我们建立了一种利用Sleeping Beauty（SB）转座子系统，通过电穿孔将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因转染至原代人色素上皮细胞的实验方案。转染成功通过定量聚合酶链式反应（qPCR）、免疫印迹（immunoblotting）和酶联免疫吸附测定（ELISA）得以验证。
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本文内容
摘要
摘要
社会老龄化程度日益加剧，导致神经退行性疾病的发病率不断上升。迄今为止，其病理机制尚未被充分阐明，从而阻碍了明确治疗手段的建立。基于细胞的增补型基因疗法通过提高保护性因子的表达水平，被视为治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）等神经退行性疾病的一种有前景的策略。我们开发了一种方法，利用Sleeping Beauty（SB）转座子系统，将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因稳定整合到原代人眼色素上皮（PE）细胞基因组中，实现其稳定表达。PEDF是一种在神经系统中具有神经保护和抗血管生成作用的蛋白质。原代PE细胞从人供体眼球中分离并进行体外培养。当细胞达到汇合状态后，将1 × 104个细胞悬浮于11 µL重悬缓冲液中，并与2 µL含有30 ng高活性SB（SB100X）转座酶质粒和470 ng PEDF转座子质粒的纯化溶液混合。采用毛细管电穿孔系统进行遗传修饰，电穿孔参数为：两个脉冲，电压1,100 V，脉宽20 ms。转染后的细胞被转移至含有添加胎牛血清培养基的培养板中；抗生素和抗真菌剂在首次换液时加入。在独立重复的实验中验证了转染的成功。定量聚合酶链式反应（qPCR）结果显示PEDF转基因表达显著升高。免疫印迹分析表明PEDF分泌水平显著提高，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）证实其分泌持续稳定。由SB100X介导的基因转移实现了PEDF基因在PE细胞基因组中的稳定整合，确保了PEDF的持续分泌，这对于开发用于治疗AMD或其他视网膜变性疾病基于细胞的基因增补疗法至关重要。此外，对PEDF转座子在人PE细胞中整合位点分布的分析表明，其在基因组中的整合几乎呈随机分布。
引言
高龄被认为是神经退行性疾病的主要风险因素。年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种多基因疾病，可导致60岁以上患者严重视力丧失，属于全球致盲和视力障碍的四大最常见病因之一1，预计到2040年将影响2.88亿人2。视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD发病机制的重要组成部分。RPE是一层紧密排列的细胞，位于脉络膜毛细血管与视网膜光感受器之间，承担多种对正常视网膜功能至关重要的功能3，并分泌多种生长因子及其他对维持视网膜和脉络膜毛细血管结构完整性至关重要的因子，从而支持光感受器的存活，并为血液循环和营养供应提供基础。
在健康的眼睛中，色素上皮衍生因子（PEDF）负责平衡血管内皮生长因子（VEGF）的作用，保护神经元免于凋亡，抑制内皮细胞增殖，并稳定毛细血管内皮。VEGF与PEDF比例的改变与眼部新生血管形成相关，这一现象已在动物模型4,5以及因年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性糖尿病视网膜病变导致脉络膜新生血管（CNV）的患者样本中观察到6,7,8
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方案
人眼供体来自亚琛工业大学医院眼科系（亚琛工业大学大学医院）的亚琛角膜库，在符合《赫尔辛基宣言》协议的前提下，获得知情同意后获取。人源样本的采集和使用程序已获机构伦理委员会批准。
1. 原代人视网膜色素上皮细胞的分离
- 准备好无菌防护服和手套，并在层流台下放置无菌铺巾。
- 将无菌制备器械及其他所需无菌设备置于层流台下。
- 记录眼球的接收时间、制备开始时间以及任何可能的异常情况。登记供体年龄、性别、死亡原因以及死亡至眼球摘除之间的时间间隔。
- 将眼球置于无菌纱布中，用手握住。
- 使用手术刀和超细尖眼科剪，在距角膜缘约 3.5 mm 的后方，作一周向切割，分离前段与后段。
- 将眼球后段向下倾斜，用蜂鸟镊小心去除玻璃体和视网膜。
- 用直型虹膜镊轻柔调整塌陷的视网膜色素上皮/脉络膜复合体，随后用弯型虹膜镊固定其位置。
- 向眼球后杯中加入 1 mL 添加了 10% 胎牛血清（FBS）、80 U/mL 青霉素和 80 µg/mL 链霉素（Pen/Strep）以及 2.5 µg/mL 两性霉素 B（AmphoB）的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F-12 营养混合物（DMEM/F12）。
注意：与从猪或牛眼分离原代 RPE 细胞不同36,
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结果
原代人视网膜色素上皮细胞的培养与电穿孔
我们已证明，接种足量的动物来源原代视网膜色素上皮（RPE）细胞，可使其在体外培养形成由色素化、六边形细胞组成的完整单层36,37,48。这些细胞在体外能够形成紧密连接、表现出吞噬活性并表达特定的标志基因48，反映了视网膜色素上皮在体内的主要功能。从人供体眼球中分离的原代RPE细胞在体外培养后同样呈现典型的鹅卵石样形态，且不受供体年龄（65.3 ± 9.94 岁，最小值：49 岁，最大值：83 岁，n = 12）、死亡后取材时间（37.3 ± 17.0 小时，最小值：16 小时，最大值：68 小时，n = 12）以及培养时间（27.6 ± 14.1 天，最小值：13 天，最大值：61 天，n = 12）的影响（图2
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讨论
在本项目中，我们的目标是通过非病毒方法制备能够持续过表达并分泌有效因子的基因修饰人原代视网膜色素上皮（RPE）细胞，从而将转染后的细胞用作建立和维持保护性微环境的长期治疗手段。我们已成功导入编码PEDF的基因，该基因表达一种广泛存在的多功能蛋白，具有抗血管生成和神经保护功能。本文所述方案可用于利用SB100X转座子系统对人原代RPE细胞进行稳定且可重复的转染。DNA的递送及导入RPE细胞过程采用基于移液管的毛细管转染系统完成，该系统使用特制的转染尖端作为电穿孔室，取代传统的电穿孔杯。
用于后续转染的、由形态学上良好分化的细胞组成的原代视网膜色素上皮（RPE）培养物的富集效果，受到多种因素影响，包括供体的人类个体因素（年龄和总体健康状况）以及眼球获取情况（细胞分离的死后时间）。新分离并接种的原代RPE细胞至少需要2 周时间才能形成由六边形细胞组成的单层结构。通常情况下，在转染前需要更长时间达到汇合的细胞培养物，在转染后也表现出粘附和铺展速度减慢的现象。细胞粘附和铺展还可能受到RPE细胞在分离或转染过程中受损所释放的游离色素沉积的阻碍。
