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方法文章

诱导与分析Sleeping Beauty转座子转染的人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激

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DOI：

10.3791/61957

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2020年12月11日

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1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

本文内容

摘要

我们介绍一种通过过氧化氢（H2O2）处理视网膜色素上皮细胞以建立和使用氧化应激模型的实验方案，用于分析细胞形态、活力、密度、谷胱甘肽水平及UCP-2表达水平。该模型可用于研究转座子转染细胞所分泌蛋白对神经视网膜变性的抗氧化作用。

摘要

氧化应激在多种退行性疾病中发挥关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种全球约影响3000万患者的病理状态。氧化应激可导致视网膜色素上皮（RPE）细胞合成的神经营养保护因子减少，例如色素上皮衍生因子（PEDF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），继而引发RPE细胞丢失，最终导致光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡。我们假设，通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的转染RPE细胞，重建具有神经营养保护和神经发生潜能的视网膜微环境，有望通过减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应以及促进细胞存活来防止视网膜退行性病变。利用 睡美人 转座子系统（SB100X人RPE细胞已转染了 PEDF 和 GM-CSF 基因，并利用qPCR、Western印迹、ELISA和免疫荧光证实了稳定的基因整合、长期的基因表达及蛋白质分泌。为确认其功能性和效力 PEDF 和 GM-CSF 由转染的RPE细胞分泌，我们已开发出一种体外检测方法，用于定量分析H的减少程度2O2诱导的氧化应激对培养的RPE细胞的影响。通过分析细胞形态、密度以及细胞内谷胱甘肽水平来评估细胞保护作用， UCP2 基因表达和细胞活力。与未经处理的对照组相比，转染后过表达PEDF和/或GM-CSF的RPE细胞，以及未经转染但经PEDF和/或GM-CSF预处理（使用市售产品或从转染细胞中纯化获得）的细胞，均表现出显著的抗氧化细胞保护作用。本研究中的H2O2-模型是一种简单而有效的方法，用于评估可能对治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）或类似神经退行性疾病有效的因素的抗氧化作用。

引言

此处描述的模型为评估生物制药制剂在降低细胞氧化应激方面的有效性提供了一种有用的方法。我们已利用该模型研究了PEDF和GM-CSF对H2O2介导的氧化应激对视网膜色素上皮细胞的影响，这些细胞暴露于高水平的O2以及可见光，并吞噬感光细胞外节膜，从而产生大量活性氧（ROS）1,2它们被认为是非血管性年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的主要致病因素3,4,5,6,7,8此外，视网膜色素上皮（RPE）合成的神经保护因子减少，特别是色素上皮衍生因子（PEDF）、类胰岛素生长因子（IGFs）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），导致RPE细胞功能障碍及其丢失，进而引起光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡3,4,5. 年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种复杂的疾病，由代谢、功能、遗传和环境因素之间的相互作用引起4. 在工业化国家，年龄超过60岁的患者因缺乏对aAMD的治疗方法，是导致失明的主要原因9,10通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的基因修饰RPE细胞，重建具有神经保护和神经再生作用的视网膜微环境，有望通过减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应并支持细胞存活，从而防止视网膜退行性变11,12,13,14,15,16尽管存在多种将基因递送至细胞的方法，我们仍选择了非病毒性高活性 睡美人 转座子系统以递送 PEDF 和 GM-CSF 由于其安全性、能够将基因整合到宿主细胞基因组中，以及倾向于将递送的基因整合至非转录活性位点（如我们先前所示）的特性，将基因递送至RPE细胞17,18,19.

细胞氧化应激可通过多种氧化剂在体外培养细胞中诱导产生，包括过氧化氢（H₂O₂）2O2）、4-羟基壬烯醛（HNE）、叔丁基过氧化氢（tBH）、高氧张力以及可见光（全光谱或紫外照射）20,21高氧张力和光照需要特殊的设备和条件，这限制了向其他系统的可转移性。H等试剂2O2，HNE 和 tBH 会诱导产生重叠的氧化应激分子与细胞变化。我们选择了 H2O2 为了检测PEDF和GM-CSF的抗氧化活性，因为该物质由视网膜色素上皮（RPE）细胞在光感受器外节吞噬过程中作为活性氧中间体产生，具有操作简便性和生物学相关性22 并且在体内存在于眼部组织中23. 由于谷胱甘肽的氧化可能部分介导了H2O2 在眼部研究中，我们分析了谷胱甘肽（GSH）的水平，其与H相关2O2诱导的氧化应激与细胞的再生能力21,22谷胱甘肽水平的分析尤为重要，因其参与了眼部的抗氧化保护机制24. 暴露于 H2O2 常被用作研究视网膜色素上皮（RPE）细胞氧化应激敏感性及抗氧化活性的模型1,25,26,27,28,29,30，并且还表现出与光诱导的氧化应激损伤的相似性，一种 "生理的" 氧化应激的来源21.

