中和胶原蛋白预凝胶溶液，使用正向置换移液器充分混匀。最终每种细胞的浓度为 5 × 106 个细胞/mL。
    3. 使用一次性正向移液器将包载细胞的胶原蛋白生物墨水转移至 3 mL 一次性注射器中，于 4 °C 保存，直至进行 3D 细胞打印。

6. 癌症-间质三维细胞打印同心环

  1. 包埋癌细胞与基质细胞的胶原蛋白生物墨水3D细胞打印
    1. 使用3D CAD软件生成步骤1.2中定义的癌-基质同心环的3D几何结构。
      注：癌-基质同心环的尺寸通过模拟参数确定。最终的尺寸参数如图3A所示。
    2. 将3D CAD文件转换为STL文件格式，并使用STL-CAD转换器生成癌-基质同心环的G代码。
      注：G代码生成算法请参见步骤4.1.2中的说明。
    3. 将装有细胞包埋胶原蛋白生物墨水的3 mL一次性注射器装载至3D打印机的打印头，并将打印头和载板的温度设置为15 °C。
      注：若打印头和载板温度超过37 °C，生物墨水会发生交联，无法继续打印。
    4. 将生成的打印路径载入3D打印机的控制软件中。
    5. 点击开始按钮，在15 °C条件下，以约20 kPa的气压，使用18 G塑料针头，按照加载的G代码将包埋癌细胞与基质细胞的胶原蛋白生物墨水打印至透气屏障上。
    6. 每次打印完成后，手动将一块灭菌的22 mm × 50 mm玻璃盖片置于透气屏障上方，以形成缺氧梯度。
      注：通过比较有玻璃盖片（GR+）与无玻璃盖片（GR-）两组，验证缺氧梯度的形成。
    7. 完成三个缺氧肿瘤芯片的打印后，将芯片转移至37 °C培养箱中孵育1小时，使胶原蛋白生物墨水交联。
  2. 缺氧肿瘤芯片制备过程的完成与维持
    1. 在完成所有缺氧肿瘤芯片的3D细胞打印过程后，使用细胞刮轻轻摩擦透气屏障上方的盖玻片，以实现紧密贴合（图4A、B）。
      注：盖玻片与透气屏障通过疏水性结合连接，无需化学胶水，仅需刮擦盖玻片与PDMS屏障之间的结合部位即可完成组装。
    2. 向每个芯片中加入1.5 mL内皮细胞生长培养基。为避免肿瘤结构脱落，应从芯片一侧缓慢加入培养基，并倾斜芯片，使用移液器引导培养基流动。
    3. 每周每天更换一次培养基。使用移液器吸取旧培养基，切勿使用压力泵。

7. 打印后细胞活力的评估

  1. 样品制备及钙黄绿素 AM 和 EthD-1 溶液处理
    1. 将 1× PBS 置于 37 °C 水浴中预热。
    2. 在 1.5 mL 预热的 PBS 中加入 0.75 µL 乙酰氧甲基钙黄绿素（calcein AM）和 3 µL 碘化乙啶同二聚体（EthD-1），配制检测溶液。
    3. 使用移液器小心吸除芯片中的全部培养基。
    4. 用预热的 PBS 清洗肿瘤结构。使用移液器向芯片中加入 1.5 mL PBS，在室温下静置 10 分钟。为避免肿瘤结构变形，应从芯片一侧缓慢加入 1× PBS，并倾斜芯片使 1× PBS 缓慢流过表面。
    5. 吸除芯片中的 PBS，加入 1.5 mL 检测溶液，用铝箔包裹避光，在 37 °C 孵育 20 分钟。使用移液器吸除 1× PBS；切勿使用抽吸泵。
  2. 使用荧光显微镜成像检测细胞活力
    1. 使用荧光显微镜观察并采集标记的细胞图像（图 4C）。
      注意：钙黄绿素 AM 可使活细胞呈现绿色荧光（波长约 488 nm）；EthD-1 可使死细胞呈现红色荧光（波长约 594 nm）。
    2. 使用成像软件或开源图像处理程序对活细胞和死细胞数量进行计数，并根据计数结果计算细胞活力。

