我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。
本文内容
摘要
摘要
尽管海马体沿其纵轴的总体结构相似，但近期研究揭示了其在分子、解剖和功能特征上存在显著差异，提示海马体沿前后轴可划分为不同的亚环路。由于连接性和功能的不同，其中最基本的区分是背侧海马体与腹侧海马体，它们分别主要参与空间信息处理和情绪信息处理。因此，关于空间记忆形成的在体研究主要集中于背侧海马体。
相比之下，电生理体外记录通常优先在中间腹侧海马区进行，这主要是由于脑片存活率和环路完整性等因素的驱动。为了实现体内空间信息处理数据与体外数据的直接关联，我们改进了既往的切片方法，以从背侧-中间海马区获得高存活率的横断面脑片，用于长期记录齿状回中的主要神经元和中间神经元。由于空间行为通常在成年小鼠中进行分析，因此我们将这种横断切片方法与保护性溶液结合使用，以提高成熟动物脑组织的存活能力。本方法适用于约3月龄的小鼠。该技术为常用于背侧海马体外研究的冠状切片制备方法提供了一种良好的替代方案。我们从记录质量以及所记录神经元形态特征的保存程度两方面对这两种制备方法进行了比较。
引言
海马体因其在学习与记忆、空间导航以及情绪等不同方面的重要作用而被广泛研究。海马体的基本环路通常被称为"三突触环路"，是一种在横断轴上呈层状分布的网络结构，该结构在纵轴方向上基本保持不变1。海马体对多种认知和情绪行为的贡献，可能源于这一基本环路沿背腹轴与多个其他脑区之间建立的多样化连接2,3。然而，除了传入和传出连接之外，越来越多的研究表明，海马体在隔颞轴向上还存在进一步的差异。这些差异涉及内部结构与连接性，以及基因表达模式和神经元形态的差异4,5,6,7,8。
鉴于基础神经环路存在此类差异，根据所研究的具体问题选择特定的海马亚区环路进行探究是合理的。例如，若研究问题涉及空间信息处理相关的神经机制，则应关注背侧而非腹侧海马，尽管由于海马内部的纵向连接，两者在活体中并非独立发挥作用9,10,11。因此，不仅需要考虑沿纵向轴的差异，还应尽可能保留局部及长程环路的完整性。为了维持纤维通路和连接性，脑组织切片的角度至关重要。
文献中首次报道的三突触环路研究方法，是先从脑组织中分离出海马，然后使用组织切片机12和振动切片机13制备横切片（垂直于纵轴）。后来的生理学家更倾向于从完整的脑组织块中获取切片，以同时保留与海马相连的邻近脑区结构。针对这些脑块制备，已发展出多种相对于海马的不同切片角度，例如冠状切片制备法14，以及一种称为HEC切片的水平切片制备法，用于保留海马-内嗅皮层之间的连接15,16,17。
在后一种制备方法中，顶叶沿前后轴方向相对于水平面以0°或12°的角度切割，形成组织块的基底。随后从脑的腹侧表面开始收集切片，从而主要获取中间-腹侧海马区域。该方法已成为生理学研究中最常用的选择，并可依据已发表的多种实验方案可靠地实施18,19,20。
然而，如果研究兴趣涉及空间学习的特定方面，则背侧海马可能是更合适的考察区域，因此找到一种适用于该海马区域且质量相当的切片方法将具有重要意义。目前仅有少数专注于最吻端海马极的实验方案能够满足这一需求21,22。
在本实验方案中，我们描述了一种获取背侧-中间区海马的可行横切片的方法，该方法采用此前用于水平切片制备的切片角度18,19（图1A&B）。我们通过将本方法制备的切片与冠状切片在电生理记录和形态学重建方面的结果进行比较，以展示该方案的质量。本方案特别适用于与成年小鼠（本研究中为三个月龄）的解剖学和行为学实验相结合。
方案
所有涉及实验动物的操作均依照德国动物福利法进行，并已获得基尔大学伦理委员会的批准。小鼠品系：Parvalbumin-Cre（Pvalb-IRES-Cre）23 （Jackson 实验室，库藏编号 008069）以杂合子品系维持，或与 Ai9 Cre 报告小鼠杂交24 （Jackson实验室，库藏编号007909）。使用P40至P90之间的雌性和雄性小鼠。小鼠在标准群养条件下维持12小时光照-黑暗循环，并自由供应食物和水。 随意摄取.
