我们介绍一种通过过氧化氢（H2O2）处理视网膜色素上皮细胞以建立和使用氧化应激模型的实验方案，用于分析细胞形态、活力、密度、谷胱甘肽水平及UCP-2表达水平。该模型可用于研究转座子转染细胞所分泌蛋白对神经视网膜变性的抗氧化作用。
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摘要
摘要
氧化应激在多种退行性疾病中发挥关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种全球约影响3000万患者的病理状态。氧化应激可导致视网膜色素上皮（RPE）细胞合成的神经营养保护因子减少，例如色素上皮衍生因子（PEDF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），继而引发RPE细胞丢失，最终导致光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡。我们假设，通过视网膜下移植过表达PEDF和GM-CSF的转染RPE细胞，重建具有神经营养保护和神经发生潜能的视网膜微环境，有望通过减轻氧化应激损伤、抑制炎症反应以及促进细胞存活来防止视网膜退行性病变。利用 睡美人 转座子系统（SB100X人RPE细胞已转染了 PEDF 和 GM-CSF 基因，并利用qPCR、Western印迹、ELISA和免疫荧光证实了稳定的基因整合、长期的基因表达及蛋白质分泌。为确认其功能性和效力 PEDF 和 GM-CSF 由转染的RPE细胞分泌，我们已开发出一种体外检测方法，用于定量分析H的减少程度2O2诱导的氧化应激对培养的RPE细胞的影响。通过分析细胞形态、密度以及细胞内谷胱甘肽水平来评估细胞保护作用， UCP2 基因表达和细胞活力。与未经处理的对照组相比，转染后过表达PEDF和/或GM-CSF的RPE细胞，以及未经转染但经PEDF和/或GM-CSF预处理（使用市售产品或从转染细胞中纯化获得）的细胞，均表现出显著的抗氧化细胞保护作用。本研究中的H2O2-模型是一种简单而有效的方法，用于评估可能对治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）或类似神经退行性疾病有效的因素的抗氧化作用。
引言
此处描述的模型为评估生物制药制剂在降低细胞氧化应激方面的有效性提供了一种有用的方法。我们已利用该模型研究了PEDF和GM-CSF对H2O2介导的氧化应激对视网膜色素上皮细胞的影响，这些细胞暴露于高水平的O2以及可见光，并吞噬感光细胞外节膜，从而产生大量活性氧（ROS）1,2它们被认为是非血管性年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的主要致病因素3,4,5,6,7,8此外，视网膜色素上皮（RPE）合成的神经保护因子减少，特别是色素上皮衍生因子（PEDF）、类胰岛素生长因子（IGFs）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），导致RPE细胞功能障碍及其丢失，进而引起光感受器细胞和视网膜神经节细胞（RGC）死亡3,4,<....
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方案
人眼的采集和使用程序已获得州研究伦理委员会批准（编号：2016-01726）。
1. 细胞分离与培养条件
- 人源ARPE-19细胞系
- 在T75培养瓶中培养5 × 105个ARPE-19细胞（一种人源视网膜色素上皮细胞系），使用添加了10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素、80 µg/mL链霉素和2.5 µg/mL两性霉素B的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物（DMEM/Ham's F-12）（完全培养基），于37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养（其他细胞密度参见表1）。
- 每周更换三次培养基。
- 当细胞生长至约90%融合度（定性评估）时，吸除培养基，并用无菌1×PBS洗涤细胞。
- 加入5%胰蛋白酶-2% EDTA溶液，在37 °C孵育7–10分钟（体积参见表1），并在显微镜下观察细胞脱落情况。
- 通过加入含10% FBS的完全培养基终止胰酶消化反应（体积参见表1）。
- 对细胞进行转染（见实验方案第2步），以1:10的比例传代培养（每周一次），或按如下说明接种至96孔板（见实验方案第3.3和3.4步）。
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结果
人视网膜色素上皮细胞中氧化应激的诱导
ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞用不同浓度的 H2O2 处理 24 小时，并定量检测细胞内抗氧化剂谷胱甘肽的水平（图 2A、B）。50 µM 和 100 µM 的 H2O2 对谷胱甘肽的生成无明显影响，而在 350 µM 浓度下，ARPE-19 细胞和原代 hRPE 细胞中的谷胱甘肽水平均显著降低。细胞毒性分析显示，350 µM 是 H2O2 引起细胞活力显著下降的最低浓度（图 2C）。形态学上，经 H2O2 处理的 ARPE-19 细胞铺展减少、更趋圆形，且随着 H2O2 浓度升高，这些特征更加明显（
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讨论
本文所述方案提供了一种分析转染细胞所产生的PEDF和GM-CSF抗氧化及保护功能的方法，该方法可适用于转染了任何假定有益基因的细胞。在以移植基因修饰细胞将蛋白质递送至组织为目的的基因治疗策略中，获取有关蛋白表达水平、表达持续时间以及所表达蛋白在疾病模型中功效的信息至关重要。在本实验室中，该方案已成功用于明确PEDF和GM-CSF在氧化应激中的作用效果，而氧化应激已被假定为年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制中的重要环节。6,7具体而言，我们已采用该方案来界定抗氧化作用 SB100X介导的PEDF/GM-CSF转染原代hRPE细胞。多位研究者已证实，H2O2 诱导显著的氧化应激症状，但仍允许细胞再生28,29,38，这与我们的实验结果相似，已证明350 µM浓度作用24小时可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Gregg Sealy 和 Alain Conti 提供出色的技术支持，并感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的 Zsuzsanna Izsvák 教授慷慨提供 pSB100X 和 pT2-CAGGS-Venus 质粒。本研究由瑞士国家科学基金会和欧洲委员会在第七框架计划背景下资助。Z.I. 由欧洲研究理事会高级资助项目 [ERC-2011-ADG 294742] 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | 康宁 | 353047 | |
| 6孔板 | 格雷纳 | 7657160 | |
| 96孔培养板，白色，透明平底 | Costar | 3610 | 可在进行发光检测（GSH-Glo Assay）前检查细胞状态 |
| 96孔板 | 康宁 | 353072 | |
| 丙烯酰胺 40% | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0144 | |
| 两性霉素B | AMIMED | 4-05F00-H | |