8. 免疫荧光法验证中心缺氧的形成及其对癌症恶性程度的影响

  1. 癌组织构建物的固定、通透与封闭
    1. 在室温下配制 1× PBS、4% 多聚甲醛（PFA）、0.1%（v/v）Triton X-100 和 2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）。
    2. 使用移液器小心吸除芯片中的全部培养基，并用 1× PBS 清洗芯片三次。为避免癌组织构建物发生形变，应从芯片一侧加入 1× PBS，并倾斜芯片使液体流动。每次清洗步骤之间，让芯片在 1× PBS 中静置 5 分钟，以去除残留溶液。
      注意：1× PBS 使用移液器吸除，不可使用压力泵。
    3. 使用移液器向芯片上的癌组织构建物加入 500 µL 的 4% PFA，静置 15 分钟，随后用 1× PBS 洗涤三次，以固定癌组织构建物中的细胞。
    4. 使用移液器在室温下用 500 µL 的 0.1% Triton X-100 处理癌组织构建物 5 分钟，并用 1× PBS 洗涤三次，以溶解并通透细胞膜。
    5. 使用移液器在室温下用 500 µL 的 2% BSA 处理癌组织构建物 1 小时，以封闭反应性表位。
      注意：用石蜡膜覆盖芯片，防止蒸发。
    6. 1 小时后，用 1× PBS 将芯片洗涤三次。
  2. 一抗、二抗及 DAPI 处理，并使用共聚焦显微镜对结构成像。
    1. 将抗体用 1× PBS 稀释至各自所需的工作浓度，配制同型对照抗体和一抗混合液。
      注意：抗体的具体信息列于材料表中。同型对照抗体应使用与一抗相同的工作浓度。
    2. 使用移液器小心吸除芯片中的全部 1× PBS，并加入 200 µL 一抗溶液，在 4 °C 下孵育过夜。用石蜡膜覆盖芯片，防止蒸发。
    3. 吸除一抗溶液，并用 1× PBS 将芯片洗涤三次。
    4. 将二抗和 DAPI 用 1× PBS 稀释至所需的工作浓度。
      注意：本实验中使用绿色荧光标记的二抗，稀释比例为 1:200；DAPI 的使用比例为 1:1000。
    5. 使用移液器小心吸除芯片中的全部 1× PBS，并加入 200 µL 二抗-DAPI 混合溶液，在 4 °C 下孵育 3 小时。用石蜡膜覆盖芯片防止蒸发，再用铝箔包裹以防止光漂白。
    6. 吸除二抗-DAPI 溶液，并用 1× PBS 将芯片洗涤三次。
    7. 完成染色步骤后，用镊子轻轻夹取，将癌组织构建物转移至共聚焦培养皿中。
    8. 使用共聚焦显微镜观察并采集标记细胞的图像（图 5）。
      注意：共聚焦显微镜的波长根据所用荧光标记物的类型进行调整。抗体的具体信息列于材料表中。为高效定位细胞，建议首先观察构建物中经 DAPI 染色的细胞核。各荧光信号的激发/发射波长分别为：358/461 nm（DAPI，蓝色）、494/517 nm（绿色）和 590/617 nm（红色）。放大倍数依次设置为 4×、10× 和 20×，从最低到最高进行调整。

9. 统计分析

  1. 使用图像处理程序进行细胞计数
    1. 运行图像处理程序，以统计活细胞和死细胞的数量。
    2. 打开荧光图像文件。点击 文件 | 打开，导入 TIFF 图像。
    3. 将图像转换为 16 位灰度图像。点击 图像 | 类型 | 16 位灰度。
    4. 通过点击 图像 | 调整 | 阈值 来调整阈值，然后选择将细胞颜色设为黑色。
    5. 点击 处理 | 二值化 | 分水岭，将粘连的细胞分割开，以实现精确的细胞计数。
    6. 点击 分析，然后点击 分析颗粒 三次，以统计细胞数量；计算平均值，并以均值 ± 标准误差的形式呈现数据。
      注：通过比较荧光强度来分析免疫荧光标记。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用计算机辅助的3D细胞打印技术开发了缺氧肿瘤芯片，以模拟缺氧环境及相关癌症病理特征（图1）。通过3D几何模型模拟了氧气的传输与消耗过程。该芯片设计为同心环结构，以模拟肿瘤组织中氧气的径向扩散与耗竭（图2A）。在确定氧气扩散并被细胞消耗的空间控制体积后，通过计算有限元分析确定了产生中心缺氧所需的适当细胞密度（图2B、C）。

基于先前结果生成了缺氧肿瘤芯片的3D打印路径代码（图3）。牺牲性PEVA模具和肿瘤结构的CAD文件被转换为STL文件格式（图3A、B）。通过自主开发的软件程序将打印路径编...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究描述了一种基于3D细胞打印技术的缺氧肿瘤芯片的制备过程。通过计算机模拟预测了所设计芯片中缺氧梯度的形成。结合3D打印的透气屏障与玻璃盖片的简单策略，成功再现了可诱导异质性缺氧梯度的微环境。在芯片构建的缺氧梯度条件下，重现了胶质母细胞瘤相关的缺氧病理特征，包括假栅栏样结构及少量癌干细胞群体。

为了提高生产效率和可重复性，与先前发表的模型相比，对两个主要的制备步骤进行了依次改进15。首先，间接制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）屏障，以克服含有固化剂的PDMS因实时固化而导致的打印性能差的问题，而非采用一步式直接打印方法。因此，选用具有更高打印性能的生物相容性聚乙烯-醋酸乙烯酯（PEVA）来制备牺牲模具，并填充PDMS以形成透气屏障。其次，将载玻片类型更换为具有亲水涂层的载玻片，有利于生物墨水的沉积并保持形状保真度。最后，通过在芯片两端构建培养基储液池，实现了高效的培养基交换。