1. 溶液的配制
注意：每次实验当天均需使用超纯水（UPW）（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）配制新鲜溶液。溶液可在 4 °C 下保存，最长不超过一天。镁和钙溶液可分别配制成 1 M 储存液单独保存。所有工作溶液必须用碳氧混合气（95% O₂:5% CO₂）饱和。2以确保使用前后达到最佳的氧合和pH维持。
- 准备切割液（每只小鼠 500 mL）（单位：mM）：92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na-抗坏血酸、4 Na-丙酮酸、0.5 CaCl2·2H2O 和 10 MgSO4·7H2O。在加入二价阳离子之前，在通风橱中用 4–5 mL 的 16% 盐酸将溶液滴定至 pH 7.4，以避免 MgSO4 沉淀。
注意：KCl 和 NaH2PO4 可配制成 10 倍浓缩液，于 4°C 保存。我们制备两批切割液：一批在记录前一天制备（储存于冰箱过夜以产生碎冰），另一批在记录当天制备。 - 准备保存液（每只小鼠 250 mL）（单位：mM）：92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、5 Na-抗坏血酸、4 Na-丙酮酸、2 CaCl2·2H2O 和 2 MgSO4·7H2O。用 1 N NaOH 将 pH 滴定至 7.3–7.4。
注意：NaCl、KCl 和 NaH2PO4 可配制成 10 倍浓缩液，于 4 °C 保存。 - 准备记录用人工脑脊液（ACSF）（单位：mM）：122 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 葡萄糖、2 CaCl2·2H2O、2 MgSO4·7H2O、2 Na-抗坏血酸、4 Na-丙酮酸。用 1 N NaOH 将 pH 滴定至 7.3–7.4。
注意：NaCl、KCl 和 NaH2PO4 可混合配制成 10 倍储存液，于 4°C 保存。
2. 切片工作台的准备
- 在冰上准备一个烧杯（150 mL）和两个玻璃培养皿（直径10 cm），并加入新鲜切割液。使用碳氧混合气鼓泡装置（连接碳氧混合气系统的带孔管或砂芯）持续对溶液进行氧合。
注意：烧杯中的溶液将用于灌流，而培养皿将在切片过程中使用。 - 在手术台上准备好不锈钢刀片、圆头镊子、细头镊子、大剪刀、小剪刀、大金属刮勺、细金属刮勺、毛刷、振动切片机载物板以及氰基丙烯酸酯胶水或毒性较低的正丁基氰基丙烯酸酯粘合剂。将不锈钢刀片和一片滤纸浸入其中一个置于冰上的玻璃培养皿中，该培养皿将用于脑组织切片。在塑料培养皿底部画出三条平行线，并将此培养皿放置在手术器械附近。
- 根据已发表的方案25准备心脏灌流装置。
- 准备振动切片机，将新刀片安装至刀片夹上，并设定切片参数（刀片相对于水平面的角度为17°，刀片振幅1.5 mm，刀片前进速度约为2 mm min-1，振荡频率90 Hz，切片厚度350 µm）。用冰冻的切割液填充振动切片机托盘，并持续保持氧合。
注意：我们将用第一批切割液制成的碎冰加入冷却的新鲜切割液中以维持低温。切片时注意避免冰接触刀片。 - 准备一个孵育 chamber，内装切割液并持续氧合，将该 chamber 置于预热的水浴中（35 °C）。
注意：孵育 chamber 的示例可参见 Edwards 和 Konnerth（1992）26。 - 准备一个切片储存 chamber，内装储存液，并在室温下持续氧合。若组织表达荧光蛋白或光敏视蛋白，建议将 chamber 置于避光环境中，例如放入盒子内。
注意：使用具有多个独立孔的储存 chamber 有助于区分海马背腹轴不同水平的切片。可自制 chamber（图1D）。取一个81孔冷冻保存管盒的隔片网格，将其底部粘贴至尼龙网上。将一个5 mL移液器塑料吸头的上三分之一部分插入该网格中心，使其底部外露约3 cm，该塑料吸头作为网格的支撑架，并用于后续连接供氧管路。将带支撑架的网格插入圆柱形塑料盒（例如注射器滤器包装盒）中，确保其不会倾斜或晃动。该储液装置可容纳250 mL储存液。
