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方法文章

功能化螺环杂环化合物的合成及细胞毒性检测

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DOI：

10.3791/61950

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2021年2月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Chemistry, Azusa Pacific University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的生物测定法，用于测试先前合成的螺环肟类化合物。

摘要

最近文献报道，螺环杂环化合物可能成为癌症治疗的潜在药物。这些新型正交环系的合成具有挑战性。近期发表了一种高效的合成方法，将原本报道的五步合成缩短为四步固相合成。这种更短合成路线的优势在于避免了有毒试剂的使用。研究发现，低负载量的再生型迈克尔（Regenerating Michael, REM）接头树脂在合成中至关重要，因为高负载量的树脂会阻碍含有大位阻苯基和芳香侧链试剂的引入。采用比色法3-(4′,5′-二甲基噻唑-2′-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测这些新型螺环分子在微摩尔浓度下的体外细胞毒性。MTT试剂 commercially readily available，且能提供相对快速、可靠的结果，因此该实验非常适合用于评估此类螺环杂环化合物。实验同时测试了正交环结构以及糠基胺（一种合成方法中的前体，含有类似的五元环结构单元）。

引言

已知小分子抑制E3泛素连接酶鼠双微体2同源物（MDM2）与p53之间的相互作用，可恢复p53介导的肿瘤细胞凋亡诱导作用1,2,3。MDM2是p53信号通路的负调控因子，在癌细胞中常呈过表达状态4,5,6,7,8,9。近期的晶体学与生物化学研究表明，含有螺环结构骨架的小分子可有效抑制MDM2与p53的相互作用10。该螺环骨架结构（图1，蓝色阴影部分）被视为一种优势结构基元，因其刚性正交环系的衍生化已促成多种新型治疗药物的发现。然而，采用传统有机合成方法构建此类独特结构仍具挑战性。尽管螺环分子在生物体系中的治疗效应已被广泛研究，其合成过程依然繁琐，常伴随副产物生成、反应条件剧烈以及使用有害过渡金属等问题。

螺环结构单元在药物开发中的潜在应用推动了一种利用固相合成方法构建分子库的方案的发展，该分子库包含螺环结构单元以及其他可替换的功能基团11,12。通过使用连接在树脂珠上的REM连接剂和固相过滤反应器，可在各步骤之间简便地实现产物与反应物的分离。这种方法可减少操作步骤，并有可能提高产率。该合成策略能够生成大量潜在的药物候选分子。然而，这些分子在生物体系中的有效性仍需进一步研究。

为了确定这些螺环化合物的细胞毒性，采用了MTT法13,14。该方法通过检测细胞活力，间接评估细胞毒性。将不同浓度的抑制剂加入96孔板中培养的细胞，通过比色法分析线粒体脱氢酶将黄色MTT还原为紫色甲臜化合物的程度，从而测定活细胞比例（图2）。实验结果通常以IC50值表示，即与未处理对照组相比，细胞生长被抑制50%时的化合物浓度。本文描述了MTT法的实验步骤以及这些新型螺环分子的初步研究结果。

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方案

注意：本实验方案中使用的多种化学品和生物试剂具有毒性和致癌性。使用前请查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。实验开始前，应穿戴适当的个人防护装备（经职业安全与健康管理局认证的安全护目镜、合适的手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。此外，在进行合成操作及处理有毒化学品和试剂时，应采取适当的安全措施（如在通风橱中操作）。

