Method Article

睡眠美人转座转染人视网膜色素上皮细胞氧化应激的诱导与分析

DOI:

10.3791/61957

⸱

December 11th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提出了一种开发和使用氧化应激模型的方案，方法是用H2O2处理视网膜色素上皮细胞，分析细胞形态，活力，密度，谷胱甘肽和UCP-2水平。它是研究转座子转染细胞分泌的蛋白质治疗神经视网膜变性的抗氧化作用的有用模型。

Abstract

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氧化应激在几种退行性疾病中起着关键作用，包括年龄相关性黄斑变性（AMD），这是一种影响全球约3000万患者的病理。它导致视网膜色素上皮 （RPE） 合成的神经保护因子减少，例如色素上皮衍生因子 （PEDF） 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF），随后 RPE 细胞丢失，最终导致光感受器和视网膜神经节细胞 （RGC） 死亡。我们假设通过转染的RPE细胞过表达PEDF和GM-CSF的视网膜下移植来重建神经保护性和神经源性视网膜环境，有可能通过减轻氧化应激的影响，抑制炎症和支持细胞存活来预防视网膜变性。使用 睡美人 转座子系统（SB100X），人RPE细胞已经转染了 PEDF 和 GM-CSF 基因，并使用qPCR，蛋白质印迹，ELISA和免疫荧光显示出稳定的基因整合，长期基因表达和蛋白质分泌。为了确认转染的RPE细胞分泌的 PEDF 和 GM-CSF 的功能和效力，我们开发了一种体外测定法来量化培养物中H2O2诱导的氧化应激对RPE细胞的减少。通过分析细胞形态、密度、谷胱甘肽的细胞内水平 、UCP2 基因表达和细胞活力来评估细胞保护。与未处理的对照相比，转染的RPE细胞过度表达PEDF和/或GM-CSF以及未转染但用PEDF和/或GM-CSF（市售或从转染细胞中纯化）预处理的细胞显示出显着的抗氧化细胞保护。目前的H2O2模型是一种简单有效的方法来评估可能有效治疗AMD或类似神经退行性疾病的因子的抗氧化作用。

Introduction

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这里描述的模型为评估生物制药剂减少细胞氧化应激的效率提供了一种有用的方法。我们利用该模型研究了PEDF和GM-CSF对H2O2介导的氧化应激对视网膜色素上皮细胞的保护作用，这些细胞暴露于高水平的O2和可见光，以及光感受器外段膜的吞噬作用，产生显着水平的活性氧（ROS）1， 2.它们被认为是缺血性年龄相关性黄斑变性（aAMD）发病机制的主要贡献者3，4，5，6，7，8。此外，RPE合成的神经保护因子减少，特别是色素上皮衍生因子（PEDF），胰岛素样生长因子（IGF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）导致RPE细胞的功能障碍和丢失，其次是光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）死亡3，4，5

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Protocol

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收集和使用人眼的程序由州伦理研究委员会批准（编号:2016-01726）。

1. 细胞分离和培养条件

  1. 人 ARPE-19 细胞系
    1. 在Dulbecco的改良鹰培养基/营养混合物F-12火腿（DMEM / Ham's F-12）中培养5 x 105 个ARPE-19细胞，这是一种人RPE细胞系，在37°C下在T75烧瓶中加入10%胎牛血清（FBS），80 U / mL青霉素，80μg/ mL链霉素B（完整培养基）在5%CO2 和95%空气的加湿气氛中（其他细胞密度见表1）。
    2. 每周更换三次介质。
    3. 一旦细胞生长到约90%汇合（定性评估），吸出培养基并用无菌的1x PBS洗涤细胞。

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Results

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诱导人视网膜色素上皮细胞中的氧化应激
ARPE-19和原代hRPE细胞用不同浓度的H2O2处理24小时，并定量抗氧化剂谷胱甘肽的细胞内水平（图2A，B）。H2O2在50μM和100μM不影响谷胱甘肽的产生，而在350μM时，ARPE-19和原代hRPE细胞中的谷胱甘肽显着降低。细胞毒性分析表明，350μM是H2O2的最低浓度，导致细胞活力显着降低（图2C）。从形态学上讲，用H 2 O2处理的ARPE-19细胞看起来扩散更少，更圆润，随着H 2 O2浓度的增加，特征变得更加明显（图3）。对于用H2<.......