3. 海马切片的制备
- 在通风橱内使用异氟烷（约 0.5 mL）在麻醉箱中麻醉小鼠。让小鼠静置直至呼吸缓慢且规律（约 2-3 分钟）。通过夹趾测试确认无疼痛反应。
- 根据已发表的方案25,27，使用烧杯中冰浴的碳酸化切片液进行25 mL的经心脏灌注。建议此步骤可快速降低脑组织温度，从而迅速减缓神经元代谢。
- 使用大剪刀将动物断头，并将头部放入盛有切片液的冰上冷却的培养皿中。
- 用精细剪刀切开皮肤以暴露颅骨。在枕骨大孔两侧的颅底做小的侧向切口。然后从枕骨大孔开始沿矢状缝剪切，直至嗅球上方的鼻额缝。在进行矢状切口时，应将剪刀略微上抬，以避免损伤下方的脑组织。
注意：保持头部浸没在切片液中有助于清除血液并维持低温。 - 使用圆头镊子抬起顶骨以暴露脑组织。注意同时夹住并去除脑膜。若残留脑膜，可能在取出过程中损伤脑组织。
- 使用小刮勺将脑组织轻轻舀出，放入第二个培养皿中。
- 使用预冷的刀片沿大脑纵裂将脑组织切成两半。
- 使用大刮勺将一个脑半球从切片液中取出并置于塑料培养皿上。使脑半球内侧面向下放置，将顶叶皮层与其中一条平行线对齐，作为第二次切割的参考，如图1B所示。
- 将刀片平行于标记线，在脑半球腹侧部分进行第二次切割，以获得后续用于将脑组织粘附到切片标本夹上的表面，如图1B所示。将该脑半球放回玻璃培养皿中含氧切片液中，并对另一侧脑半球重复相同操作。
- 使用粘合剂将脑半球的新鲜切割腹侧面粘附到振动切片机的标本夹上。在脑半球上滴加数滴切片液以固化胶水，然后将标本夹移入振动切片机的切片槽中。这样切片将从背侧向腹侧海马方向进行。
- 移除最初的一到两片非横断切片（图1C,ii-iii），直至目标区域可见，然后开始收集切片。
注意：在切片过程初期，可从背侧海马获得虽非完全横断但可用且健康的切片（图1C,ii-iii）。每片切片的收集约需 3-4 分钟。通过从背侧而非腹侧海马开始切片，可节省约 10 分钟，从而提高背侧切片的存活率。 - 使用塑料移液器（剪去吸头狭窄端）将每一片切片转移至孵育室（含 35 °C 切片液）中，静置 12 分钟。如 Ting 等（2014）28 所报道，短暂的温热切片液恢复期可显著减少神经元的初始肿胀。随后使用毛刷将切片转移至储存室（含室温储存液），静置直至实验开始。
4. 全细胞记录与生物胞素填充
注意：此处对全细胞膜片钳记录的描述仅简化为有助于获得良好生物胞素填充的关键步骤，通常适用于人工脑脊液（ACSF）中的神经元。有关电生理记录操作的详细信息，可参考其他多个实验方案29,30。
- 根据待记录的参数选择合适的细胞内液。例如，进行电流钳记录时，可使用基于葡萄糖酸钾的溶液（单位为 mM）：135 葡萄糖酸钾、3 KCl、10 HEPES、0.2 EGTA、10 磷酸肌酸-Na2、4 MgATP、0.3 Na2-GTP。用 1 M KOH 将 pH 值调节至 7.3。加入 3–5 mg/mL 生物胞素后，渗透压应约为 285–290 mOsmol/kg。
注意：为在记录期间监测神经元形态，可在细胞内液中添加 0.3–0.5 µL/mL 的 1 mM Alexa Fluor 肼。若使用生物胞素显影，请注意 Alexa 荧光染料的颜色应与链霉亲和素偶联的荧光探针相匹配。 - 使用厚壁硼硅酸盐毛细管制备尖端直径 ≤1 µm、电阻为 3–5 MΩ 的膜片钳电极。
- 启动膜片钳装置的灌流系统，流速设为 2.5–3 mL/min，温度为室温或 35–37 °C，并用 U 形锚固定脑片于记录槽中。
- 确定目标脑区，并选择一个健康的神经元，其胞体应位于脑片表面下至少 30–50 µm 处。
注意：健康神经元的胞体表面光滑，膜边界略有对比度；而不健康神经元的胞体则表现为皱缩且高对比度，或肿胀且半透明。 - 将细胞内液吸入玻璃微电极，直至覆盖 AgCl 电极尖端。将微电极移入记录槽的溶液中，并施加轻微正压以保持玻璃电极尖端通畅。
