使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

摘要

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden Gate克隆的模块化克隆系统组装多基因结构。同时，根据我们的实践经验，提供了确保高效组装关键步骤的建议。

摘要

Golden Gate 克隆方法能够快速组装多个基因，并可按照用户自定义的顺序进行排列。该方法利用 IIS 型限制性内切酶，此类酶在识别位点之外进行切割，产生短的黏性末端。这种模块化克隆（MoClo）系统采用分级工作流程：首先将不同的 DNA 元件（如启动子、编码序列（CDS）和终止子）克隆至入门载体中；随后多个入门载体组装成转录单元；多个转录单元进一步连接形成多基因质粒。Golden Gate 克隆策略具有显著优势，可在单管反应中实现无痕、定向且模块化的组装。该分级工作流程通常可轻松构建多种多基因结构，且除入门载体外无需对后续构建体进行测序验证。利用荧光蛋白缺失元件可实现简便的可视化筛选。本文提供了一套使用酵母模块化克隆（MoClo）试剂盒组装多基因质粒的详细分步操作方案。我们展示了多基因质粒组装的最优与次优结果，并提供了菌落筛选指南。该克隆策略在酵母代谢工程及其他需要多基因质粒克隆的场景中具有广泛应用前景。

引言

合成生物学旨在构建具有新功能的生物系统，以服务于制药、农业和化工产业。以高通量方式组装大量DNA片段是合成生物学中的一项基础技术。这一复杂过程可借鉴基础工程科学的概念^1,2，分解为多个复杂度逐级降低的层级。在合成生物学中，DNA片段通常根据功能进行分层组装：（i）元件（Part）层级："元件"指具有特定功能的DNA片段，例如启动子、编码序列、终止子、复制起点；（ii）转录单元（Transcription Unit, TU）层级：一个转录单元由一个启动子、一个编码序列和一个终止子组成，能够转录单个基因；（iii）多基因层级：一个多基因质粒包含多个转录单元，通常构成完整的代谢通路。这种由BioBrick社区开创的分层组装方法，是合成生物学中大规模DNA组装的基础概念³。

在过去的十年中^4,5,6,7，金门克隆技术已显著促进层级式DNA组装²许多其他多片段克隆方法，例如 Gibson 克隆

方案

注意：本工具包提供的分级克隆方案可分为三个主要步骤：1. 克隆片段质粒；2. 克隆转录单元（TUs）；3. 克隆多基因质粒（图1）。本方案从引物设计开始，到克隆所得多基因质粒的应用结束。

1. 克隆片段质粒（pYTK001）的引物设计：

1. 设计正向和反向引物，其5'端包含侧翼核苷酸TTT、一个带有额外核苷酸（CGTCTCN）的BsmBI识别位点、一个与入门载体互补的4核苷酸（nt）突出端（TCGG）、一个带有额外核苷酸（GGTCTCN）的BsaI识别位点，以及一个4 nt的片段特异性突出端，此外还包括模板特异性序列（图2A）。GoldenBraid 4.0³⁷ 和 GoldenMutagenesis³⁸ 是可用于Golden Gate特异性引物设计的一些在线软件。
2. 如果任何片段中存在BsaI或BsmBI识别位点，则在进行Golden Gate组装之前，需通过“驯化”步骤突变这些位点³⁹。对于整合型质粒（见步骤4），还需驯化任何NotI识别位点。若要对含有一个不期望识别位点的片段进行驯化，应将该片段在不期望位点附近划分为两个子片段（图2....

结果

此处展示了四种用于生产β-胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）的复制型多基因质粒的结果。构建了一种用于破坏ADE2位点的整合型多基因质粒，其菌落呈红色。

将CDS克隆至入门载体（pYTK001）
ERG20 从酵母基因组中扩增出三个类胡萝卜素基因 crtE, crtYB, crtI 来自质粒 pLM494⁴⁸ 进入载体 pYTK001，具体方法如前所述。酵母启动子 pENO2、pTIP1、pPYK1 和 pPDC1 和终止子 tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 作为部分质粒进行克隆。在 CrtYB 中引入点突变（G247A）以产生番茄红素，并且一个 BTS1-ERG20 融合构建体被设计.......

