本方案旨在通过悬滴共培养细胞来制备三维心脏球状体（CSs）。 将胶原蛋白包埋的CSs用生理浓度的阿霉素（DOX，一种心脏毒性试剂）处理，以建立心力衰竭模型。利用DOX处理的CSs进行体外测试，可用于发现针对心力衰竭患者的新疗法。
本文内容
摘要
摘要
尽管心脏组织工程已取得多项进展，但目前仍面临一个主要挑战，即构建出具有多层级复杂结构的完全功能性血管网络，以向生物工程化心脏组织内部输送氧气和营养物质。本实验室开发了一种三维体外人的心脏模型，称为“心脏类球体”或“CS”。该模型具备人的心脏典型的生化、生理及药理学特征，通过共培养心脏的三种主要细胞类型——心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞——而生成。将人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs 或 iCMs）与人的心脏成纤维细胞（HCFs）及人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）以接近体内实际比例的方式，在悬滴培养板中共同培养三至四天。对经抗心肌肌钙蛋白T、CD31和波形蛋白抗体染色的CS进行共聚焦分析（上述三种蛋白分别为心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞的标志物），结果显示CS中形成了复杂的内皮细胞网络，其结构类似于人的心脏中天然存在的血管网络。该结果亦通过共聚焦图像的三维重建分析得到证实。CS还表达人的心脏典型的细胞外基质（ECM）蛋白，如IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白。此外，与仅含iCMs的CS相比，此类CS表现出更接近人的心脏特征的合胞体收缩活性。当使用具有心脏毒性的抗癌药物（如用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌的阿霉素（DOX））处理时，10 µM浓度的DOX可显著降低CS的细胞活力；而在HCFs和HCAECs中，对DOX下游靶点内皮型一氧化氮合酶进行基因或化学抑制，可减轻DOX在CS中的毒性作用。鉴于上述独特特性，CS目前被广泛用作体外模型，用于研究心脏的生物化学、病理生理学及药理学特性。
引言
人类心脏的再生能力有限，尽管近年来组织工程和干细胞技术取得了进展，但心血管疾病（CVD）仍然是全球死亡的主要原因1。开发新型治疗手段，包括分子和细胞层面的方法，以修复受损心脏或防止心脏功能衰竭，是目前心脏病患者面临的主要临床需求之一2,3,4。心脏组织工程的主要目标是构建具有人类心脏典型分子、细胞和细胞外特征的三维（3D）心肌组织，包括其血管网络和生理性的收缩功能4,5,6。
为了生物工程化构建可用于体外和体内应用、模拟人类心脏功能的心脏组织，研究人员已探索了多种方法，包括工程化心脏组织（EHTs）、细胞片层和球形体培养。7,8然而，这些组织无法重现人类心脏典型的最佳三维微环境，其在心血管疾病患者中的潜在应用也无法直接从实验室转化到临床。7这是因为它们无法重现体内心脏组织复杂的生物学特性、形态学特征和生理功能。9心脏组织工程面临的主要挑战之一是构建具有层级结构的血管网络，因为任何直径超过200 μm的组织，其中心区域均会出现细胞死亡2,10人类心脏组织中结构正常的血管网络在向心肌细胞供应血液、氧气和营养物质方面起着重要作用11在胚胎发育过程中，冠状毛细血管和动脉形成 通过 从内皮祖细胞生成血管（新生血管形成）和血管发生（由已有血管生成新血管）8,12心脏成纤维细胞通过提供最佳的细胞外基质（ECM）和生长因子组成，在血管网络的正常形成过程中也发挥着重要作用13,14.