注意：若溶液中含有 Alexa 荧光染料，可通过观察从尖端释放的荧光液量来视觉控制压力。施加最小压力可避免细胞周围组织被染色。 - 以倾斜角度接近细胞，并在形成吉欧封接（giga-seal）时，接触胞体表面的前三分之一区域。释放正压，缓慢将保持电位调至 -65 mV，并通过口吸施加轻柔负压以促进吉欧封接的形成。
- 为建立全细胞记录模式，施加强而短暂的负压以破裂膜。若神经元膜电位去极化超过 -50 mV，或保持电流持续增加超过 100 pA，或接入电阻上升超过 30 MΩ，应舍弃该记录。
- 记录结束后（建议至少持续 15 分钟以充分填充胞体和树突；若需标记复杂轴突，可能需要长达一小时31），小心移除电极。具体操作为：将保持电位设为 0 mV，并缓慢沿与进针相反的方向回撤电极，尝试重新形成吉欧封接，从而获得外向-out（outside-out）膜片构型。
注意：细胞内液中含有的 Alexa 荧光染料有助于在视觉引导下将电极从神经元表面移开。若细胞核未与电极尖端接触，可快速将电极以对角线方向高速向上拉出组织以重新封接。若细胞核或部分膜结构仍位于电极尖端内，则存在破裂质膜的风险。此时，可施加轻微正压并进行横向移动以辅助操作。 - 记录细胞位置及脑片方向。固定后，可在荧光显微镜下检查脑片的精确方位以及标记细胞的完整性。
5. 免疫染色、图像采集与形态学重建
- 记录完成后，将脑片转移至24孔板中，用含4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）进行固定。根据所用一抗的敏感性，在室温下孵育60分钟，或在4 °C下过夜。脑片可保存在含0.02% NaN3的0.1 M PBS中。
注意：PFA具有毒性，请在通风橱中操作。 - 记录后一周内，按照既定方案进行免疫染色和生物素标记显影32,33。
备注：我们采用的方法无需对脑片重新切片，以保持树突和轴突结构的完整性。然而，该方法需要更长的孵育时间，因为抗体需充分渗透入组织。建议在正式实验前，先测试抗体在组织中的最佳渗透时间。 - 使用具备Z轴层扫和拼图扫描功能的共聚焦显微镜采集图像。
- 使用Fiji ImageJ34进行形态学重建。
备注：通过Bio-format插件，该程序可导入多种图像文件格式。我们推荐使用Simple Neurite Tracer（STN）插件35进行树突和轴突的重建。相关简明教程可访问https://imagej.net/SNT 和 http://snyderlab.com/2016/05/25/tracing-neurons-using-fiji-imagej/。 若追踪数据文件（.traces）以未压缩格式保存，可转换为文本文件，并使用Matlab或其他文本数据处理软件打开。
结果
本方案中，我们描述了如何制备海马背侧-中间部的急性脑片（图1A）。该方案特别适用于研究空间学习相关机制的实验，可与行为学实验、病毒标记或背侧海马的病毒操控策略相结合35。将本方案所述切片程序应用于在不同前囟坐标（AP -1.94 mm，ML ± 0.5–2 mm，深度 -1.25–2.25 mm）向Pvalb-IRES-Cre小鼠背侧海马注射Cre依赖性表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒（AAV-FLEX-GFP）的动物，我们成功获得了至少三张包含感染区域的横断面脑片（图1A，海马三维模型中的浅绿色染色区域）36。此外，还可从背侧海马更靠前侧的区域获得多张非横断但状态良好的脑片（图1C）。
为了验证所制备脑片的质量与活性，我们记录了Pvalb-IRES-Cre;Ai9转基因小鼠（7-12周龄）齿状回中颗粒细胞以及tdTomato标记的钙结合蛋白阳性（PV+）中间神经元的基本电生理和形态学参数，并将这些数据与采用标准方案获得的同一脑区冠状切片的记录结果进行了比较。