为了评估神经保护因子的功能性和有效性，我们建立了一种体外模型，可用于分析经基因改造过表达PEDF和GM-CSF的细胞所表达的生长因子的抗氧化作用。在此，我们证明，转染了PEDF和GM-CSF基因的视网膜色素上皮（RPE）细胞相较于未转染的对照细胞，对H2O2的有害作用具有更强的抵抗力，这一结论通过细胞形态、密度、存活率、细胞内谷胱甘肽水平以及UCP2基因的表达得以证实。UCP2基因编码线粒体解偶联蛋白2，该蛋白已被证实可降低活性氧（ROS）水平31。

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方案

人眼的采集和使用程序已获得州研究伦理委员会批准（编号：2016-01726）。

1. 细胞分离与培养条件

  1. 人源ARPE-19细胞系
    1. 在T75培养瓶中培养5 × 105个ARPE-19细胞（一种人源视网膜色素上皮细胞系），使用添加了10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素、80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物（DMEM/Ham's F-12）（完全培养基），于37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养（其他细胞密度参见表1）。
    2. 每周更换三次培养基。
    3. 当细胞生长至约90%融合度（定性评估）时，吸除培养基，并用无菌1×PBS洗涤细胞。
    4. 加入5%胰蛋白酶-2% EDTA溶液，在37 °C孵育7–10分钟（体积参见表1），并在显微镜下观察细胞脱落情况。
    5. 通过加入含10% FBS的完全培养基终止胰酶消化反应（体积参见表1）。
    6. 对细胞进行转染（见实验方案第2步），以1:10的比例传代培养（每周一次），或按如下说明接种至96孔板（见实验方案第3.3和3.4步）。
培养基（mL）
面积（cm²）ARPE-19细胞接种密度（细胞/孔）应用用于细胞培养终止胰酶消化胰酶体积（mL）
T75培养瓶75500,000ARPE-19细胞扩增1073
6孔板9.6100,000转染ARPE-19细胞的接种310.5
24孔板250,000转染hRPE细胞的接种10.80.2
96孔板0.32转染细胞氧化应激实验用5,000（图1）氧化应激实验0.2
非转染细胞加蛋白的氧化应激实验用3,000（图1）

表1：细胞培养体积。 ARPE-19细胞和原代人视网膜色素上皮细胞在培养板和培养瓶中推荐使用的培养基体积。

  1. 原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞
    1. 按照 Thumann 等人17所述方法分离原代人 RPE 细胞，并在补充有 20% 胎牛血清（FBS）的完全培养基中进行培养。
    2. 每周更换两次培养基。当细胞达到汇合状态（通过肉眼观察监测）时，将 FBS 浓度降低至 1%，以避免过度生长。
    3. 转染细胞（参见方案中的步骤 2），或按以下说明接种至 96 孔板（参见方案中的步骤 3.3 和 3.4）。
      注意：本文所展示的数据来自四位人类供体眼球获取的 RPE 细胞培养结果。表 2详细列出了来自明尼苏达州圣保罗市 Lions Gift of Sight 眼库供体的人口统计学信息。在获得符合《赫尔辛基宣言》要求的知情同意后，眼球在死亡后 12.7 ± 5.7 小时（均值 ± 标准差）内被摘除。
编号年龄性别死亡至保存时间（小时）死亡至分离转染前培养转染后培养图中符号
（天）（天）（天）
280M20.7814036静力平衡概念；ΣFx=0；示意图；平衡分析与受力平衡研究
386F12.888545黑色向下的等边三角形符号；静力平衡；几何示意图。
486F8.5526133Nabla 符号，∇，表示微积分中的向量微分算子，与梯度、旋度、散度相关。
883F8.961827Delta 符号（Δ），表示数学方程中的变化量；用于微积分、物理分析。
平均值83.812.76.867.360.3
标准差2.95.71.557.049.1

