功能化螺环杂环化合物的合成及细胞毒性检测

摘要

本文介绍了一种利用3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的生物测定法，用于测试先前合成的螺环肟类化合物。

摘要

最近文献报道，螺环杂环化合物可能成为癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环系的合成具有挑战性。近期发表了一种高效的合成方法，将原本报道的五步合成缩短为四步固相合成。这种更短合成路线的优势在于避免了有毒试剂的使用。研究发现，低负载量的再生型迈克尔（Regenerating Michael, REM）接头树脂在合成中至关重要，因为高负载量的树脂会阻碍含有大位阻苯基和芳香侧链试剂的引入。采用比色法3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测这些新型螺环分子在微摩尔浓度下的体外细胞毒性。MTT试剂 commercially readily available，且能提供相对快速、可靠的结果，因此该实验非常适合用于评估此类螺环杂环化合物。实验同时测试了正交环结构以及糠基胺（一种合成方法中的前体，含有类似的五元环结构单元）。

引言

已知小分子抑制E3泛素连接酶鼠双微体2同源物（MDM2）与p53之间的相互作用，可恢复p53介导的肿瘤细胞凋亡诱导作用^1,2,3。MDM2是p53信号通路的负调控因子，在癌细胞中常呈过表达状态^4,5,6,7,8,9。近期的晶体学与生物化学研究表明，含有螺环结构骨架的小分子可有效抑制MDM2与p53的相互作用¹⁰。该螺环骨架结构（图1，蓝色阴影部分）被视为一种优势结构基元，因其刚性正交环系的衍生化已促成多种新型治疗药物的发现。然而，采用传统有机合成方法构建此类独特结构仍具挑战性。尽管螺环分子在生物体系中的治疗效应已被广泛研究，其合成过程依然繁琐，常伴随副产物生成、反应条件剧烈以及使用有害过渡金属等问题。

方案

注意：本实验方案中使用的多种化学品和生物试剂具有毒性和致癌性。使用前请查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。实验开始前，应穿戴适当的个人防护装备（经职业安全与健康管理局认证的安全护目镜、合适的手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。此外，在进行合成操作及处理有毒化学品和试剂时，应采取适当的安全措施（如在通风橱中操作）。

1. 螺环杂环化合物 6 和 7 的固相合成

注意：合成方法基于先前发表的研究^11,12。更新后的方案表明，三环杂环的四丁基氟化铵催化的开环反应并非必需，因此省略该步骤可缩短合成路线。

1. 进行糠胺对REM连接剂的迈克尔加成反应（操作时间：25分钟准备 + 24小时反应时间）。
   1. 向25 mL固相反应容器中加入1 g（1当量[eq.]）REM树脂、20 mL（20当量）二甲基甲酰胺（DMF）和2.4 mL糠胺。反应启动后，在室温下振荡反应容器24小时。
      注意：确保充分混合，防止树脂沉降于容器底部。
   2. 反应完成后，用DMF洗涤树脂1次。随后交替使用二氯甲烷（DCM）和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥。
2. 进行串联迈克尔加成/1,3-偶极环加成反应（操作时间：25....

结果

螺环肟类化合物6和7采用改进的实验方案合成（图1）。呋喃甲胺对REM连接剂1b的迈克尔加成反应得到聚合物结合的树脂2。通过红外（IR）光谱监测反应进程，检测到α,β-不饱和酯在1722 cm⁻¹处的特征峰消失^-1 (图3）。螺环固定树脂4由2通过瞬时中间体3形成。4的甲醇解反应生成3-[（3E)-(2S, 4R)-2-苯基-3-羟基亚氨基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基]-丙酸甲酯 7，而烷基化反应随后进行β-消除则得到 (3E)-(2S, 4R)-4-羟甲基-1-甲基-2-苯基-3-吡咯烷酮肟 6。螺环肟类化合物的结构通过以下方法确定： ¹H 和 ¹³C核磁共振波谱分析以及基于我们先前结果的质谱纯度分析¹¹.

MTT 法是一种众所周知的比色法，用于测定细胞活力

讨论

螺环化合物的合成基于本实验室先前的研究，但进行了一些修改（图1)^11,12通过红外光谱监测每步反应的进程。REM连接子的迈克尔加成反应 1 与糠基胺反应得到聚合物结合的 2 （IR 1722 cm⁻¹）^-1 → 1731 cm^-1）。根据先前的报道，ISOC 的 2 生成了三环杂环化合物 3，通过检测到TMS基团（IR 1214 cm⁻¹）得以证实^-1）。这是合成过程中的关键步骤，因为异氰酸酯（ISOC）提供了产物所需的区域选择性和立体选择性。羟基的伸缩振动频率为3500 cm⁻¹^-1 观察到的是三.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
COS-7 细胞 (ATCC CRL-1651)	ATCC	CRL-1651	非洲绿猴肾细胞
化学试剂
1-溴辛烷	Sigma-Aldrich	152951	卤代烷
烯丙基溴	Sigma-Aldrich	337528	卤代烷
苄基溴	Sigma-Aldrich	B17905	卤代烷
顺铂	Cayman Chemical	13119	细胞毒性对照
二氯甲烷 (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	溶剂
二甲基甲酰胺 (DMF)	Sigma-Aldrich	227056	溶剂
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	276855	溶剂
DMEM，高糖，含 L-谷氨酰胺	Genesee Scientific	25-500	细胞培养基
FBS（胎牛血清）	Sigma-Aldrich	F4135	细胞培养基
糠胺	Acros Organics	119800050	试剂
碘甲烷	Sigma-Aldrich	289566	卤代烷
甲醇	Sigma-Aldrich	34860	溶剂
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）	EMD Millipore	Calbiochem 475989-1GM	试剂
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Genesee Scientific	25-507	细胞培养基
REM 树脂	Nova Biochem	8551010005	聚合物载体；负载量 0.500 mmol/g
反-β-硝基苯乙烯	Sigma-Aldrich	N26806	硝基烯烃试剂
甲苯	Sigma-Aldrich	244511	溶剂
三乙胺 (TEA)	Sigma-Aldrich	T0886	β-消除反应试剂
三甲基氯硅烷 (TMSCl)	Sigma-Aldrich	386529	试剂；注意——高度挥发性，会产生 HCl 气体
玻璃器皿/仪器
25 mL 固相反应瓶	Chemglass	CG-1861-02	带滤板的玻璃器皿
96 孔板读数仪	Promega (Turner Biosystems)	9310-011	仪器
AVANCE III 核磁共振波谱仪	Bruker	N/A	仪器；300 MHz；溶剂：CDCl3 和 CD3OH
Thermo Scientific Nicolet iS5	Thermo Scientific	IQLAADGAAGFAHDMAZA	仪器
腕式振荡器	Burrell Scientific	757950819	仪器