生物工程心脏组织中的三维血管网络通过形成氧气和营养物质梯度以及旁分泌信号（例如同型细胞相互作用、异型细胞相互作用、细胞通过分泌可溶性蛋白的相互作用以及细胞与细胞外基质的相互作用）来调控细胞存活和功能3,10,15,16,17,18。这可防止组织中心区域的细胞死亡，并促进生物工程心脏组织中细胞的存活能力及生理功能16,18,19。
近年来，研究人员探索了源自干细胞的球状体培养物作为人类心脏的体外模型20。为进一步改善体外心脏微环境，这些模型包含了人类心脏中存在的所有主要细胞类型，例如心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。球状体培养为细胞的生长和功能提供了必要的三维结构支持，并可用于生物工程构建血管网络14,20,21,22。在此背景下，本实验室通过共培养心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，并按照人类心脏中各类细胞的比例构建了人类心脏球状体（CSs）14。该模型是在大鼠心室心脏细胞球状体模型基础上的扩展，后者通过悬滴培养法共培养心脏细胞，用于模拟心肌纤维化21。人类CSs可用于毒性检测，例如用阿霉素（DOX，一种用于治疗白血病、淋巴瘤和乳腺癌的抗癌药物）处理，该药物已被证实即使在给药后17年仍可诱导心肌纤维化和心力衰竭（HF）14。
在本文中，我们描述了通过在悬滴培养系统中共同培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs 或 iCMs）、人心脏成纤维细胞（HCFs）和人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）来生成人心脏类器官（CSs）的方法。为了在体外测试中使用和成像这些心脏类器官，将其包埋于胶原凝胶中。利用抗CD31抗体（内皮细胞标志物）对心脏类器官进行染色并进行共聚焦分析，结果显示这些细胞形成了类似于体内观察到的网络结构。为诱导心力衰竭并潜在测试可能用于治疗或预防该疾病的新型药物，我们用10 µM DOX（相当于接受该药物治疗的癌症患者血液中的浓度）处理心脏类器官。当使用钙黄绿素-AM和碘化乙啶同型双聚体（分别标记活细胞和死细胞）染色时，经DOX处理的心脏类器官相较于未接受药物处理的对照组表现出显著降低的存活率。此外，在1至3 Hz的场电位刺激下，心脏类器官表现出均匀的收缩活动。
方案
注意：本方案中使用的 hiPSC-CMs 可从商业途径获得。如需开展本工作，请事先获得所在机构的人类伦理委员会批准。
1. 人的心脏成纤维细胞 和内皮细胞培养接种与生长
- 将含有 HCFs 和 HCAECs 的冻存管置于 37 °C 水浴中解冻一分钟。
- 在生物安全二级的无菌层流超净台内操作冻存管。
- 使用 1000 µL 移液枪头吸取 1 mL 细胞悬液，分别加入含有 7 mL 人源心脏成纤维细胞培养基（用于 HCFs）或 7 mL 人源间充质内皮细胞生长培养基（用于 HCAECs）的 15 mL 离心管中。
注意：为充分回收每支冻存管中的细胞，可用同一 15 mL 管中的培养基冲洗冻存管两次，每次 1 mL。 - 轻柔混匀细胞悬液。
- 使用 10 mL 血清移液管将细胞悬液分别转移至不同的 T75 培养瓶中。
- 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 18 小时后，吸除两个培养瓶中的培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一次，以去除冻存保护剂和死亡细胞。
- 向每个培养瓶中加入 7 mL 相应的完全培养基，继续在 37 °C 下培养。
- 定期观察细胞增殖状态和存活率，每隔一天更换一次培养基，直至细胞融合度达到 80–90%。
2. iCM 培养接种与生长
- 用含有 40 µg/mL 纤连蛋白（FN）的 2 mL PBS 预包被两个 T25 培养瓶，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 4 小时。
- 4 小时后，取一个含有 iCMs 的冻存管，置于 37 °C 水浴中解冻 4 分钟。
- 将冻存管转移至洁净的 II 级生物安全柜内。
- 使用 1 mL 移液枪头，轻柔地将 iCMs 从冻存管转移至无菌的 50 mL 离心管中。
- 用 1 mL 室温铺板培养基冲洗空的 iCMs 冻存管，以回收残留细胞。在 90 秒内逐滴将冲洗液加入含 iCM 细胞悬液的 50 mL 离心管中。
注意：添加培养基时应轻柔地摇动离心管，使溶液充分混合，以减少解冻细胞的渗透压冲击。 - 向 50 mL 离心管中缓慢加入 8 mL 室温铺板培养基。首先在 30–60 秒内逐滴加入 1 mL，然后在接下来的 30 秒内加入剩余体积。在加入铺板培养基时轻柔摇动离心管。通过倒置 2–3 次轻柔混匀 50 mL 离心管中的内容物（避免剧烈震荡或涡旋）。