在红外微分干涉差（IR-DIC）显微镜下进行肉眼观察时，我们已注意到横切面与冠状切面之间存在明显差异。冠状切片中主细胞层的神经元通常显得粗糙，轮廓对比强烈，而横切片中的神经元大多表面平滑，边界对比轻微，提示细胞活力更佳（图2A）。冠状切片与横切片之间细胞存活率差异的原因可能在于切片平面相对于纤维束的取向不同。由于在冠状切片中纤维束并非平行排列，轴突和树突更易被切断。与此假设一致，我们发现颗粒细胞层和门区在冠状切片中的表面平面连续性明显低于横切片（表面平面步长：41.40 ± 3.28 µm 对比 25.60 ± 2.94 µm，均值 ± 标准误，非配对t检验 P = 0.023），表明冠状切片中组织连接性受损程度更大（图2B）。这意味着在冠状切片中，适合进行膜片钳记录的细胞仅存在于颗粒细胞层更深的层面，从而可能降低膜片钳记录的通量。事实上，我们在横切片中形成封接的平均时间比冠状切片更短（颗粒细胞：冠状切片中为12.64 ± 1.50 s，n=11，对比横切片中为8.40 ± 0.75 s，n=14，均值 ± 标准误，P = 0.0335，Mann-Whitney检验；PV+中间神经元：冠状切片中为31.11 ± 2.60 s，n=9，对比横切片中为22.00 ± 2.18 s，n=7，均值 ± 标准误，P = 0.0283，Mann-Whitney检验）（图2C）。为进一步评估细胞完整性和健康状态，我们记录了颗粒细胞和PV+中间神经元的静息膜电位（RMP），结果显示在冠状切片中，两类细胞的静息膜电位均显著去极化（颗粒细胞：冠状切片中为-62.55 ± 3.54 mV，n=11，对比横切片中为-71.06 ± 2.31 mV，n=14，均值 ± 标准误，P = 0.0455，Mann-Whitney检验；PV+中间神经元：冠状切片中为-52.75 ± 1.66 mV，n=7，对比横切片中为-59.36 ± 2.25 mV，n=6，均值 ± 标准误，P = 0.0271，Mann-Whitney检验）（图2D）。这些数据表明，横切片制备中健康神经元的数量高于冠状切片。事实上，设定可接受静息膜电位的截断值（颗粒细胞为-55 mV，PV+中间神经元为-45 mV）后，冠状切片中被排除的细胞比例显著高于横切片（39.67 ± 8.37 %，n=3个实验批次，对比23.00 ± 3.85 %，n=4个实验批次）（图2E）。此外，对记录的颗粒细胞进行形态学重建表明，正如预期，横切片中更有可能完整获取颗粒细胞的轴突分支结构（图3A、B）。同时，在横切片中对PV+中间神经元进行形态学重建，能够清晰展示广泛的轴突和树突分支，包括树突棘等细微结构的可视化（35）（图3C）。
图1：获取背侧-中间区海马体切片的切片操作示意图。（A）海马结构的三维示意图，显示其在脑内的空间方位（改编自Allen研究所的Brain Explorer）37。根据Dong等（2009）7的划分，标示出海马体的背侧、中间和腹侧区域（dHPC、iHPC、vHPC）。将被切片的背侧-中间区海马体部分以浅绿色标出。右上角插图显示参考坐标轴的方位。（B）大脑半球示意图，展示顶叶皮层与培养皿上平行线的对齐方式。红色虚线表示进行修整切割的位置（方案中第3.9步），以形成将半脑固定于样品托上的粘贴面。黑色虚线表示切片采集的位置。（C）按照本方案获得的海马体切片的明场图像序列。从软脑膜表面起，由背侧至腹侧依次为：（i）0.70 mm，（ii）1.05 mm，（iii）1.40 mm，（iv）1.75 mm，（v）2.10 mm，（vi）2.45 mm，（vii）2.80 mm，（viii）3.15 mm。比例尺 = 1 mm。（D）储存室及其组装所需材料的照片。1. 81孔冷冻小瓶储存盒中的小瓶间隔网格，2. 圆柱形塑料盒，3. 尼龙网，4. 移液器吸头。插图：用于插入圆柱形盒中的网格及管架的侧视图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：与冠状切片相比，横切切片显示出更高的切片存活性。（A）差分干涉-红外微图像显示横切和冠状切片中神经元胞体的健康（黑色箭头）与不健康（白色箭头）示例。Hil = 海马门区，gcl = 颗粒细胞层，ml = 分子层。比例尺 = 50 µm。（B）两种切片方法均在颗粒细胞层表面与海马门区之间产生台阶（由箭头指示）。