讨论

Lee 等人开发的基于 MoClo 的克隆试剂盒为将一个至五个转录单元快速组装到多基因质粒中提供了优良的资源，该质粒可用于在酵母基因组中进行复制或整合。使用该试剂盒可消除在酵母中表达多个基因时经常遇到的耗时克隆瓶颈。

我们测试了五种不同的条件，用于T4 DNA连接酶介导的Golden Gate克隆中的消化/连接循环。结果发现，在4片段组装中，进行30个循环（37 °C消化5分钟，16 °C连接5分钟），随后在50 °C进行最终消化10分钟，并在80 °C进行蛋白质失活10分钟，可获得99.5%潜在正确的克隆（补充图S1和表S3）。16 °C下的连接可确保连接酶活性和黏性末端的充分退火；50 °C的最终消化步骤可防止已消化产物发生重新连接。除非另有说明，所有组装反应均采用此循环程序。

我们还发现了一些需要特别注意的关键步骤，以获得最佳结果。我们强烈建议在组装转录单元之前，先使用 sfGFP 筛选标记构建中间载体。理论上，所有七个片段均可克隆至含有 mRFP1 的 E. coli.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 玻璃珠	RPI research products	9831	用于裂解酵母细胞
Bacto 琼脂	BD & Company	214010	酵母完全合成培养基（CSM）的组分
Bacto 胰蛋白胨	BD& Company	211677	酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）的组分
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	BsaI 限制性内切酶的高效版本
羧苄青霉素	Fisher Bioreagents	4800-94-6	用于转录单元水平的筛选抗生素
氯霉素	Fisher Bioreagents	56-75-7	用于入门载体水平的筛选抗生素
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	酵母完全合成培养基（CSM）的氨基酸补充剂
葡萄糖	Fisher Chemical	D16-500	酵母完全合成培养基（CSM）的碳源
Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸）	BD & Company	291940	酵母完全合成培养基（CSM）的氮源
dNTP 混合液	Promega	U1515	用于 PCR 的 dNTPs
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	BsmBI 的一种高效同裂酶
Frozen-EZ 酵母转化 II 试剂盒	Zymo Research	T2001	用于酵母转化
己烷	Fisher Chemical	H302-1	用于从酵母细胞中提取类胡萝卜素
卡那霉素	Fisher Bioreagents	25389-94-0	用于多基因质粒水平的筛选抗生素
LB 琼脂，Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	用于 E. coli 培养的溶原性琼脂培养基
LB 肉汤，Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	用于 E. coli 培养的溶原性液体培养基
番茄红素	Cayman chemicals	NC1142173	用于番茄红素定量分析
MoClo YTK	Addgene	1000000061	存放实验室：John Deuber
Monarch 质粒小提试剂盒	New England Biolabs	T1010L	用于从 E.coli 中纯化质粒
Nanodrop 分光光度计	Thermo Scientific	ND2000c	用于精确测定 DNA 浓度
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	用于整合型多基因质粒线性化的限制性内切酶
诺尔斯曲星硫酸盐	Goldbio	N-500-100	本研究中使用的 pCAS 质粒的抗生素筛选标记
Phusion HF 反应缓冲液（5X）	New England Biolabs	B0518S	使用 Phusion 聚合酶进行 PCR 的缓冲液
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S	用于所有 PCR 反应的高保真聚合酶
pLM494	Addgene	100539	用于扩增本研究中使用的 crtI、crtYB 和 crtE 基因的质粒
石英比色皿	Thermo Electron	10050801	用于类胡萝卜素定量分析
T4 连接酶	New England Biolabs	M0202S	用于 Golden Gate 克隆的连接酶
热循环仪	BIO-RAD	1851148	用于进行所有 PCR 和克隆反应
组织匀浆器	Bullet Blender	型号：BBX24	用于酵母细胞的匀浆处理
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	Genesys 150	用于类胡萝卜素定量分析
酵母提取物	Fisher Bioreagents	BP1422-500	酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）的组分
β-胡萝卜素	Alfa Aesar	AAH6010603	用于 β-胡萝卜素定量分析