​表2：视网膜色素上皮细胞供体的人口统计学特征。

2. ARPE-19 和原代人视网膜色素上皮细胞的电穿孔

  1. 按照方案中步骤 1.1.3-1.1.5 所述，对 ARPE-19 细胞或原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞进行胰蛋白酶消化处理。
  2. 使用市售转染试剂盒进行电穿孔（参见材料表）。
    1. ARPE-19 细胞的转染请参考 Johnen 等人32，原代 hRPE 细胞的转染请参考 Thumann 等人17。简言之，将 1 × 105 个 ARPE-19 细胞或 5 × 104 个原代 hRPE 细胞重悬于 11 µL R 缓冲液中，并加入 2 µL 质粒混合物，其中包含 0.03 µg pSB100X 转座酶33 和 0.47 µg pT2-CMV-PEDF-His 或 pT2-CMV-GMCSF-His 转座子（转座酶与转座子的比例为 1:16）。对于同时转染 PEDF 和 GM-CSF 的细胞，使用比例为 1:16:16（0.03 µg pSB100X、0.47 µg pT2-CMV-PEDF-His 和 0.47 µg pT2-CMV-GMCSF-His）。电穿孔参数如下：ARPE-19 细胞采用 1,350 V 电压，脉冲宽度 20 ms，共 2 次脉冲；原代细胞采用 1,100 V 电压，脉冲宽度 20 ms，共 2 次脉冲。
  3. 将 1 × 105 个转染后的 ARPE-19 细胞或 5 × 104 个转染后的原代 hRPE 细胞分别接种至 6 孔板和 24 孔板中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS），不加抗生素或抗真菌剂。转染后第 3 天首次换液时，加入青霉素（80 U/mL）、链霉素（80 µg/mL）和两性霉素 B（2.5 µg/mL）。
  4. 通过每周显微镜观察细胞生长情况来评估细胞增殖。转染效率通过 RT-PCR 检测基因表达水平，以及通过 ELISA 和 WB 检测蛋白分泌水平进行评估（方法详见补充材料）。
    注意：当细胞达到汇合状态时可首次评估转染效率，ARPE-19 细胞约为转染后 7 天，原代 hRPE 细胞约为转染后 4 周。
  5. 按照以下说明将细胞接种至 96 孔板（参见方案中步骤 3.5）。