- 立即使用血细胞计数板进行细胞计数，并确定活细胞密度（单位：细胞/mL）。
- 取经 FN 预包被的 T25 培养瓶，吸除 FN-PBS 溶液，注意不要让培养瓶干燥。随后加入接种体积的 iCMs（在 8 mL 室温铺板培养基中加入 1.6 × 106 个活 iCMs ）。
- 将 iCMs 在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 48 小时。
- 使用前一天将维持培养基在 4 °C 条件下过夜解冻。
- 将维持培养基在 37 °C 水浴中平衡，并立即使用。
- 2 天后，将 iCMs 的 T25 培养瓶转移至生物安全柜中。
- 通过轻柔地上下吹打铺板培养基 5 次，洗去死亡细胞和碎片。
- 吸除铺板培养基，更换为 8 mL 预热的维持培养基。将 T25 培养瓶放回培养箱中。每隔一天更换一次维持培养基，并定期观察细胞融合度。
3. 细胞分离与计数
- 首先收集 HCAECs 和 HCFs，然后按照步骤 3.2–3.12 收集 iCMs。
- 通过混合 10 mL iCMs 维持培养基、5 mL 人源心脏成纤维细胞培养基和 5 mL 间充质内皮生长培养基，制备 CS 培养基。
- 从含有 HCFs 和 HCAECs 的每个组织培养瓶中移除培养基，并用 5 mL PBS 冲洗 T75 培养瓶一次，随后移除 PBS。
- 向每个 T75 培养瓶中加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。
- 待细胞脱落时，立即加入 5 mL 培养基中和胰蛋白酶 EDTA 溶液。
- 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 4 分钟。
- 小心移除每管中的上清液。向每份细胞沉淀中加入 1 mL CS 培养基并重悬细胞。将离心管置于冰上，使用台盼蓝和血细胞计数板进行细胞计数。
- 移除含有 iCMs 的组织培养瓶中的维持培养基，并用 3 mL PBS 冲洗一次。
- 向每个 T75 培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，每隔一分钟检查一次细胞，直至细胞脱落。
- 待细胞脱落时，立即加入 4 mL 培养基中和胰蛋白酶 EDTA 溶液。
- 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
- 小心移除每管中的上清液。向细胞沉淀中加入 1 mL 培养基并重悬细胞。将离心管置于冰上，使用台盼蓝和血细胞计数板进行细胞计数。
4. CS 的生成与生长
- 以2:1:1的比例混合iCMs、HCFs和HCAECs，即每滴含20 µL CS培养基的悬滴培养液中接种10,000个iCMs、5,000个HCFs和5,000个HCAECs。根据CSs的总数调整最终体积。
- 使用手动移液器或 robotic 多通道移液器进行自动化液体处理，将20 µL细胞悬液加入384孔HDC板的每个孔中。
- 在悬滴板周围的通道两侧各加入1.5 mL无菌PBS，以防止CSs干燥。将HDC板置于37 °C培养箱中孵育。
- 每天观察CSs的形成情况，直至大多数孔中出现结构完整的球形体。每隔一天向每个孔中添加7.5 µL CS培养基，直至CSs形成。
5. CS 在胶原凝胶中的包埋
- 使用1 mL移液枪头收集心脏类球体（CS）。
注意：使用前需用无菌锋利表面（如手术刀或剪刀）从枪头尖端向上约0.2 cm处剪开，以防止在收集过程中损伤凝胶包埋的类球体。 - 将CS悬液收集至一个50 mL离心管中，并置于冰上。
- 在300 × g条件下离心5分钟。
注意：所得沉淀物必须在使用前始终保持在冰上。 - 在冰上配制胶原凝胶溶液（按每孔100 µL，共30孔，用于96孔板），使用大鼠尾部胶原蛋白与CS培养基按3:7比例混合。
- 移除含有CS的离心管中的上清液。
- 将沉淀的CS与胶原凝胶溶液混合均匀。
- 向CS-胶原凝胶悬液中加入1 µL/mL的5 mM氢氧化钠溶液，并轻轻混匀。
- 将100 µL CS-胶原凝胶混合物转移至透明平底96孔黑色聚苯乙烯微孔板中，于37 °C孵育30分钟。
6. DOX处理的CS的活力与毒性测定
- 30 分钟后从培养箱中取出 96 孔板
- 配制 10 µM 的 DOX 溶液（依据先前建立的 CSs 细胞死亡实验方案14）。
注意：若需测试其他可能在 CSs 中对心力衰竭具有保护作用的试剂，可配制含 DOX + 试剂 A、B 等的溶液 - 向每孔中加入 100 µL 含 DOX 和/或其它试剂的溶液。对照组培养物中加入不含 DOX 的培养基
- 将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 18 小时