台阶高度反映了组织断裂的程度，在横切切片中显著低于冠状切片（n = 5 个横切切片，n = 5 个冠状切片，均值±标准误，P = 0.0238，Mann-Whitney 检验）。（C）颗粒细胞中吉欧姆封接形成的时间（横切切片中 n = 14 个细胞，冠状切片中 n = 11 个细胞，均值±标准误，P = 0.0355，Mann-Whitney 检验）以及 PV+ 中间神经元（INs）的封接时间（横切切片中 n = 7 个细胞，冠状切片中 n = 9 个细胞，均值±标准误，P = 0.0283，Mann-Whitney 检验）。（D）记录细胞的静息膜电位（RMP）（分别为 n = 14 和 n = 11 个颗粒细胞，均值±标准误，P = 0.0455，Mann-Whitney 检验；n = 7 个 PV+ INs 和 n = 10 个 PV+ INs，P = 0.0271，Mann-Whitney 检验）。（E）单次实验过程中废弃细胞的比例（n = 3 次冠状切片实验，n = 4 次横切切片实验，均值±标准误）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：横切片中颗粒细胞和中间神经元的形态学保存。 共聚焦图像显示Pvalb-IRES-Cre;Ai9转基因小鼠横切片（A）和冠状切片（B）中生物胞素标记的颗粒细胞。相应的轴突以灰色和浅灰色重建。注意不同制备样本之间轴突长度和复杂性的差异。比例尺=100 µm。（C1）共聚焦图像显示一个生物胞素标记且tdTomato阳性的中间神经元。Hil=门区，gcl=颗粒细胞层，ml=分子层。比例尺=50 µm。（C2）C1图中方框区域的放大图像，显示树突棘。比例尺=2 µm。（D）C1图中生物胞素标记的中间神经元的轴突和树突形态学重建（轴突为灰色，胞体和树突为黑色）。（E）C1图中细胞胞体的局部放大，显示生物胞素与小清蛋白免疫反应性（PVir）的共定位。比例尺=20 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
背侧海马体因其在空间学习和导航中的作用而被广泛研究，主要通过行为实验、解剖示踪以及区域特异性操控等方法。为了将脑片电生理研究与这些技术相结合，我们建立了一种实验方案：该方案采用与改良水平切片法类似的切片角度用于海马的中间-腹侧区域，但使用倒置的切片顺序，以优先获取背侧-中间区域的早期切片。这种方法缩短了切取和收集海马背侧区域所需的时间，从而提高了脑片的存活率。
使用该方法，我们能够常规地从背侧海马区获取约三个脑片，每片位于半球的软脑膜表面下1.4 mm至2.4 mm之间，如图所示 图1C尽管使用该方法无法从海马的隔极最前端获取横切片，但可以从每侧半球的隔极获得约两个额外的、具有活性的非横切片。图1C ii,iii）。如果研究重点是海马的隔极，其他允许获取横断面切片（尤其是来自海马最隔极区域）的实验方案可能更为合适21,32行为学实验中关于空间导航与学习的研究最好在神经元连接已完全发育的成年小鼠中进行。因此，我们优化了适用于成年动物脑组织切片的实验流程（本实验以三个月大的小鼠为例），因为成年小鼠脑组织相较于幼年小鼠更易受到应激损伤。为此，我们结合了多种策略，以减少脑组织从取出至切片被置于含氧人工脑脊液（ACSF）期间所经历的缺氧应激。所使用的保护性切割溶液为基于NMDG的ACSF。25,27,28 低 Na+ 和 Ca2+ 但高浓度 Mg2+ 通过抑制NMDA受体激活所导致的兴奋性毒性损伤和细胞肿胀。此外，HEPES提供稳定的缓冲作用，而抗坏血酸和丙酮酸等化合物可减轻氧化应激。经心脏灌注冰冷且充氧的保护性切片溶液，利用脑组织中极为密集的毛细血管网络，快速且均匀地降低脑组织的代谢需求以及谷氨酸诱导的兴奋性毒性。随后，除断头外几乎所有操作步骤均在冷却并充氧的溶液中进行，以在整个实验过程中将代谢活动和缺氧程度降至最低。其他用于减少切片过程中脑组织损伤的策略也存在，并可能同样有效38为了展示我们制备的质量，我们将其与常用于记录背侧海马的冠状切片制备进行比较。尽管冠状切片可用于在齿状回中获得良好的膜片钳记录，但其中不健康和断开连接的神经元数量较横切切片更多。此外，横切切片中轴突和树突分支的完整性保存得更好。事实上，颗粒细胞轴突的完整性（图3A），该方向与海马体的长轴垂直，可作为横切面切割平面的指示标志1.