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披露
Zoltán Ivics 和 Zsuzsanna Izsvák 是多项关于 SB 转座子技术专利的发明人
致谢
本工作由欧盟研究、技术发展和示范第七框架计划资助，资助协议编号为305134。Zsuzsanna Izsvák获得了欧洲研究理事会高级资助（ERC-2011-ADG 294742）的支持。作者谨此感谢Anna Dobias和Antje Schiefer（亚琛工业大学医院眼科系）提供的出色技术支持，以及亚琛角膜库（亚琛工业大学医院眼科系）提供的人类供体眼球。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 原代人视网膜色素上皮细胞的分离 | |||
| 24孔细胞培养板 | Eppendorf，德国汉堡 | 0030722019 | |
| 两性霉素B250 µg/mL（两性霉素B） | 默克公司，德国达姆施塔特 | A2942 | |
| 科利布里镊子 | Geuder，德国海德堡 | G-18950 | |
| 弯曲虹膜镊 | Geuder，德国海德堡 | G-18856 | |
| 一次性手术刀（No. 11） | 中国日本大阪羽 | ||
| 杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s Medium/Ham’DMEM/F12 营养混合物 | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P04-41150 | |
| 超细尖眼科剪 | Geuder，德国海德堡 | G-19405 | |
| 胎牛血清0.2 µm 无菌过滤的胎牛血清（FBS） | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P40-37500 | |
| 巴斯德玻璃移液管 | 品牌，德国韦尔泰姆 | 747715 | |
| 青霉素 [10,000 单位/毫升] 和链霉素 [10 毫克/毫升]（Pen/Strep） | 默克公司，德国达姆施塔特 | P0781 | |
| 移液器吸头1000 µL) | Starlab，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（100-1000 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 无菌铺巾 | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| 无菌纱布敷料 | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| 无菌手套 | Sempermed，维也纳，奥地利 | ||
| 无菌培养皿（Falcon 60 mm × 15 mm） | 康宁，纽约州，康宁 | 351007 | |
| 无菌手术衣 | Halyard Health，美国佐治亚州阿尔法雷塔 | ||
| 直型虹膜镊 | Geuder，德国海德堡 | G-18855 | |
| 原代人视网膜色素上皮细胞的电穿孔 | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12孔细胞培养板 | Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA | 150628 | |
| 24孔细胞培养板 | Eppendorf，德国汉堡 | 0030722019 | |
| 两性霉素B250 µg/mL（两性霉素B） | 默克公司，德国达姆施塔特 | A2942 | |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s Medium/Ham’DMEM/F12 营养混合物 | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P04-41150 | |
| Safe-Lock 微量离心管（1.5 mL） | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 胎牛血清0.2 µm 无菌过滤的胎牛血清（FBS） | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P40-37500 | |
| 倒置显微镜 | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| 微量分光光度计（NanoDrop 分光光度计） | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | ||
| 毛细管转染系统（Neon 转染系统） | Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA | MPK5000 | |
| Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | MPK1096 | |
| 血细胞计数板（Neubauer 计数室） | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen，德国 | 0640110 | |
| PBS Dulbecco 不含 Ca2+ 不含 Mg2+ | Biochrom，德国柏林 | L182-50 | |
| 青霉素 [10,000 单位/毫升] 和链霉素 [10 毫克/毫升]（Pen/Strep） | 默克公司，德国达姆施塔特 | P0781 | |
| 移液器吸头（10 µL) | 德国汉堡 Starlab | ||
| 移液器吸头1000 µL) | 德国汉堡 Starlab | ||
| 移液器吸头200 µL) | 德国汉堡 Starlab | ||
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 12163 | |
| 单通道移液器（0.1-10 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（100-1000 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（10-200 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 台盼蓝溶液 | 默克公司，德国达姆施塔特 | T8154 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05 %) | Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA | 25300054 | |