- 次日，取出活/死细胞染色试剂的储备液，并在生物安全柜中避光置于冰上使其解冻
- 配制含有 Hoechst 染料、4 µM 乙啶同二聚体和 2 µM 钙黄绿素-AM 的溶液
- 向每孔中加入 100 µL 含 Hoechst 染料、钙黄绿素-AM/乙啶同二聚体的溶液
- 使用多功能酶标仪分别在 645 nm 检测乙啶同二聚体、在 530 nm 检测钙黄绿素-AM 的荧光信号
- 将荧光检测数据导入 GraphPad PRISM 软件（或其它等效的统计分析软件）
- 使用 GraphPad Prism 软件进行数据分析和统计处理
- 作为质量控制，使用落射荧光显微镜观察细胞核染色情况，以及钙黄绿素-AM 和乙啶同二聚体的染色结果
7. CS 收缩功能评估
- 收集在步骤 5.8 中制备的微量培养板。
- 打开装有 IonOptix 软件的计算机，用于基于视频的边缘检测、荧光辅助接口和 MyoPacer 电场刺激器。
- 将新的盖玻片置于组织支架平台上，并组装带有电极的水浴装置。
- 使用从边缘处截去0.5 mm的1 mL移液枪头，轻柔地从胶原凝胶中收集心脏类球体（CS），并将其转移至Falcon管中。加入培养基浸没CS，防止其干燥。每次转移一个CS，用少量培养基将其转移至 µIonOptix 系统载物台上的 L 培养基。
- 选择待分析的心脏类球体（CS） 通过 使用 IonOptix 软件在心脏球状体（CS）左右两侧设置峰值。
- 使用基于计算机的运动分析仪追踪心脏球体（CS）边缘的运动。
注：通常，收缩力以%细胞缩短率或%分数缩短率来衡量。本实验中，我们测量的是%球体缩短率。 - 通过计算机调整阈值和边缘选项，以稳定两个峰。
- 使用 Myopacer 电场刺激器，将 CSs 暴露于不同频率（0.3、0.6、1、2 和 3 Hz）和电压（1、2、3 和 5 V）下。
- 记录经 DOX 处理与未处理的 CS 的短缩情况，以 CS 长度变化表示。使用 Soft-Edge 软件分析数据，并对每个 CS 的数据进行平均。
8. 心脏类球体的显微镜观察：固定与免疫标记
- 在室温下静置30分钟后（按步骤5.8准备），收集96孔板，并用4%多聚甲醛（PFA）固定心脏类球体（CS）1小时。
- 移除PFA，并用含0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBSA）清洗三次。
- 移除PBSA。
- 每孔加入200 µL含0.02% Triton-X-100的PBSA溶液，在摇床上孵育30分钟。
注意：此步骤可使CS通透，以促进抗体更好地渗透。 - 每孔加入200 µL含3%牛血清白蛋白的PBSA封闭液，在室温下孵育60分钟。
注意：此步骤用于阻断CS中非特异性抗体结合位点。 - 在封闭液中配制含10 µg/mL抗人CD31小鼠一抗的溶液。
- 每孔加入100 µL一抗溶液，在4 °C摇床上避光孵育过夜。
- 在摇床上用PBSA于室温清洗96孔板三次，每次20分钟。
- 在封闭液中配制含Hoechst DNA染料和10 µg/mL Cy3标记的驴抗小鼠二抗的混合溶液。
- 每孔加入100 µL含Hoechst染料的二抗溶液，在4 °C摇床上避光孵育过夜。
注意：从此步骤起，需用铝箔包裹96孔板以避光。 - 在摇床上用PBSA于室温清洗96孔板三次，每次20分钟。
- 每孔加入100 µL Vectashield封片剂。
- 在激光扫描共聚焦显微镜下观察CS的荧光信号。沿Z轴进行光学切片，并使用ImageJ软件将图像合并为单一焦平面。
结果
本论文所述方案提供了一种替代方法，可在生物工程化心肌组织中构建复杂的 cardiac endothelial cell 网络，与现有模型相比，具有更高的细胞存活率和功能（图1）。在 CSs 中重现的 3D 体内心脏微环境促进了其对 DOX 的响应，该浓度相当于癌症患者血液中的水平（5 至 10 μM，图2）。与对照组（无 DOX）CSs 相比，经 DOX 处理的 CSs 在 24 小时内表现出细胞存活率的统计学显著下降（图2），这种毒性效应在人类癌症患者中甚至在用药后 17 年仍可观察到。
图1．心脏球体（CS）形成与血管化分析。（A）示意图显示了通过iCMs、HCAECs和HCFs在悬滴中共培养形成心脏球体（CS）的步骤。右侧的明场图像展示了从悬滴中的单个细胞逐步形成球体的过程。（B）心脏球体的共聚焦图像Z轴叠加图，经针对心肌肌钙蛋白T（cTNT）、PECAM和波形蛋白（vimentin）的抗体染色，分别标记心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。本图改编自14。请点击此处查看该图的放大版本。