1. 螺环杂环化合物 6 和 7 的固相合成

注意：合成方法基于先前发表的研究11,12。更新后的方案表明，三环杂环的四丁基氟化铵催化的开环反应并非必需，因此省略该步骤可缩短合成路线。

  1. 进行糠胺对REM连接剂的迈克尔加成反应（操作时间：25分钟准备 + 24小时反应时间）。
    1. 向25 mL固相反应容器中加入1 g（1当量[eq.]）REM树脂、20 mL（20当量）二甲基甲酰胺（DMF）和2.4 mL糠胺。反应启动后，在室温下振荡反应容器24小时。
      注意：确保充分混合，防止树脂沉降于容器底部。
    2. 反应完成后，用DMF洗涤树脂1次。随后交替使用二氯甲烷（DCM）和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥。
  2. 进行串联迈克尔加成/1,3-偶极环加成反应（操作时间：25分钟准备 + 48小时反应时间）。
    1. 向干燥的树脂中加入1.48 mL（5当量）三乙胺（TEA）、0.637 g（2当量）硝基烯烃以及10 mL干燥甲苯至反应容器中。
    2. 然后在通风良好的通风橱中向反应容器中加入1.085 mL（4当量）三甲基氯硅烷（TMSCl）。
      注意：该反应会产生HCl气体，因此在通风橱中释放气体前不得密封反应容器。
    3. 将反应容器密封，于室温下振荡反应48小时。
      注意：确保树脂与试剂充分混合。
    4. 使用5 mL甲醇淬灭反应。
    5. 排空容器以除去溶液，随后交替使用DCM和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥。
  3. 对树脂负载的杂环进行N-烷基化以形成季铵盐（操作时间：10分钟准备 + 24小时反应时间）。
    1. 向反应容器中的干燥树脂中加入5 mL DMF和10当量的卤代烷，于室温下振荡反应24小时。
      注意：确保试剂与树脂充分混合。
    2. 反应完成后，用DMF洗涤树脂1次。随后交替使用DCM和甲醇洗涤4次。洗涤后在反应容器中干燥树脂。
  4. 通过季铵盐的β-消除反应从聚合物载体上解离产物（操作时间：15分钟准备 + 24小时反应时间）。
    1. 向反应容器中的干燥树脂中加入3 mL DCM和1.49 mL（5当量）TEA，以将杂环从聚合物载体上裂解下来。
    2. 振荡反应混合物24小时，确保树脂与溶液充分混合。交替使用DCM和甲醇洗涤4次。收集所有洗涤液的洗脱液，并通过旋转蒸发浓缩。
    3. 用甲醇研磨以纯化螺环肟产物。洗涤后在反应容器中将树脂彻底干燥，以便在后续实验中重复使用。

2. 使用 MTT 进行细胞毒性检测14

  1. 使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，水中含0.9% NaCl）作为稀释剂，配制20 mL浓度为5 mg/mL的MTT溶液。过滤后于-20 °C保存。然后，将步骤2.1中的MTT溶液用无血清细胞培养基（DMEM）进行1:1稀释。
  2. 在1.5 mL离心管中，分别配制100 mM、10 mM、1 mM、100 µM、10 µM、1 µM、0.1 µM和0.01 µM浓度的待测化合物DMSO（二甲基亚砜）储备液，每种1 mL。于-20 °C保存。在1.5 mL离心管中，将上述储备液用无血清培养基按1:1000稀释，配制每种剂量的待测化合物工作液，每剂量200 µL。
  3. 在组织培养超净台中，使用多通道移液器将COS-7细胞（非洲绿猴肾细胞，Cercopithecus aethiops 肾细胞）以4 × 103 个细胞/200 µL的浓度接种于平底、经组织培养处理的96孔板中，培养基为完全培养基[含10%胎牛血清（FBS）的DMEM]。选择COS-7细胞的原因是：（1）该细胞系常用于细胞毒性检测；（2）本机构已有该细胞资源。
  4. 将COS-7细胞置于含5% CO2的环境中，于37 °C孵育24小时。
  5. 使用连接真空泵的玻璃巴斯德吸管吸除各孔中的上清液。使用步骤2.2中配制的工作液对细胞进行加药处理，每组剂量设三个复孔（见表1）。按照步骤2.4所述条件孵育细胞。
  6. 吸除各孔中的上清液。每孔加入200 µL MTT溶液。在含5% CO2的环境中，于37 °C孵育4小时。
  7. 小心吸除上清液，避免扰动紫色的甲臜结晶。每孔加入200 µL DMSO以溶解紫色甲臜结晶。室温下孵育15分钟。
  8. 使用96孔板读数仪测定各孔在590 nm14或600 nm处的吸光度。以不含细胞的孔作为空白对照，计算平均背景吸光度值。从每个处理孔的吸光度值中减去平均背景值。将数据归一化为零剂量组平均值的百分比（取三个零剂量孔的平均值）。作图时，y轴为线性坐标（相对细胞活力百分比），x轴为对数坐标（浓度）。每组数据绘制为独立曲线（例如，三复孔数据应绘制三条曲线）。

