本文介绍了斑马鱼后部体轴的三维组织培养方案，可实现对脊椎动物体节形成的活体研究。该外植体模型能够控制体轴伸长、调控形态发生素来源，并实现组织水平上具有亚细胞分辨率的活体成像。
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摘要
摘要
脊椎动物胚胎通过形成重复的体节来构建其主要体轴，这些体节是脊椎、肌肉和皮肤的前体。随着胚胎尾部向后延伸，体节从原肠胚中胚层（PSM）中逐步分节产生。体节以规律的周期形成，并在大小上具有可缩放性。斑马鱼是一种常用的模式生物，因其遗传操作便利且胚胎透明，适合活体成像。然而，在体节形成过程中，鱼胚胎被包裹在一个大而圆的卵黄周围。这种几何结构限制了对斑马鱼胚胎PSM组织的活体成像，尤其是在需要物镜近距离工作的高分辨率成像时。本文介绍了一种用于斑马鱼尾部外植体活体成像的扁平化三维组织培养方法。尾部外植体能够模拟完整胚胎的特征，表现出体轴伸长速度按比例减慢以及头尾方向体节长度缩短的现象。我们还能通过外植体培养进一步减缓体轴伸长速度。这首次使我们能够将信号梯度的化学输入与体轴伸长的机械输入区分开来。在未来的研究中，该方法可与微流控装置结合，实现时间可控的药物干预或脊椎动物体节形成的筛选，且无需担心药物渗透问题。
引言
生物体的体节化分段在自然界中广泛存在。重复的结构对于身体构型中侧生器官的功能至关重要，例如脊椎、肌肉、神经、血管、肢体或叶片1。由于轴向对称性带来的生理和几何约束，大多数两侧对称动物门类（如环节动物、节肢动物和脊索动物）在胚胎组织（如外胚层、中胚层）中均表现出沿前后轴的分节现象。
脊椎动物胚胎沿主身体轴线依次将轴旁中胚层分节为体节，不同物种具有特定的分节间隔、数量和大小分布。尽管同一物种内各个胚胎之间的体节分节具有高度稳健性，但不同脊椎动物物种之间的分节模式却表现出显著多样性。体节分节发生在极为广泛的时间尺度范围内（从斑马鱼的25分钟到人类的5小时），体节尺寸（从斑马鱼尾部体节的约20 µm到小鼠躯干部体节的约200 µm）和数量（从斑马鱼的32个体节到玉米蛇的约300个体节）也存在巨大差异2。更引人注目的是，鱼类胚胎可在较宽的温度范围内发育（例如斑马鱼可在约20.5 °C至34 °C之间），并通过调节分节间隔和轴向伸长速度来维持体节结构的完整性及适当的大小分布。除了这些有趣的生物学特性外，斑马鱼还因其大量同胞胚胎具有体外发育、同步发育和透明发育的特点，以及丰富的遗传操作工具，成为研究脊椎动物体节分节的有用模式生物。然而从显微成像的角度来看，硬骨鱼类胚胎在体积较大的球形卵黄上发育，导致原肠胚组织围绕卵黄拉伸并弯曲（图1A）。本文中，我们介绍一种用于斑马鱼尾部的扁平化三维组织外植培养方法。该外植体系克服了卵黄体积带来的球面限制，从而实现对鱼类胚胎体节模式形成的高分辨率活体成像。
图1：斑马鱼胚胎的载玻片腔体外植系统。（A）斑马鱼胚胎具有适用于活体成像的优点，例如原肠胚形成期组织（蓝色）的透明性，但该组织围绕一个体积较大的球形卵黄团块（黄色）发育，这会阻碍对完整胚胎进行高分辨率的近物镜成像。可从体节前部组织（红色）开始，使用显微外科刀（棕色）进行切割，并沿卵黄后缘继续切割，从而分离尾部外植体。（B）分离后的尾部外植体可背腹面朝下放置于盖玻片（浅蓝色）上，使神经组织（浅灰色）朝上，脊索（深灰色）朝下。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