对于 patched 神经元的填充，我们建议电极电阻在 3 至 5 MΩ 之间。尖端直径约为 1 µm 可在记录过程中实现良好的封接电阻，并在撤回电极时实现良好的再封闭。最关键的细节是避免将胞体或细胞核的部分吸入移液管内。因此，我们建议在可能的情况下，在细胞内溶液中加入 Alexa 荧光染料。该染料可在记录和再封闭过程中监测细胞形态。此外，它还可在固定后评估 patched 细胞的完整性，从而在填充失败的情况下节省免疫组织化学所需的时间。由于 Alexa 染料在长时间固定后会发生淬灭，我们建议尽可能缩短固定时间。
对于后续的免疫染色，我们采用一种无需重新切片的方案。建议在固定后一周内完成染色。切片在冰箱中存放时间越长，组织降解的可能性越高。如果无法避免长期储存，建议将PBS中的NaN3浓度提高至0.05%，并每周更换一次。对整个切片进行免疫染色意味着一抗和二抗孵育时间需要延长。通常，显示生物胞素（biocytin）只需在4 °C下过夜孵育即可，但如果同时进行其他蛋白的染色，整个染色过程可能需要更长时间。通透化-封闭及抗体孵育步骤需根据具体情况单独优化。通常情况下，一抗孵育两天已足够，而二抗一天通常即可完成。我们建议随着抗体 孵育时间的延长，相应增加洗涤步骤的持续时间，以避免背景信号增强。
在本实验方案中，我们介绍了一种切片方法，可用于获取横断或近似横断方向的海马脑片，同时保持成年组织神经元的存活能力，并提供了一种实用的方法来恢复已记录神经元的形态学特征及其神经化学特性。该方法易于实施，可将电生理学结果与针对海马中间-背侧区域的解剖学和行为学研究有效结合。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Kerstin Kronenbitter和Didier Gremelle提供的技术协助。感谢Umberto Morelli在图形软件方面的帮助，以及Mathias Hoppe在视频拍摄和剪辑方面的协助。本实验室的工作得到了德国研究基金会（DFG）FOR2143、SFB 1461（项目编号434434223）和GRK2154项目、英国医学研究理事会资助G1100546/2以及基尔大学的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 Omnifix-F | Braun melsungen AG | 9161406V | |
| 24孔多孔板 | SARSTEDT | 8,33,922 | |
| 81x 冻存管储存盒 | Fisher Scientific | 15-350-107B | 储存室 |
| Alexa 肼染料 | Invitrogen | A10436 | |
| 大剪刀 | 精细科学工具 | 14010-15 | 格雷夫镊子 |
| 生物胞素 | IRIS biotech | LS3510.0250 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 科学产品 | GB150TF-10 | 储存室 |
| 刷子 5 | Leonhardy | 241 | 微型双头刮勺，长150 mm，刀片宽4 mm |
| 二水合氯化钙 | Roth | 5239.2 | aCSF 溶液 |
| 碳素钢切片刀片 | 羽毛 | C35 | |
| 盐酸 | Roth | K025.1 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM880 | 使用 Airyscan |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | UHU | 509141 | |
| 氰基丙烯酸酯胶水，正丁基酯 VetBond | 3M | ||