3. 氧化应激诱导（H2O2处理）与神经保护（PEDF 和/或 GM-CSF 处理）

  1. 转染ARPE-19细胞条件培养基的制备
    1. 使用转染了PEDF、GM-CSF或两者基因的ARPE-19细胞（见实验方案第2步）；按照实验方案第1.1步所述，将细胞培养28天。
    2. 转染后第28天，用胰蛋白酶消化细胞（见实验方案第1.1.3–1.1.5步），使用Neubauer计数板34,35计数细胞，并按照实验方案第1.1.1步所述，在T75培养瓶中以完全培养基接种5 × 105个细胞。当细胞融合度达到约80%时更换培养基（约1周后；通过定性验证）。24小时后收集培养基。
    3. 将收集的培养基储存于-20 °C，待用。
      注：条件培养基中重组PEDF和GM-CSF的浓度已通过WB检测，并通过ELISA定量，具体方法见补充材料。
  2. 从转染ARPE-19细胞的条件培养基中纯化PEDF和GM-CSF
    1. 将第3.1.2步收集的培养基在4 °C下以10,000 × g离心15分钟。
    2. 按照生产商说明书，使用Ni-NTA superflow（见材料表）纯化His标签蛋白，具体步骤如下：
      1. 将30 µL Ni-NTA混合物移入1.5 mL离心管中，以2,600 × g离心30秒，弃去流穿液。用200 µL 1×孵育缓冲液洗涤沉淀两次。
      2. 以2,600 × g离心30秒，弃去流穿液。加入40 µL 4×孵育缓冲液并重悬沉淀。
      3. 加入900 µL经离心处理的条件培养基，在室温下以70 rpm（旋转摇床）孵育1小时。以2,600 × g离心1分钟，弃去流穿液。
      4. 用175 µL 1×孵育缓冲液洗涤沉淀两次。每次以2,600 × g离心30秒，弃去流穿液。
      5. 为洗脱His标签的PEDF和GM-CSF蛋白，加入20 µL洗脱缓冲液，在室温下以70 rpm（旋转摇床）孵育20分钟。以2,600 × g离心30秒。保留含有重组PEDF或GM-CSF的上清液。
    3. 使用市售BCA蛋白定量检测试剂盒（见材料表），按照生产商说明书测定总蛋白浓度。
    4. 将蛋白溶液储存于-20 °C，待用。
      注：4×孵育缓冲液含200 mM NaH2PO4、1.2 M NaCl和40 mM咪唑；洗脱缓冲液含50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl和250 mM咪唑。
  3. 用含H2O2的条件培养基处理未转染的ARPE-19/原代hRPE细胞（图1A）
    1. 在96孔板中每孔接种3,000个未转染的ARPE-19细胞（来自实验方案第1.1.6步）或原代hRPE细胞（来自实验方案第1.2.3步），每孔加入200 µL来自转染ARPE-19细胞的条件培养基进行培养。
    2. 在37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养10天，每天更换条件培养基。用350 µM H2O2处理细胞24小时。
    3. 通过谷胱甘肽水平定量（见实验方案第4.1步）、显微镜观察（见实验方案第4.2步）和细胞毒性检测（见实验方案第4.2步）评估氧化应激损伤，并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
      注：实验总时长为12天。使用透明平底微孔板以同时评估发光信号和细胞形态。为同时进行细胞毒性和谷胱甘肽检测，需在同一天接种两块培养板。
  4. 用含H2O2的PEDF和GM-CSF生长因子处理未转染的ARPE-19/原代hRPE细胞（图1B）
    1. 在透明平底96孔板中每孔接种3,000个未转染的ARPE-19细胞（来自实验方案第1.1.6步）或原代hRPE细胞（来自实验方案第1.2.3步），每孔加入200 µL完全培养基，其中含有500 ng/mL重组PEDF和/或50 ng/mL重组GM-CSF（来源于转染ARPE-19细胞培养基的纯化产物或市售产品）。在37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养48小时。每天更换含PEDF和GM-CSF生长因子的新鲜培养基。
      ​注：生长因子需每日新鲜加入培养基中。
    2. 细胞经生长因子处理48小时后，吸除培养基，加入含350 µM H2O2以及500 ng/mL PEDF和/或50 ng/mL GM-CSF的完全培养基。
    3. 通过谷胱甘肽水平定量（见实验方案第4.1步）、显微镜观察（见实验方案第4.2步）和细胞毒性检测（见实验方案第4.2步）评估氧化应激损伤，并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
      注：实验总时长为3天。
  5. 用H2O2处理转染的ARPE-19/原代hRPE细胞（图1C）
    1. 通过WB和ELISA验证转染细胞的基因表达和蛋白分泌情况，方法见补充材料。
    2. 吸除含有转染细胞的孔中的培养基（见实验方案第2步）。
    3. 按照实验方案第1.1.3–1.1.5步所述进行胰蛋白酶消化细胞。使用Neubauer计数板34,35计数细胞。
    4. 在96孔板中每孔接种5,000个转染细胞，每孔加入200 µL完全培养基。在37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养24小时。24小时后，用350 µM H2O2处理细胞24小时。
    5. 通过谷胱甘肽水平定量（见实验方案第4.1步）、显微镜观察（见实验方案第4.2步）、细胞毒性检测（见实验方案第4.2步）以及UCP2基因表达测定（见实验方案第4.3步）评估氧化应激损伤，并确定PEDF和GM-CSF的抗氧化作用。
      注：实验总时长为2天。

过氧化氢细胞培养时间线；GSH-Glo 谷胱甘肽检测；实验流程图
图 1：三种不同实验方法中 H2O2 检测的时间线。将3,000个未转染的细胞（经条件培养基或重组蛋白处理）或5,000个转染细胞接种于96孔板中，随后进行H2O2处理。为评估条件培养基的作用，细胞在100%条件培养基中连续培养10天，每天更换培养基。为评估重组生长因子的作用，每天添加适量生长因子，连续培养3天。请注意，未转染细胞的接种密度为每孔3,000个细胞，以避免在较长培养周期中出现过度生长，而转染细胞的培养时间相对较短。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 氧化应激水平与抗氧化能力的分析