本方案涉及使用受精后1天以内的活体脊椎动物胚胎。所有动物实验均遵循辛辛那提儿童医院医疗中心的伦理准则；动物实验方案已通过机构动物护理和使用委员会审查并批准（方案编号 # 2017-0048）。
1. 胚胎收集
- 在收集胚胎的前一天晚上，将斑马鱼配对放入交配用培养皿中。为了精确控制胚胎发育的时期，应在交配对之间设置隔离屏障。
- 在预期产卵时间之前升起屏障，并在15分钟内将卵收集至直径100 mm的培养皿中。
- 清除培养皿中的碎片。若从单次产卵中收集到超过50个胚胎，应将胚胎按数量分装至多个培养皿中。
- 将胚胎置于鱼系统水中，在28 °C条件下孵育，直至其发育至50%上胚层形成期（受精后5小时）。在步骤3.2之前，也可使用标准化的胚胎培养基（如E3培养基）替代水族系统水。
- 在体视显微镜下移除未受精的卵，并将胚胎转移至23.5 °C的培养箱中过夜（O/N）。收集后的次日早晨，胚胎应发育至8–10体节阶段。
2. 工具准备
- 将显微手术刀片、针尖（用于组织解剖）和玻璃巴斯德移液管浸泡于100%乙醇（EtOH）中并进行火焰灭菌，以实现消毒。
- 在25 mm × 75 mm的显微镜载玻片上贴两层透明胶带（厚度约100–120 µm）。使用手术刀在每张载玻片胶带覆盖层的中央切割出约18 mm × 18 mm的方形孔。
- 用70%乙醇擦拭已准备好的载玻片腔室。这些孔每孔可容纳约40 µL培养基。
3. 样品制备
- 在体视显微镜下，使用两支注射器针头的尖端去除胚胎的卵膜。将胚胎转移至另一个含有鱼系统水的培养皿中进行冲洗。
- 使用经火焰抛光的无菌玻璃巴斯德吸管，将胚胎转移至一个直径为6 cm、含有解剖培养基（Leibovitz-15细胞培养基，含L-谷氨酰胺但不含酚红，0.8 mM CaCl2 和1×抗生素-抗真菌溶液）的培养皿中。
注意：此后所有转移操作均应继续使用无菌玻璃吸管。- 使用玻璃培养皿进行外植体操作，以避免在解剖过程中产生聚苯乙烯碎屑。
- 在载玻片腔室中加入50 µL组织生长培养基（解剖培养基加10%胎牛血清）。
- 在体视显微镜下，用针尖固定胚胎，位置位于后脑附近的卵黄-组织交界处，以便进行解剖。
- 用针固定胚胎组织的同时，将显微手术刀片以45°角切入，在后脑前方切断组织，并从头部开始向尾芽方向剥离卵黄（图1A）。
注意：清理卵黄时需小心，避免丢失皮肤组织。皮肤组织在解剖过程中会作为围绕胚胎的一层弹性单层组织容易剥离，因此较易识别。 - 当卵黄完全从胚胎体上移除后，从尾芽处切除外侧的皮肤组织。保留最后形成的3-4个体节完整，切除更靠前的组织（全轴外植体）。
- 此操作应使卵黄基本完整脱离。若卵黄破裂，可能会有大量卵黄颗粒附着在组织腹侧表面。此时可用睫毛工具轻轻清除残留的卵黄颗粒。
注意：若外植体两侧皮肤组织不平衡，将导致组织无法保持直线生长方向，而是向皮肤拉伸较多的一侧弯曲。可在体视显微镜下借助显微手术刀刺破皮肤层来校正这种不平衡。 - 对于去皮肤外植体，可用针尖按压皮肤层边缘，再用显微手术刀将组织外植体剥离。此类外植体在培养中不会发生体轴伸长。