| EGTA | Roth | 3054.1 | |
| Fiji ImageJ | fiji.sc | ||
| 滤纸 113A | ROTILABO Roth | AP180.1 | |
| 精细尖头镊子 | 杜蒙特 | 0245fo | |
| 玻璃烧杯（150 ml） | ROTILABO Roth | X690.1 | 孵育室与解剖 |
| 玻璃培养皿（直径10 cm） | ROTILABO Roth | 0690.1 | |
| 葡萄糖 | Roth | X997.2 | aCSF 溶液 |
| 加热的水浴锅 | Grant Instruments Ltd | SUB14 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | aCSF 溶液 |
| 异氟烷 | 巴克斯特 | 5239.2 | 麻醉剂 |
| 大型刮勺 | Roth | E286.1 | |
| 七水合硫酸镁 | Roth | 8793.2 | aCSF 溶液 |
| Mg-ATP | Sigma Aldrich | A9187 | |
| Microfil | 世界精密仪器 | MF34G | |
| Na2-GTP | Sigma Aldrich | 51120 | |
| N-甲基-D-葡糖胺 | Sigma Aldrich | M2004 | aCSF 溶液 |
| 正常山羊血清 | Sigma Aldrich | 566380 | |
| 尼龙网筛套装 | Warner Instruments | 64-0198 | 孵育室和储存室 |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| 10倍磷酸盐缓冲液 | Panbiotech | P04-53500 | |
| 磷酸肌酸二钠 | Sigma Aldrich | P7936 | |
| 拉管仪 | Sutter 仪器 | P-2000 | |
| 移液器吸头 | SARSTEDT | 7,07,62,211 | 孵育室 |
| 注射器滤器用塑料盒 | SUPELCO | 54135-U | 储存室 |
| 氯化钾 | Roth | 6781.3 | aCSF 溶液 |
| 葡萄糖酸钾 | Roth | P1847 | |
| Probenbecker becker（100 ml） | ROTILABO Roth | HT85.1 | 孵育室 |
| 圆头镊子 | 精细科学工具 | 11051-10 | |
| 不锈钢刀片 | 吉列 | 振动切片机 | |
| 小剪刀 | 精细科学工具 | 14010-10 | 直型梅奥剪刀 |
| 抗坏血酸钠 | Roth | 3149.2 | aCSF 溶液 |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | S2002 | |
| 碳酸氢钠 | Roth | 6885.1 | aCSF 溶液 |
| 氯化钠 | Roth | 3957.1 | aCSF 溶液 |
| 氢氧化钠 | Roth | K021.1 | |
| 磷酸二氢钠二水合物 | Roth | K300.1 | aCSF 溶液 |
| 丙酮酸钠 | Roth | 8793.2 | aCSF 溶液 |
| 链霉亲和素偶联 Alexa 488 | Invitogen | s11223 | |
| 薄刮刀 | Roth | E286.1 | 双头刮刀，长150 mm，刀片宽度9 mm |
| 移液管 | Sarstedt | 861171 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.1 | |
| 振动切片机 | 赛默飞世尔科技 | Microm HM650V | |
| 超纯水过滤装置 | 默克-密理博 | Milli-Q IQ 7000 |
参考文献
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