图2．类器官中的细胞活力与毒性。 对类器官在仅含培养基（DOX 0 μM）或含多柔比星（10 μM）条件下处理后的钙黄绿素-AM（A）和溴化乙啶同二聚体（B）荧光进行的统计学分析。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在发育过程中，正常的血管网络形成对于包括人类心脏在内的功能性组织的生成至关重要10,12,23,24,25,26。对三维组织进行适当血管化的考虑，有助于氧气、生长因子、信号分子和营养物质的交换，防止厚度超过200 μm的组织内部发生细胞坏死6,10,12,17,24,25,26,27,28。目前可用的体外三维心脏模型虽然具备血管网络，但主要表现为毛细血管尺寸、结构无序的血管网络，缺乏体内所观察到的具有层级结构的复杂分支式血管系统6,8,29。本论文所描述的构建复杂心内皮细胞网络的替代方法，相较于现有模型表现出更优的细胞存活率和功能（图1）14,22。体外三维心球（CSs）通过更好地模拟人类心脏的体内微环境（包括其分子、细胞及细胞外成分），实现了对人类心脏的建模14,22。利用悬滴法由干细胞来源的细胞生成心球，可在明确定义的条件下进行培养（例如细胞类型及其比例、组织形成的适宜条件）。在心球中将诱导型心肌细胞（iCMs）与人心脏成纤维细胞（HCFs）和人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）共培养，可界定调控心脏病理生理过程的分子与细胞间相互作用，包括其收缩功能以及对患者血液中药物浓度的反应14。由于这些独特特性，心球已被用于模拟心肌纤维化——心肌梗死和心力衰竭的严重后果之一21。我们先前的研究表明，内皮细胞和成纤维细胞的同时存在对于重建人类心脏血管微环境至关重要，能够促进成纤维细胞来源的细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、纤连蛋白和IV型胶原）在发育中的内皮细胞网络附近实现最佳沉积14,21。
多柔比星（DOX）是一种众所周知具有心脏毒性的药物，即使在癌症患者治疗结束17年后，仍可能引发心力衰竭30。然而，它仍是治疗儿童白血病、淋巴瘤以及女性乳腺癌的首选药物30。因此，在心脏类器官（CSs）中使用DOX处理已被用于体外模拟心力衰竭（HF），以研究调控心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞毒性的机制14，并建立HF诱导的心肌纤维化模型21。 当DOX浓度达到癌症患者血液中检测到的水平（5至10 μM）时，处理24小时后，CSs的细胞活力在统计学上显著降低14（图2）。我们实验室先前的研究还通过使用基因和化学抑制剂干预内皮型一氧化氮合酶（eNOS）信号通路，证实了DOX对心脏内皮细胞和成纤维细胞的毒性作用14。利用基因（NOS3 shRNA）和化学（N5-(1-亚氨基乙基)-L-鸟氨酸二盐酸盐，即L-NIO）拮抗剂靶向抑制作为DOX下游通路的eNOS信号通路，可防止DOX对心脏内皮细胞和成纤维细胞的毒性作用14。
由于心肌细胞在受到场电位刺激时存在电耦合，因此也可通过该方法测量 CSs 中的收缩活性。我们发现，使用对照培养基（DOX 0 μM）培养的 CSs 能够自发且均匀地收缩，其搏动频率可在 1 至 3 Hz 范围内通过电场刺激进行调控，这与健康人的心脏功能相当。相比之下，经 DOX 处理的 CSs 无法响应电刺激，亦不能产生收缩。结合使用钙黄绿素-AM 和溴化乙锭同源二聚体对细胞活力和毒性的检测，该功能性检测方法可实现对体外人心脏典型复杂状况的评估，而这是目前其他模型尚无法实现的。与利用相同系统对单个心肌细胞收缩活性的测量相比，我们无法在 CSs 中可视化或测量肌节结构。因此，我们仅能通过随时间变化的类球体缩短率（% spheroid shortening）来进行评估，该检测方法由本实验室自主建立。由于我们在每个 CS 中共培养的细胞数量可控，因而可确保各 CS 的大小一致，从而获得具有均一收缩功能的 CSs。然而，即使生成了不同大小的 CSs，其收缩活性也未发生改变。
还需要指出的是，由于心脏球状体（CSs）具有多细胞特性，其质量足以使其在Ion-Optix系统中沉降至盖玻片底部，即使在灌流条件下也是如此。由于CSs能够自行稳定在特定位置，因此我们无需像大多数实验室处理单个心肌细胞那样，使其黏附于盖玻片上。
使用针对心肌肌钙蛋白T、CD31/PECAM和PECAM的抗体（分别作为iCMs、HCAECs和HCFs的标志物）对心脏类器官（CSs）进行染色后的显微分析显示，内皮细胞网络已形成（图1，蓝色）。为完全排除CSs内部发生坏死，本实验室通过共聚焦显微镜分析经钙黄绿素-AM/碘化丙啶同型二聚体染色的CSs，对细胞活力进行了空间评估（数据未显示）。然而，必须指出的是，生物制造领域未来仍需进一步发展，以更好地模拟目前在现有模型中尚无法实现的人体心脏在体内的其他复杂特征，这些特征包括：i）成年心肌细胞典型的收缩功能；ii）血流和压力作用力；iii）旁分泌信号传导；iv）免疫反应，这些因素对于改进本研究及其他体外心脏模型至关重要6。如同其他模型旨在模拟健康组织或疾病状态的主要特征一样，本文所述CSs的生成与使用方案旨在帮助研究人员回答特定科学问题，但该方法可能无法全面涵盖所有研究需求。例如，利用患者来源的细胞生成CSs，将为个性化医学提供有力工具，而这是目前常用的心血管研究高通量检测手段所无法实现的。