| 抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体 | 赛默飞世尔科技 | PA5-24184 | |
| 抗体 抗小鼠 IgG/IgA/IgM | 安捷伦 | P0260 | |
| 抗体抗PEDF | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-390172 | |
| 抗五聚组氨酸抗体 | Qiagen | 34660 | |
| 抗磷酸化-Akt 抗体 | 细胞信号技术公司 | 9271 | |
| 抗体 anti-rabbit IgG H&L-HRP | Abcam | ab6721 | |
| 驴抗兔Alexa Fluor 594抗体 | 赛默飞世尔科技 | A11034 | |
| 抗体 山羊抗小鼠 Alexa 488 | 赛默飞世尔科技 | A-11029 | |
| ARPE-19细胞系 | ATCC | CRL-2302 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418-500G | |
| 腔室培养玻片 | 康宁 | 354118 | |
| CytoTox-Glo 细胞毒性检测 | Promega | G9291 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| DMEM/Ham's F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Duo Set ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY215-05 | |
| EDTA | 赛默飞世尔科技 | 78440 | |
| ELISAquant 试剂盒 | BioProducts MD | PED613-10-人类 | |
| 眼睛（人类） | Lions Gift of Sight 眼库（美国明尼苏达州圣保罗市） | ||
| FBS | 布伦施维格 | P40-37500 | |
| Fluoromount 水性封片介质 | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| FLUOstar Omega 酶标仪 | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism 软件（版本 8.0） | GraphPad Software, Inc. | ||
| GSH-Glo 谷胱甘肽检测试剂盒 | Promega | V6912 | |
| 过氧化氢（H₂O₂）2O2) | 默克 | 107209 | |
| ImageJ 软件（图像处理程序） | W.S. Rasband，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院（NIH）；https://imagej.nih.gov/ij/；1997–2014 | ||
| 咪唑 | Axonlab | A1378.0010 | |
| Leica DMI4000B 显微镜 | Leica Microsystems | ||
| LightCycler 480 仪器 II | 罗氏分子系统公司 | ||
| LightCycler 480 SW1.5.1 软件 | 罗氏分子系统 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376-1000 | |
| NaH2PO4 | Axonlab | 3468.1000 | |
| Neon 转染系统 | 赛默飞世尔科技 | MPK5000 | |
| Neon 转染系统 10 µL 型试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | MPK1096 | |
| 血细胞计数板 | 马里恩费尔德-上部 | 640010 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30410 | |
| 硝酸纤维素 | VWR | 732-3197 | |
| Omega Lum G 凝胶成像系统 | Aplegen 生命科学 | ||
| PBS 1× | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quantabio | 95072-012 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-100G | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23227 | |
| 引物 | Invitrogen | 参见补充材料中的表1 | |
| pSB100X (250 ng/µL | Mátés 等，2009。由 Zsuzsanna Izsvak 教授提供 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His 质粒 DNA（250 ng/µL | 使用 Johnen, S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建而成。 | ||
| pT2-CMV-PEDF-His 质粒 DNA（250 ng/µL | 使用 Johnen S. 等人（2012）在 IOVS, 53 (8), 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建。 | ||
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51304 | |
| 重组hGM-CSF | Peprotech | 100-11 | |
| 重组hPEDF | BioProductsMD | 004-096 | |
| ReliaPrep RNA 细胞微量提取系统 | Promega | Z6011 | |
| RIPA缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 89901 | |
| RNase-free DNase 试剂盒 | QIAGEN | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74204 | |
| SDS | Applichem | A2572 | |
| 用于WB的半干式转膜系统 | 伯乐（Bio-Rad） | ||
| SuperMix qScript | Quantabio | 95048-025 | |
| Tris缓冲盐溶液（TBS） | 赛默飞世尔科技 | 15504020 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Tween | AppliChem | A1390 | |
| 尿素 | 赛默飞世尔科技 | 29700 | |
| WesternBright ECL HRP 底物 | Advansta | K-12045-D50 | |
| Whatman 硝酸纤维素膜 | Chemie Brunschwig | MNSC04530301 |
参考文献
- Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
- Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P.
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