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Discussion

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这里提出的方案提供了一种分析转染细胞产生的PEDF和GM-CSF的抗氧化和保护功能的方法，可以应用于任何假定有益基因转染的细胞。在以通过移植转基因细胞将蛋白质递送到组织的基因治疗策略中，获得有关蛋白质表达水平，表达寿命以及表达蛋白质在疾病模型中的有效性的信息至关重要。在我们的实验室中，这里提出的方案可用于确定PEDF和GM-CSF对氧化应激的有效性，氧化应激已被假设为aAMD6，7发病机制中的重要元素。具体而言，我们使用该协议来定义SB100X介导的PEDF / GM-CSF转染的原代hRPE细胞的抗氧化作用。一些研究人员已经证明，H2O2诱导明显的氧化应激症状，但仍然允许细胞再生28，29，38，类似于我们的实验结果，该实验结果表明，350μM持续24小时在人ARPE-19和原代RPE细胞中诱导有效的氧化应激，可用于分析PEDF和GM-CSF的保护作用。.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者要感谢Gregg Sealy和Alain Conti的出色技术援助，以及柏林Max-Delbrück中心的Zsuzsanna Izsvák教授慷慨地提供了pSB100X和pT2-CAGGS-Venus质粒。这项工作得到了瑞士国家科学基金会和欧盟委员会在第七个框架方案的范围内的支持。Z.I由欧洲研究委员会ERC Advanced资助[ERC-2011-ADG 294742]。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 孔板康宁353047
6 孔板Greiner7657160
96 孔培养板 白色，透明平底 Costar3610允许在测量发光（GSH-Glo 测定）
96 孔板康宁 
40%Biorad161-0144
两性霉素 BAMIMED4-05F00-H
抗体 抗 GMCSFThermoFisher ScientificPA5-24184
抗体 抗小鼠 IgG/IgA/IgM AgilentP0260
抗体抗 PEDF Santa Cruz Biotechnology Incsc-390172
抗体抗五聚体-His Qiagen34660
抗体抗磷酸化 Akt细胞信号传输技术9271
抗体抗兔 IgG H&L-HRPAbcamab6721
抗体 驴抗兔 Alexa Fluor 594 赛默飞世尔科技 A11034
抗体山羊抗小鼠 Alexa 488ThermoFisher ScientificA-11029
ARPE-19 细胞系ATCCCRL-2302
BSA Sigma-AldrichA9418-500G
载玻片箱式培养载玻片康宁354118
CytoTox-Glo 细胞毒性检测 PromegaG9291
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
DMEM/Ham's F12 Sigma-AldrichD8062
Duo Set ELISA 试剂盒R&D Systems DY215-05
EDTAThermoFisher Scientific78440
ELISAquant 试剂盒生物产品 MDPED613-10-人
眼（人）Lions Gift of Sight 眼库（明尼苏达州圣保罗）
FBS BrunschwigP40-37500
氟镶片水性封片剂Sigma-AldrichF4680-25ML
FLUOstar Omega 读板机 BMG Labtech
GraphPad 棱镜软件 （版本 8.0）GraphPadSoftware， Inc.
GSH-Glo 谷胱甘肽测定PromegaV6912
过氧化氢 （H2O2）默克107209
ImageJ 软件（图像处理程序）WS Rasband，NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国;https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
咪唑 AxonlabA1378.0010
徕卡DMI4000B显微镜 徕卡显微系统
LightCycler 480 仪器 II Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 软件Roche Molecular Systems
NaClSigma-Aldrich71376-1000
NaH2PO4Axonlab3468.1000
Neon 转染系统 ThermoFisher ScientificMPK5000
Neon 转染系统 10 µL 套件ThermoFisher ScientificMPK1096
Neubauer 室Marienfeld-superior640010
Ni-NTA 超流 Qiagen30410
硝酸纤维素 VWR732-3197
Omega Lum G 凝胶成像系统Aplegen 生命科学
PBS 1XSigma-AldrichD8537
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuantabio95072-012
PFA Sigma-Aldrich158127-100G
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 ThermoFisher Scientific23227
引物 Invitrogen 参见补充材料
pSB100X 中的表 1（250 ng/µL）MátéS 等人，2009 年。由 Zsuzsanna Izsvak 教授提供
pT2-CMV-GMCSF-His 质粒 DNA（250 ng/µL）使用 Johnen， S. 等人 （2012） IOVS， 53 （8）， 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建。
pT2-CMV-PEDF-His 质粒 DNA （250 ng/µL）使用 Johnen， S. 等人 （2012） IOVS， 53 （8）， 4787-4796 中报道的现有 pT2-CMV-PEDF-EGFP 质粒构建。
QIAamp DNA Mini 试剂盒QIAGEN51304
重组 hGM-CSF Peprotech100-11
重组 hPEDF  生物制品MD004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep SystemPromegaZ6011
RIPA 缓冲液ThermoFisher Scientific89901
无 RNase DNase 套装QIAGEN79254
RNeasy 迷你试剂盒QIAGEN74204
SDSApplichemA2572
半干转印WB 系统 Bio-Rad
SuperMix qScriptQuantabio95048-025
Tris 缓冲盐水 （TBS） ThermoFisher Scientific15504020
Triton X-100AppliChemA4975
蛋白酶/EDTASigma-AldrichT4174
吐温应用化学 A1390
尿素ThermoFisher Scientific29700
WesternBright ECL HRP 底物AdvanstaK-12045-D50
Whatman 硝酸纤维素膜Chemie BrunschwigMNSC04530301
之前检查细胞 353072 抗 GMCSF 的 胰

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zareba, M., Raciti, M. W., Henry, M. M., Sarna, T., Burke, J. M. Oxidative stress in ARPE-19 cultures: Do melanosomes confer cytoprotection. Free Radical Biology and Medicine. 40 (1), 87-100 (2006).
  2. Gong, X., Draper, C. S., Allison, G. S., Marisiddaiah, R., Rubin, L. P.

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