  1. 谷胱甘肽检测
    1. 使用市售试剂盒（参见材料表）按照制造商说明书测定谷胱甘肽（GSH）水平。简言之，配制适量体积的1x试剂混合液（每孔100 µL试剂）：将Luciferin-NT底物和谷胱甘肽S-转移酶用反应缓冲液按1:100稀释。
      ​注意：96孔板需要10 mL的1x试剂混合液，可通过将100 µL Luciferin-NT底物和100 µL谷胱甘肽S-转移酶加入10 mL反应缓冲液中配制而成。应在使用前立即配制1x试剂混合液，配制后不可储存以备后续使用。
    2. 通过将一瓶复溶缓冲液加入冻干的Luciferin检测试剂中，配制Luciferin检测试剂。
    3. 使用谷胱甘肽（GSH）标准溶液（5 mM）配制标准曲线。将5 mM GSH溶液用dH2O按1:100稀释（将10 µL 5 mM GSH溶液加入990 µL dH2O中）。在500 µL dH2O中进行7次连续1:1稀释。将每种稀释后的标准品各取10 µL，重复加入相应孔中。
      ​注意：谷胱甘肽的最终浓度范围为0.039 µM至5 µM。
    4. 准备空白对照（1x试剂混合液），并将10 µL（重复两份）转移至相应孔中。
    5. 从培养箱中取出经H2O2处理的细胞。
      ​注意：通过明场显微镜（40x）记录H2O2处理细胞的形态学变化。
      当细胞发生氧化时，其形态更趋圆形且贴壁伸展减少。
    6. 小心吸除培养基，向每孔加入100 µL新配制的1x试剂混合液。在轨道摇床上以500 rpm速度混匀15秒。
    7. 室温孵育30分钟，然后向每孔加入100 µL复溶后的Luciferin检测试剂。
    8. 在轨道摇床上以500 rpm速度混匀15秒，室温继续孵育15分钟。
    9. 使用酶标仪，采用预设程序ADP-Glo测定发光值。
      ​注意：将酶标板放入酶标仪时无需加盖。
      1. 点击更改布局，在基本参数中选择以下设置：Costar 96孔板；顶部光学检测；定位延迟：0.1；测量起始时间：0.0；测量间隔时间：1.0；结果归一化时间：0.0；增益由仪器自动调节。定义空白孔、标准品孔和样品孔，点击开始测量。
      2. 将数据导出为Excel文件，通过标准曲线插值计算各样品中GSH的浓度。
  2. 细胞毒性检测与显微分析
    1. 吸除细胞培养基，向每孔加入含1% FBS的完全培养基100 µL，将细胞放回培养箱继续培养。
      注意：使用1% FBS是因为较高浓度的FBS可能干扰发光值测定，因此本实验采用1% FBS。
    2. 使用市售细胞毒性检测试剂盒（参见材料表）按照制造商说明书测定细胞活力。简言之，将检测缓冲液加入冻干底物中配制试剂混合液。通过将33 µL皂苷（Digitonin）加入5 mL检测缓冲液中（适用于一块96孔板）配制裂解试剂。用移液器反复吹打混匀，确保溶液均一。
      ​注意：为获得最佳结果，建议使用新鲜配制的试剂混合液。若在室温保存，应在12小时内使用；也可在4 °C保存最多7天，或分装后于-70 °C保存单次使用 aliquots 最长达4个月。应避免反复冻融。裂解试剂可在4 °C保存最多7天。
    3. 使用未经处理的ARPE-19细胞配制标准曲线。