- 除全轴外植体外，此步骤还可制备其他类型的外植体。例如，使用显微手术刀切取已分节的体节（全PSM外植体），或将原始体节中胚层（PSM）沿前后轴切成两半（半PSM外植体）。有关此类替代外植体的应用，请参见第5.1节。
- 此操作应使卵黄基本完整脱离。若卵黄破裂，可能会有大量卵黄颗粒附着在组织腹侧表面。此时可用睫毛工具轻轻清除残留的卵黄颗粒。
- 立即将解剖好的外植体转移至用于成像的22 mm × 22 mm盖玻片上。
- 将外植体沿背腹轴展平，腹面接触盖玻片（图1B）。使用20 µL带滤芯吸头的移液器轻轻吸除组织周围多余的培养基。
注意：若延迟将解剖后的外植体转移至盖玻片，由于脱离了卵黄的几何约束，组织可能发生形变。
- 将外植体沿背腹轴展平，腹面接触盖玻片（图1B）。使用20 µL带滤芯吸头的移液器轻轻吸除组织周围多余的培养基。
- 迅速而小心地将带有外植体的盖玻片翻转，覆盖在已加满生长培养基的载玻片腔室上。
- 为防止气泡产生，先将方形盖玻片的一边接触胶带腔室，再缓慢释放另一边。此步骤中注意不要移动或变形外植体。
- 通过将载玻片腔室轻压在实验室擦拭纸上，吸除从腔室渗出的多余培养基。由于液体培养基的表面张力作用，盖玻片可在无需密封的情况下稳定地固定在载玻片腔室上，适用于活体成像。
- 对于长期培养（>6小时），应使用更大的腔室。此时可采用22 mm × 50 mm的矩形盖玻片，并在载玻片上设置两条平行的胶带层。两条胶带之间可留出约1 mm的间隙，以利于空气进入生长培养基。
- 重复步骤3.3–3.8以制备更多外植体。制备好的外植体在25 °C条件下，将以平均约30 µm/h的速度伸长其前后体轴，并以约40分钟的间隔进行体节分割（图2A，视频1）。
- 对于不伸长的外植体，可在步骤3.8.2中对承载样品的载玻片两侧施加轻微压力，同时在实验室擦拭纸上吸除多余培养基。或者，也可将外植体培养于单层胶带的载玻片腔室中。此外，在载玻片腔室表面用I型胶原进行化学活化，也可获得不伸长的外植体（图2B，视频2）。
- 提前进行I型胶原包被：在室温下，用15–20 mL预稀释的胶原溶液完全覆盖载玻片腔室，孵育1小时。该操作应在层流罩内进行以维持无菌条件。最后用解剖培养基小心冲洗腔室。
- 对于超过15个体节阶段的胚胎，应将尾部外植体组织侧向安装，而非平放（背腹方向）安装（视频3）。为防止肌肉抽搐，可在培养基中加入0.004%的三卡因溶液作为麻醉剂3。
- 对于不伸长的外植体，可在步骤3.8.2中对承载样品的载玻片两侧施加轻微压力，同时在实验室擦拭纸上吸除多余培养基。或者，也可将外植体培养于单层胶带的载玻片腔室中。此外，在载玻片腔室表面用I型胶原进行化学活化，也可获得不伸长的外植体（图2B，视频2）。
4. 活体成像采集
- 可在解剖镜下对体节分节的大小和周期进行宽场透射光成像，或利用转基因报告鱼系结合结构光照明显微镜、共聚焦显微镜或光片显微镜对样品进行成像。
- 将组织外植体在成像室温下平衡至少15分钟。
- 如需更精确的温度控制，可在倒置显微镜上安装商用温度控制系统。