通过3D生物打印制备缺氧肿瘤芯片的每一步骤中的关键因素都应谨慎控制。在浇铸过程中，聚二甲基硅氧烷（PDMS...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由教育部门（编号：2020R1A6A1A03047902 和 NRF-2018H1A2A1062091）以及韩国政府（MSIT）（编号：NRF-2019R1C1C1009606 和 NRF-2019R1A3A3005437）支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞
人脐静脉内皮细胞PromocellC-12200
U-87 MG 细胞ATCCATCC HTB-14
一次性耗材
0.2 μm 注射器滤器Sartorius16534-K
10 mL 一次性注射器Jung Rim10ml 21G32
10 mL 玻璃小瓶HubenaA0039
10 mL 血清移液管吸头SPL lifescience91010
15 mL 锥形管SPL lifescience50015
18G 塑料针头Musashi engineeringPN-18G-B
20G 塑料锥形分配吸头Musashi engineeringTPND-20G-U
22x50 玻璃盖玻片MARIENFIELD0101142
25 mL 血清移液管吸头SPL lifescience90125
3 mL 一次性注射器HENKE-JET4020-X00V0
40 µm 细胞筛Falcon352360
5 mL 血清移液管吸头SPL lifescience91005
50 mL 锥形管SPL lifescience50050
50 mL 血清移液管吸头SPL lifescience90150
50N 精密喷嘴Musashi engineeringHN-0.5ND
铝箔SINKWANG
毛细管吸头GilsonCP1000
细胞刮刀SPL lifescience90030
共聚焦培养皿SPL lifescience200350
Parafilm 封口膜BemisPM996
预包被组织学载玻片MATSUNAMIMAS-11
试剂槽SPL lifescience23050
T-75 细胞培养瓶SPL lifescience70075
设备
3DX 打印机T&R Biofab
高压灭菌器JEIOTECHAC-12
离心机Cyrozen1580MGR
共聚焦激光显微镜Olympus Life ScienceFV 1000
荧光显微镜FISHER SCEINTIFICO221S366
镊子Korea Ace ScientificHC.203-30
手持计数器KTRIO
血细胞计数板MARIENFIELD0650030
培养箱PanasonicMCO-170AIC
超净工作台DAECHUNG SCIENCECB-BMMS C-001
金属注射器IWASHITA engineeringSUS BARREL 10CC
手术剪刀HiroseHC.13-122
烘箱JEIOTECHOF-12, H070023
正向置换移液器GILSONNJ05652
冰箱SAMSUNGCRFD-1141
Voltex 混匀仪DAIHAN scientificVM-10
水浴锅DAIHAN SCIENTIFICWB-11
纯水仪WASSER LABDI-GR
材料
0.25 % 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072
10x PBSIntronIBS-BP007a
4% 多聚甲醛Biosesang
70% 乙醇Daejung4018-4410
抗 CD31 抗体Abcamab28364
抗 HIF-1 alpha 抗体Abcamab16066
抗 SHMT2/SHMT 抗体Abcamab88664
抗 SOX2 抗体Abcamab75485
牛血清白蛋白Thermo scientificJ10857-22
猪皮来源胶原蛋白Dalim tissenPC-001-1g
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）ThermofisherD1306
内皮细胞生长培养基-2PromocellC22011
胎牛血清Gibco12483-020
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记TheromofisherA-11001
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 标记TheromofisherA-11012
高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）HycloneSH30243-0
盐酸Sigma-Aldrich311413-100ML
活/死细胞检测试剂盒InvitrogenL3224
小鼠 IgG1，κ 单克隆抗体 [15-6E10A7] - 同型对照Abcamab170190
青霉素/链霉素Gibco15140-122
酚红溶液Sigma-AldrichP0290-100ML
聚（乙烯-醋酸乙烯酯） Poly science06108-500
聚二甲基硅氧烷Dowhitechsylgard 184
兔 IgG，多克隆 - 同型对照Abcamab37415
氢氧化钠溶液SamchunS0610
Triton X-100BiosesangTRI020-500-50
台盼蓝Sigma-AldrichT8154
软件
COMSOL Multiphysics 3.5aCOMSOL AB
IMS beamer内部开发软件
SolidWorks 软件包Dassault Systems SolidWorks Corporation

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157(2019).
  2. Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R. Hypoxia-modified cancer cell metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 4(2019).
  3. Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I. The hypoxic tumour microenvironment. Oncogenesis. 7 (1), 1-13 (2018).
  4. Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
  5. Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16(2018).
  6. Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  7. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665(2013).
  8. Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
  9. Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  10. Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107(2020).
  11. Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382(2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  13. Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
  14. Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W. 3D printing of organs-on-chips. Bioengineering. 4 (1), 10(2017).
  15. Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
  16. Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
  17. Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
  18. Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
  19. Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014(2012).
  20. Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003(2020).
  21. Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

3D PDMS PEVA HIF1 SHMT2 SOX2

相关文章