      1. 按照方案中步骤1.1.3–1.1.5所述方法进行细胞消化，并使用Neubauer计数板34,35计数细胞。室温下以120 g离心10分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含1% FBS的DMEM/Ham's F12培养基中，调整终浓度为1 × 105 个细胞/mL。
      2. 在200 µL含1% FBS的培养基中进行7次连续1:1稀释。将每种标准品各取100 µL加入相应孔中（重复两份）。向所有孔中加入50 µL试剂混合液。
    4. 在轨道摇床上以500 rpm混匀15秒，室温孵育15分钟。按照方案中步骤4.1.9所述方法使用酶标仪测定发光值。随后向每孔加入50 µL裂解试剂，孵育15分钟，再次按照步骤4.1.9所述方法测定发光值。
    5. 计算活细胞百分比：（100 - 死亡细胞%），死亡细胞百分比 = [第一次发光测定值（样品中死亡细胞）/ 第二次发光测定值（皂苷处理后全部细胞死亡）] × 100。
  3. 通过RT-qPCR分析UCP2表达水平
    1. 按照上述方法（方案中步骤1.1.3–1.1.5）对转染细胞进行胰酶消化。
    2. 使用Neubauer计数板34,35计数细胞。
    3. 将5,000个转染后的ARPE-19细胞/孔接种至96孔板中。
    4. 培养24小时后，用350 µM H2O2处理细胞24小时。
    5. 使用商业化低细胞量RNA提取试剂盒（参见材料表）按照制造商说明书提取总RNA。
    6. 按照补充材料所述方法进行实时定量PCR（RT-qPCR）。简言之，使用含有优化M-MLV逆转录酶的商业化试剂混合液进行逆转录生成cDNA（参见材料表）。
    7. qPCR反应使用即用型预混液（包含所有组分，包括SYBR Green，但不含引物（参见补充材料中的表S1）和DNA模板）。采用以下热循环条件：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸32秒）。
    8. 采用2^(-ΔΔCT)法进行数据分析36。
  4. SDS-PAGE及pAkt（Ser473）蛋白印迹（WB）分析用细胞裂解液制备
    1. 将3 × 105个GM-CSF转染的ARPE-19细胞/孔接种于6孔板中（转染后≥21天），用于检测GM-CSF是否通过激活Akt存活通路保护视网膜色素上皮（RPE）细胞免受H2O2损伤15。
    2. 培养24小时后，用350 µM H2O2处理细胞24小时。
    3. 将1 mL RIPA缓冲液与10 µL蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合液、10 µL 0.5 M EDTA和25 µL 8 M尿素混合（适用于一个孔的用量）。
    4. 小心吸除培养基，用1x PBS洗涤细胞。
    5. 将全部体积的RIPA缓冲液混合液加入细胞中。
    6. 用移液器反复吹打混匀。
    7. 将裂解液收集至1.5 mL离心管中。
    8. 在4 °C下以20,000 × g离心30分钟。
    9. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。
    10. 按照补充材料所述方法，使用15 µL未稀释的细胞裂解液通过WB检测pAkt水平。