- 根据所关注的生物学过程，将图像采集的时间帧间隔设置为2–10分钟。
注意：斑马鱼体节分节是一个快速过程，在完整胚胎中，于30 °C至21.5 °C的可存活温度范围内，其周期约为20–55分钟。外植体的伸长与分节速度比完整胚胎慢约30%。- 请注意在各通道采集之间留出足够的延迟时间，以避免对活体组织造成光毒性。激发光束照射组织的时间不应超过总成像时长的一半，并应尽可能降低光束强度。
注意：活性氧（ROS）的积累通常是活体样本中光毒性的主要原因4。可在培养基中添加4 mM浓度的抗坏血酸作为ROS清除剂，以缓冲ROS活性并减轻光毒性。在活体成像过程中，光毒性的不良影响可能难以察觉。在这方面，尾部外植体具有优势，因为某些光毒性的视觉标志（如有丝分裂阻滞、组织发育受阻（即体节形成、尾部伸长）以及组织解体）更容易被观察到。有关详细讨论，请参阅所提供的参考文献4。
- 请注意在各通道采集之间留出足够的延迟时间，以避免对活体组织造成光毒性。激发光束照射组织的时间不应超过总成像时长的一半，并应尽可能降低光束强度。
- 使用单细胞期注射RNA的胚胎，以获取可用于细胞分辨率水平分割与分析的4D图像。
- 注射时使用体外转录的膜蛋白和核荧光报告标记质粒，例如pCS-membrane-ceruleanFP（Addgene质粒#53749）或pCS-memb-mCherry（Addgene质粒#53750），并联合使用pCS2+ H2B-mTagBFP2（Addgene质粒#99267）或pCS2+ H2B-TagRFP-T（Addgene质粒#99271），每胚注射300 pg RNA。有关包含细胞膜和细胞核标记的示例影片，请参见视频4。
注意：体节前体组织（PSM）的平均细胞直径约为5 µm，其中细胞核直径约为3–4 µm。为实现准确的细胞分割，应记录约0.5 µm的像素尺寸和约1 µm的z轴切片间距。
- 注射时使用体外转录的膜蛋白和核荧光报告标记质粒，例如pCS-membrane-ceruleanFP（Addgene质粒#53749）或pCS-memb-mCherry（Addgene质粒#53750），并联合使用pCS2+ H2B-mTagBFP2（Addgene质粒#99267）或pCS2+ H2B-TagRFP-T（Addgene质粒#99271），每胚注射300 pg RNA。有关包含细胞膜和细胞核标记的示例影片，请参见视频4。
5. 尾部外植体的免疫染色
注意：在不同解剖条件下培养的组织（如伸长型、非伸长型、尾芽被解剖、半体节前体区等），作为平铺的尾部外植体5，可从载玻片腔室中回收，用于对目标蛋白进行进一步的免疫染色定量分析。本文介绍了用于外植体中双磷酸化细胞外信号调节激酶（ppERK）染色的实验方案，以检测成纤维细胞生长因子（FGF）信号梯度。
- 体节形成后至目标发育阶段，需谨慎地将盖玻片沿滑室表面平移至其一角，过程中不得抬起盖玻片。
- 借助约100 µ用玻璃巴斯德吸管吸取适量补充解剖培养基，从载玻片上回收外植组织，并转移至64孔细胞培养板中。