综上所述，我们展示了一种利用心肌细胞更真实地模拟人类心脏微环境的简便方法。与心肌细胞的单层培养相比，心脏类球体呈现出一种更接近人类心脏中所存在的内皮细胞网络。鉴于其独特的特性，它们为心血管研究的体外检测提供了先进的工具。未来利用患者来源细胞开展的研究，可能为预防和更有效治疗心血管疾病提供个体化医疗和新型疗法的新选择。
致谢
特别感谢 Nat Johnston 对视频的录制与编辑工作。
Poonam Sharma 获得了纽卡斯尔大学的 UNIPRS 和 UNRS Central 资助 & 教职工学院（UNRSC5050）奖学金。Carmine Gentile 获得了悉尼科技大学种子基金、悉尼天主教总教区成人干细胞研究资助以及悉尼医学院基金会心胸外科研究资助的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A1933 | |
| 驴抗小鼠二抗 | 杰克逊免疫学研究实验室股份有限公司 | 715-165-150 | Cy3 荧光素标记的二抗 |
| 盐酸多柔比星 | Sigma-Aldrich | D1515 | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 从牛血浆中 |
| 人的心脏成纤维细胞（HCFs） | Cell Applications, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 306AK-05a | 5×10^5 个细胞（成体），培养基 & 传代培养试剂 |
| 人冠状动脉内皮细胞（HCAECs） | Cell Applications, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 300K-05a | 5×10^5 个细胞（成体），培养基 & 传代培养试剂 |
| 人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iCMs） | 富士胶片细胞动力学公司 | R1057 | iCell 心肌细胞试剂盒，01434 |
| HCF 生长培养基 | Cell Applications, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 316-500 | |
| 人源中胚层-内胚层细胞生长培养基 | Cell Applications, Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 212-500 | |
| LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen | L3224 | |
| 维持培养基（iCells） | 富士胶片细胞动力学公司 | R1057 | iCell 心肌细胞试剂盒，01434 |
| 小鼠抗人 CD31/PECAM 单克隆抗体 | BD Pharmingen，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 566177 | |
| NucBlue Live ReadyProbe 试剂（Hoechst 33342） | 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen | R37605 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 铺板培养基（iCells） | 富士胶片细胞动力学公司 | R1057 | iCell 心肌细胞试剂盒，01434 |
| 大鼠尾胶原 | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 胰蛋白酶–EDTA，0.25% | Gibco，赛默飞世尔科技 | 25200072 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 组织培养瓶（T25） | 赛默飞世尔科技 | 156367 | |
| 96孔平底透明底部黑色聚苯乙烯TC处理微孔板 | 美国纽约州科宁 | 3603 | |
| 384孔悬滴板 | 3D Biomatrix，美国密歇根州安娜堡 | HDP1385 |
参考文献
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