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结果

螺环肟类化合物6和7采用改进的方案合成（图1）。将糠胺进行迈克尔加成反应连接到REM接头1b上，得到聚合物结合的树脂2。通过红外（IR）光谱监测反应进程，检测1722 cm⁻¹处α,β-不饱和酯峰的消失情况-1 (图3）。螺环固定树脂4由2通过瞬时中间体3形成。4的甲醇解反应生成3-[（3E)-(2S, 4R)-2-苯基-3-羟基亚氨基-4-羟甲基-吡咯烷-1-基]-丙酸甲酯 7，而烷基化反应随后进行β-消除则得到 (3E)-(2S, 4R)-4-羟甲基-1-甲基-2-苯基-3-吡咯烷酮肟 6。螺环肟类化合物的结构通过以下方法确定： 1H 和 13C核磁共振波谱分析以及基于我们先前结果的质谱纯度分析11.

MTT 法是一种众所周知的比色法，用于测定细胞活力

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讨论

螺环化合物的合成基于本实验室先前的研究，但进行了一些修改（图1)11,12通过红外光谱监测每步反应的进程。REM连接子的迈克尔加成反应 1 与糠基胺反应得到聚合物结合的 2 （IR 1722 cm⁻¹）-1 → 1731 cm-1）。根据先前的报道，ISOC 的 2 生成了三环杂环化合物 3，通过检测到TMS基团（IR 1214 cm⁻¹）得以证实-1）。这是合成过程中的关键步骤，因为异氰酸酯（ISOC）提供了产物所需的区域选择性和立体选择性。羟基的伸缩振动频率为3500 cm⁻¹-1 观察到的是三...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国阿苏萨太平洋大学研究与资助办公室授予 K.S.H. 的教员研究理事会资助项目提供经费支持。A.N.G. 和 J.F.M. 获得了本科生学术研究体验（SURE）奖学金。S.K.M. 和 B.M.R. 获得了美国阿苏萨太平洋大学科学研究中心 STEM 研究奖学金资助。我们感谢 Matthew Berezuk 博士和 Philip Cox 博士在生物测定实验方面提供的指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞
COS-7 细胞 (ATCC CRL-1651)ATCCCRL-1651非洲绿猴肾细胞
化学试剂
1-溴辛烷Sigma-Aldrich152951卤代烷
烯丙基溴Sigma-Aldrich337528卤代烷
苄基溴Sigma-AldrichB17905卤代烷
顺铂Cayman Chemical13119细胞毒性对照
二氯甲烷 (DCM)Sigma-Aldrich270997溶剂
二甲基甲酰胺 (DMF)Sigma-Aldrich227056溶剂
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-Aldrich276855溶剂
DMEM，高糖，含 L-谷氨酰胺Genesee Scientific25-500细胞培养基
FBS（胎牛血清）Sigma-AldrichF4135细胞培养基
糠胺Acros Organics119800050试剂 
碘甲烷Sigma-Aldrich289566卤代烷
甲醇Sigma-Aldrich34860溶剂
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）EMD MilliporeCalbiochem 475989-1GM试剂
磷酸盐缓冲液 (PBS)Genesee Scientific25-507细胞培养基
REM 树脂Nova Biochem8551010005聚合物载体；负载量 0.500 mmol/g
反-β-硝基苯乙烯Sigma-AldrichN26806硝基烯烃试剂
甲苯Sigma-Aldrich244511溶剂
三乙胺 (TEA)Sigma-AldrichT0886β-消除反应试剂
三甲基氯硅烷 (TMSCl)Sigma-Aldrich386529试剂；注意——高度挥发性，会产生 HCl 气体
玻璃器皿/仪器
25 mL 固相反应瓶ChemglassCG-1861-02带滤板的玻璃器皿
96 孔板读数仪Promega (Turner Biosystems)9310-011仪器
AVANCE III 核磁共振波谱仪BrukerN/A仪器；300 MHz；溶剂：CDCl3 和 CD3OH
Thermo Scientific Nicolet iS5Thermo ScientificIQLAADGAAGFAHDMAZA仪器
腕式振荡器Burrell Scientific757950819仪器

参考文献

  1. Shangary, S., Wang, S. Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).
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