注意：从这一步开始，所有溶液更换均可在解剖显微镜下进行，并使用单独的玻璃移液管处理固定样品。这将确保外植组织不会丢失在孔中，或在转移过程中发生遗漏。 - 转移完所有外植体后，逐一吸去各孔中多余的培养基，并加入100 µPBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）各 1 L 加入每个孔中。
警告： PFA 是一种具有致癌作用的有毒溶液。操作时应使用适当的个人防护装备。 - 将外植体置于64孔板中，在摇床中室温固定1小时。
- 组织外植体比完整胚胎更易受形变影响。应相应调整摇床速度。
- 用150洗去固定剂 µPBS-Tw（含0.1% Tween20的PBS）洗涤三次，收集第一次洗涤液于特定容器中 "PFA 废液" 容器
- 将外植体置于4×5 分钟更换一次，每次更换约 40 µ每次用100%甲醇（MeOH）冲洗溶液。
注意： 甲醇是一种具有挥发性和可燃性的有毒化学品。操作时应在通风良好的环境中进行，并使用适当的个人防护装备。 - 作为脱水的最后一步，将孔板中的所有溶液移除，并替换为100 µL 的甲醇中。在 -20 ℃ 下孵育 °C，15 分钟。
注意：使用一种特定的 "甲醇废液" 容器用于收集溶液，直至步骤 5.11。 - 加入50 µL 的甲醇，室温下振荡 5 分钟。
- 将外植体在 4 中重新水化×5 分钟更换一次，每次更换约 40 µ每次用 PBS-T（含 0.1% Triton-X 100 的 PBS）冲洗溶液 L。使用特异性 "甲醇废液" 用于收集溶液的容器。
- 作为复水的最后一步，将孔中的所有溶液移除，并替换为 100 µL 的 PBS-T
- 对于组织通透化，将外植体置于含1.5% Triton-X 100的PBS中，在摇床上室温孵育20分钟。
- 用 MAB-D-T（含 0.1% Triton-X 100 去垢剂和 1% 二甲基亚砜（DMSO）的 150 mM NaCl、100 mM 马来酸缓冲液，pH 7.5）清洗样品 3 次×5 分钟
警告： DMSO 具有易燃性，且为有毒诱变剂。操作时应使用适当的个人防护装备。 - 将外植体在 100 µ每孔加入 L/well 血清封闭液（含 2% 胎牛血清的 MAB-D-T），室温孵育 2 小时。
- 用 50–100 替换所有封闭液 µ每孔加入一抗溶液（血清封闭液中按1:1000稀释的抗ppERK单克隆小鼠抗体）。样品于4℃孵育过夜（O/N）。>16 小时）置于 4 ℃ °C 在摇床上。
- 用 MAB-D-T 洗涤一抗溶液 5 次×5 分钟
- 在4℃下用二抗溶液（MAB-D-T中含Alexa Fluor 597标记的山羊抗小鼠IgG2b（1:200）和Hoechst 33342（1:5000））避光孵育样品过夜 °C 在摇床上孵育或室温孵育3小时。
注意：从这一步开始，用铝箔覆盖64孔板，以避免经二抗处理的样本暴露于光照下。
警告： Hoechst 33342 是一种潜在致癌物。操作时应使用适当的个人防护装备。 - 用 PBS-Tw 洗涤二抗溶液 3 次×5 分钟
- 用 PFA 在室温下固定样品 15 分钟。
- 用 PBS-Tw 洗涤固定剂，并将样品在 60% 甘油中平衡。用指甲油和 60% 甘油将外植体封片于显微镜载玻片上用于成像。代表性免疫染色结果请参见 图3.