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结果

人视网膜色素上皮细胞中氧化应激的诱导
ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞用不同浓度的 H2O2 处理 24 小时，并定量检测细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的水平（图 2A、B）。50 µM 和 100 µM 的 H2O2 对谷胱甘肽的生成无明显影响，而在 350 µM 浓度下，ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞中的谷胱甘肽水平均显著降低。细胞毒性分析显示，350 µM 是 H2O2 引起细胞活力显著下降的最低浓度（图 2C）。形态学上，经 H2O2 处理的 ARPE-19 细胞铺展减少、更趋圆形，且随着 H2O2 浓度升高，这些特征更加明显（

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讨论

本文所述方案提供了一种分析转染细胞所产生的PEDF和GM-CSF抗氧化及保护功能的方法，该方法可适用于转染了任何假定有益基因的细胞。在以移植基因修饰细胞将蛋白质递送至组织为目的的基因治疗策略中，获取有关蛋白表达水平、表达持续时间以及所表达蛋白在疾病模型中功效的信息至关重要。在本实验室中，该方案已成功用于明确PEDF和GM-CSF在氧化应激中的作用效果，而氧化应激已被假定为年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的重要环节。6,7具体而言，我们已采用该方案来界定抗氧化作用 SB100X介导的PEDF/GM-CSF转染原代hRPE细胞。多位研究者已证实，H2O2 诱导显著的氧化应激症状，但仍允许细胞再生28,29,38，这与我们的实验结果相似，已证明350 µM浓度作用24小时可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Gregg Sealy 和 Alain Conti 提供出色的技术支持，并感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Zsuzsanna Izsvák 教授慷慨提供 pSB100X  和 pT2-CAGGS-Venus  质粒。本研究由瑞士国家科学基金会和欧洲委员会在第七框架计划背景下资助。Z.I. 由欧洲研究理事会高级资助项目 [ERC-2011-ADG 294742] 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板康宁353047
6孔板格雷纳7657160
96孔培养板，白色，透明平底 Costar3610可在进行发光检测（GSH-Glo Assay）前检查细胞状态
96孔板康宁 353072
丙烯酰胺 40%伯乐（Bio-Rad）161-0144
两性霉素BAMIMED4-05F00-H
抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体赛默飞世尔科技PA5-24184
抗体 抗小鼠 IgG/IgA/IgM 安捷伦P0260
抗体抗PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
抗五聚组氨酸抗体 Qiagen34660
抗磷酸化-Akt 抗体细胞信号技术公司9271
抗体 anti-rabbit IgG H&L-HRPAbcamab6721
驴抗兔Alexa Fluor 594抗体 赛默飞世尔科技 A11034
抗体 山羊抗小鼠 Alexa 488赛默飞世尔科技A-11029
ARPE-19细胞系ATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
腔室培养玻片康宁354118
CytoTox-Glo 细胞毒性检测 PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham's F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set ELISA试剂盒R&D Systems DY215-05
EDTA赛默飞世尔科技78440
ELISAquant 试剂盒BioProducts MDPED613-10-人类
眼睛（人类）Lions Gift of Sight 眼库（美国明尼苏达州圣保罗市）
FBS 布伦施维格P40-37500
Fluoromount 水性封片介质Sigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega 酶标仪 BMG Labtech
GraphPad Prism 软件（版本 8.0）GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo 谷胱甘肽检测试剂盒PromegaV6912
过氧化氢（H₂O₂）2O2)默克107209
ImageJ 软件（图像处理程序）W.S. Rasband，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（NIH）；https://imagej.nih.gov/ij/；1997–2014
咪唑 AxonlabA1378.0010
Leica DMI4000B 显微镜 Leica Microsystems
LightCycler 480 仪器 II 罗氏分子系统公司
LightCycler 480 SW1.5.1 软件罗氏分子系统
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
Neon 转染系统 赛默飞世尔科技MPK5000
Neon 转染系统 10 µL 型试剂盒赛默飞世尔科技MPK1096
血细胞计数板马里恩费尔德-上部640010
Ni-NTA superflow Qiagen30410
硝酸纤维素 VWR732-3197
Omega Lum G 凝胶成像系统Aplegen 生命科学
PBS 1×Sigma-AldrichD8537
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 赛默飞世尔科技23227
引物 Invitrogen 参见补充材料中的表1
pSB100X (250 ng/µLMátés 等，2009。由 Zsuzsanna Izsvak 教授提供
pT2-CMV-GMCSF-His 质粒 DNA（250 ng/µL使用 Johnen, S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建而成。
pT2-CMV-PEDF-His 质粒 DNA（250 ng/µL使用 Johnen S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建。
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51304
重组hGM-CSF Peprotech100-11
重组hPEDF  BioProductsMD004-096
ReliaPrep RNA 细胞微量提取系统PromegaZ6011
RIPA缓冲液赛默飞世尔科技89901
RNase-free DNase 试剂盒QIAGEN79254
RNeasy Mini KitQIAGEN74204
SDSApplichemA2572
用于WB的半干式转膜系统 伯乐（Bio-Rad）
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
Tris缓冲盐溶液（TBS） 赛默飞世尔科技15504020
Triton X-100AppliChemA4975
胰蛋白酶/EDTASigma-AldrichT4174
TweenAppliChem A1390
尿素赛默飞世尔科技29700
WesternBright ECL HRP 底物AdvanstaK-12045-D50
Whatman 硝酸纤维素膜Chemie BrunschwigMNSC04530301