| 转染的人类原代视网膜色素上皮细胞分析 | |||
| 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶 | |||
| 1× 孵育缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8.0 | |||
| 2x SDS上样缓冲液 | |||
| 4x 孵育缓冲液（200 mM NaH2PO4，1.2 M NaCl，40 mM 咪唑，pH 8.0） | |||
| Amersham Protran 支持膜 0.2 µm 硝酸纤维素印迹膜 | Cytiva，马萨诸塞州马尔伯勒 | 10600015 | |
| 两性霉素B250 µg/mL（两性霉素B） | 默克公司，德国达姆施塔特 | A2942 | |
| 抗PEDF抗体（兔多克隆） | BioProducts，马里兰州米德尔顿 | AB-PEDF1 | |
| 抗五聚组氨酸抗体（小鼠单克隆） | Qiagen，德国希尔登 | 34660 | |
| 杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s Medium/Ham’DMEM/F12 营养混合物 | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P04-41150 | |
| 洗脱缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 8.0 | |||
| 胎牛血清0.2 µm 无菌过滤的胎牛血清（FBS） | PAN-Biotech，德国艾登巴赫 | P40-37500 | |
| 血细胞计数板（Neubauer 计数室） | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen，德国 | 0640110 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体（兔多克隆） | Agilent Dako，加利福尼亚州圣克拉拉 | P0260 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体（山羊多克隆） | Abcam，英国剑桥 | ab6721 | |
| 人PEDF ELISA试剂盒 | BioProducts，马里兰州米德尔敦 | PED613 | |
| LAS-3000 成像系统 | 富士胶片，日本东京都港区 | ||
| LightCycler 1.2 仪器 | 罗氏生命科学，德国彭茨贝格 | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | 罗氏生命科学，德国彭茨贝格 | 12239264001 | |
| LightCycler 毛细血管（20 μl) | 罗氏生命科学，德国彭茨贝格 | 4929292001 | |
| 微量分光光度计（NanoDrop 分光光度计） | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | ||
| Mini-PROTEAN 四细胞铸造模块 | Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴 | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN 用于小型预制胶的四垂直电泳槽，4块胶 | Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴 | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen，德国希尔登 | 30410 | |
| PageRuler 预染蛋白质标准品 | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 26616 | |
| 青霉素 [10,000 单位/mL] 和链霉素 [10 mg/mL] (Pen/Strep) | 默克公司，德国达姆施塔特 | P0781 | |
| 移液器吸头10 µL) | 德国汉堡 Starlab | ||
| 移液器吸头1000 µL) | Starlab，德国汉堡 | ||
| 移液器吸头200 µL) | 德国汉堡 Starlab | ||
| PowerPac Basic 电源供应器 | Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴 | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen，德国希尔登 | 51304 | |
| 逆转录系统 | Promega，美国威斯康星州麦迪逊市 | A3500 | |
| 无RNase的DNase试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen，德国希尔登 | 74104 | |
| 摇床振荡器 | Cole-Parmer，英国斯塔福德郡 | SSM3 | |
| Safe-Lock 微量离心管（1.5 mL） | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| Safe-Lock 微量离心管（2.0 mL） | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（0.1-10 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（100-1000 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| 单通道移液器（10-200 µL) | Eppendorf，德国汉堡 | ||
| Trans-Blot Turbo 转膜系统 | Bio-Rad Laboratories，德国菲尔德基兴 | 1704150 | |
| 台盼蓝溶液 | 默克公司，德国达姆施塔特 | T8154 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05 %) | 赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 25300054 |
参考文献
- James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Wong, W. L., et al.
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