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结果
本方案可实现活体斑马鱼尾部外植体的平面几何培养。与完整胚胎相比，组织培养具有三大优势：1）可控制体轴伸长速度；2）通过简单的解剖操作即可调控多种信号分子（形态发生素）来源；3）可实现接近物镜的高倍率、高数值孔径活体成像。
未经化学处理的载玻片腔室允许尾部外植体通过表皮外胚层包裹下方组织而延长其主轴（图2A）。当我们将在经化学活化处理的载玻片腔室（含I型胶原蛋白）上培养的外植体进行培养时，表皮外胚层伸展并黏附于载玻片腔室表面，从而阻止了外植体的主轴延长。尽管如此，体节仍继续发生分节（图2B，补充影片S1和S2）。如本实验方案所述，也可在封片过程中施加物理压力，或将外植体封于较浅的载玻片腔室中，直接抑制主轴的延长。此类物理限制条件下主轴延长速度的定量分析结果可参见我们先前发表的研究5。
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讨论
本文介绍了一种我们近期开发并使用的斑马鱼胚胎组织培养外植体技术的详细方案5。该技术是在鸡8和斑马鱼9,10,11等模式生物先前的外植体方法基础上建立起来的。采用本方案制备的尾部外植体可在简单的载玻片培养腔中存活超过>12小时，期间持续伸长大体轴并进行体节分割，直至体节形成阶段结束。
应注意保持外植组织的健康状态，以实现长期成功伸长。首先，应在外植体解剖过程中避免损伤后部组织的完整性。我们观察到皮肤细胞为进入后部尾芽的神经中胚层祖细胞提供了容纳空间；如果外植体的皮肤被剥离，这些高度运动性的细胞将离开尾芽组织，并向盖玻片后方迁移，超出组织边界。其次，皮肤组织在内外侧方向上的张力不平衡可能导致主轴伸长方向发散，从而使体节中胚层（PSM）和脊索的轴线发生弯曲。在外植体两侧的毗邻皮肤细胞上做一短切口，有助于...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院斑马鱼核心设施和辛辛那提儿童医院兽医服务中心在鱼类饲养方面提供的支持，感谢辛辛那提儿童医院影像核心设施提供的技术协助，感谢Didar Saparov在视频制作方面的帮助，以及Hannah Seawall对稿件的编辑。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院资助 美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助项目编号R35GM140805，授予E.M.Ö.。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 皮下注射器，带 PrecisionGlide 针头 | Becton, Dickinson and Co. | REF 309597 | 用于去壳胚胎及操作 |
| 200 证明无水乙醇 | Decon Labs | 2701 | 用于免疫染色 |
| 抗生素-抗真菌溶液（100×） | Sigma-Aldrich | A5955 | 用于组织解剖培养基 |
| 无水氯化钙粉末 | Sigma-Aldrich | 499609 | 用于组织解剖培养基 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D5879 | 用于免疫染色 |
| 一次性手术刀，#10 不锈钢 | Integra-Miltex | MIL4-411 | 用于制备胶带载玻片孔 |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine） | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | （可选）用于麻醉 20 体节期以上的组织 |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher | A3160601 | 组织培养培养基的额外添加成分 |
| 山羊抗小鼠 IgG2b，Alexa Fluor 594 | Invitrogen | Cat#A-21145; RRID: AB_2535781 | 免疫染色用二抗 |
| L-15 培养基，含 L-谷氨酰胺，不含酚红 | GIBCO | 21083-027 | 用于组织解剖培养基 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 179337 | 用于免疫染色 |
| 显微外科角膜刀，2.85 mm 斜角双面刃 | Surgical Specialties | 72-2863 | 用于组织解剖 |
| 小鼠单克隆抗 ppERK 抗体 | Sigma-Aldrich | Cat#M8159; RRID:AB_477245 | 用于 ppERK 免疫染色 |
| NucRed Live 647 ReadyProbes 试剂 | Invitrogen | R37106 | （可选）用于活细胞核染色 |
| 多聚甲醛粉末，95% | Sigma-Aldrich | 158127 | 用于免疫染色样品的固定 |
| 大鼠尾胶原包被溶液 | Sigma-Aldrich | 122-20 | （可选）用于化学活化载玻片腔室 |
| 载物台培养箱 | Tokai Hit | tokai-hit-stxg | （可选）用于活体成像过程中的温度控制 |
| 透明胶带 3/4 英寸 | Scotch | S-9782 | 用于制备胶带载玻片孔 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 用于免疫染色 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 用于免疫染色 |
| 斑马鱼：Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP) | Campbell et al., 2015 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4 | 表达核定位 EGFP 的转基因鱼 |
| 斑马鱼：Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP) | Cooper et al., 2005 | ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75 | 表达细胞膜定位 EGFP 的转基因鱼 |
参考文献
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- Diez del Corral, R., et al. Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension. Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).
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