参考文献

  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P. Effects of the macular carotenoid lutein in human retinal pigment epithelial cells. Antioxidants. 6 (4), (2017).
  3. Sacconi, R., Corbelli, E., Querques, L., Bandello, F., Querques, G. A Review of current and future management of geographic atrophy. Ophthalmology and Therapy. 6, 69-77 (2017).
  4. Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: a review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
  5. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - From hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  6. Ung, L., Pattamatta, U., Carnt, N., Wilkinson-Berka, J. L., Liew, G., White, A. J. R. Oxidative stress and reactive oxygen species. Clinical Science. 131, 2865-2883 (2017).
  7. Beatty, S., Koh, H. H., Phil, M., Henson, D., Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 45 (2), 115-134 (2000).
  8. Alhasani, R. H., et al. Gypenosides protect retinal pigment epithelium cells from oxidative stress. Food and Chemical Toxicology. 112, 76-85 (2018).
  9. National Institute of Health. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
  10. Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. The Lancet. 392, 1147-1159 (2018).
  11. He, Y., Leung, K. W., Ren, Y., Jinzhi, P., Jian, G., Tombran-Tink, J. PEDF improves mitochondrial function in RPE cells during oxidative stress. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, 6742-6755 (2014).
  12. Cao, S., Walker, G. B., Wang, X., Cui, J. Z., Matsubara, J. A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. Molecular Vision. 19, 718-728 (2013).
  13. Farnoodian, M., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF expression affects the oxidative and inflammatory state of choroidal endothelial cells. Amercian Journal of Physiology and Cell Physiology. 314 (4), 456-472 (2018).
  14. Polato, F., Becerra, S. P. Retinal Degenerative Diseases: Mechanisms and Experimental Therapies. Retinal Degenerative Diseases. , Springer. 699-706 (2016).
  15. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF regulates the ERK1/2 pathways and protects injured retinal ganglion cells from induced death. Experimental Eye Research. 89, 665-677 (2009).
  16. Schallenberg, M., Charalambous, P., Thanos, S. GM-CSF protects rat photoreceptors from death by activating the SRC-dependent signalling and elevating anti-apoptotic factors and neurotrophins. Graefes Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 250, 699-712 (2012).
  17. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  18. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  19. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. BioMed Research International. 2015, (2015).
  20. Weigel, A. L., Handa, J. T., Hjelmeland, M. L. Microarray analysis of H2O2-, HNE-, or tBH-treated ARPE-19 cells. Free Radical Biology & Medicine. 33 (10), 1419-1432 (2002).
  21. Allen, R. G., Tresini, M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology and Medicine. 28 (3), 463-499 (2000).
  22. Tate, D. J., Miceli, M. V., Newsome, D. A. Phagocytosis and H2O2 induce catalase and metallothionein gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 36 (7), 1271-1279 (1995).
  23. Halliwell, B., Clement, M. V., Long, L. H. Hydrogen peroxide in the human body. FEBS Letters. 486 (1), 10-13 (2000).
  24. Giblin, F. J., McCready, J. P., Kodama, T., Reddy, V. N. A direct correlation between the levels of ascorbic acid and H2O2 in aqueous humor. Experimental Eye Research. 38, 87-93 (1984).
  25. Geiger, R. C., Waters, C. M., Kamp, D. W., Glucksberg, M. R. KGF prevents oxygen-mediated damage in ARPE-19 cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46, 3435-3442 (2005).
  26. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28, 99-111 (2017).
  27. Chen, X. -D., Su, M. -Y., Chen, T. -T., Hong, H. -Y., Han, A. -D., Li, W. -S. Oxidative stress affects retinal pigment epithelial cell survival through epidermal growth factor receptor/AKT signaling pathway. International Journal of Ophthalmology. 10 (4), 507-514 (2017).
  28. Tu, G., et al. Allicin attenuates H2O2 - induced cytotoxicity in retinal pigmented epithelial cells by regulating the levels of reactive oxygen species. Molecular Medicine Reports. 13, 2320-2326 (2016).
  29. Hao, Y., Liu, J., Wang, Z., Yu, L., Wang, J. Piceatannol protects human retinal pigment epithelial cells against hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis through modulating. Nutrients. 11, 1-13 (2019).
  30. Ballinger, S. W., Van Houten, B., Conklin, C. A., Jin, G. F., Godley, B. F. Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells. Experimental Eye Research. 68 (6), 765-772 (1999).
  31. Ma, S., et al. Transgenic overexpression of uncoupling protein 2 attenuates salt-induced vascular dysfunction by inhibition of oxidative stress. American Journal of Hypertension. 27 (3), 345-354 (2014).
  32. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  33. Mátés, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  34. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
  35. Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
  36. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^(-ΔΔCT) method. Methods. 25 (4), San Diego, California. 402-408 (2001).
  37. Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
  38. Zhuge, C. C., et al. Fullerenol protects retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced premature senescence via activating SIRT1. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4628-4638 (2014).
  39. Kaczara, P., Sarna, T., Burke, M. Dynamics of H2O2 Availability to ARPE-19 cultures in models of oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 1068-1070 (2010).
  40. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 931-947 (2013).
  41. Wang, X., et al. PEDF protects human retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via upregulation of UCP2 expression. Molecular Medicine Reports. 19 (1), 59-74 (2019).
  42. Donadelli, M., Dando, I., Fiorini, C., Palmieri, M. UCP2, a mitochondrial protein regulated at multiple levels. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 1171-1190 (2014).

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PEDF GM CSF UCP2
诱导与分析Sleeping Beauty转座子转染的人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激
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