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方法文章

在镶嵌式支架上逐步接种细胞以研究出芽型血管

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DOI：

10.3791/61995

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2021年1月14日

 ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

本文内容

摘要

工程化组织高度依赖于适当的血管网络，以提供必需的营养物质和气体，并清除代谢废物。本研究中，通过内皮细胞与支持细胞的逐步接种方案，在高通量平台上构建出高度有序的血管网络，用于在可控的三维环境中研究血管发育行为。

摘要

循环系统在人体生理学中起着关键作用，为体内大多数组织提供营养；血管根据各自灌注组织的具体需求，呈现出不同的尺寸、结构、表型和功能特性。组织工程领域旨在修复或替代受损或缺失的组织，其成功依赖于可控的血管生成过程，以在工程化组织内建立适当的血管化网络。缺乏血管系统时，较厚的工程化结构无法获得充分营养，可能导致细胞死亡、移植效果差，最终导致失败。因此，理解并调控工程化血管的行为是该领域面临的一项重大挑战。本研究介绍了一种高通量系统，可在三维支架环境中构建有序且可重复的血管网络，用于研究血管行为。该两步接种方案表明，系统内的血管会响应支架的拓扑结构，在不同几何构型的微环境中表现出独特的出芽行为。通过该高通量系统获得的结果与认知，可用于指导更优的三维生物打印支架结构设计——因为在以三维打印技术构建含细胞的生物环境时，难以快速评估多种三维几何结构的性能。此外，该高通量系统所提供的认知还可用于改进快速药物筛选、加速共培养模型的开发，以及探究机械刺激对血管形成的影响，从而加深对血管系统的理解。

引言

组织工程领域正在迅速发展，致力于构建工程化结构以替代缺失或受损的器官和组织1。然而，由于尚无法有效构建用于组织营养供给的功能性血管网络，目前仍未实现完全功能化的组织结构。缺乏适当的血管化会导致工程化组织仅依赖被动扩散来运输氧气和营养物质，从而将组织最大可存活厚度限制在扩散极限范围内，约为 200 µm2。此类厚度不足以修复大面积组织缺损或实现完整器官的构建，因此功能性血管网络的存在成为功能性及可植入组织所必需的关键特征3。

血管系统由多种不同大小、表型和结构的血管组成，其特征与宿主组织密切相关。理解发育中和出芽血管的行为、响应及其迁移决策，有助于指导其在工程化组织中的整合4。目前，体外构建血管网络最常用的方法是将内皮细胞（ECs）与支持细胞（SCs，具有分化为壁细胞的能力）共同接种于三维微环境中。该环境提供化学和物理信号，促使细胞黏附、增殖并自组装形成血管网络2,5,6,7,8。在共培养条件下，支持细胞分泌细胞外基质（ECM）蛋白，同时为形成管状结构的内皮细胞提供机械支撑。此外，两类细胞之间的相互作用促进管状结构形成、血管出芽和迁移，同时也促进支持细胞成熟并分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）的壁细胞4。血管网络的发育通常在由水凝胶、多孔聚合物支架或二者结合构建的三维环境中进行研究。后一种方案既能提供有利于细胞生长的环境，又能为细胞和细胞外基质提供必要的机械支撑9。

已有大量研究致力于血管发育的探索，包括在水凝胶上共培养细胞10、使用水凝胶-支架组合11,12、二维平台以及微流控装置13。然而，水凝胶容易受到细胞施加力的作用而发生形变14，而二维和微流控系统则难以重建更接近自然的环境，从而无法获得更具可外推性的响应结果15,16。理解新生血管如何响应其周围环境，可提供关键性见解，有助于构建能够以可预测方式引导血管发育的工程化环境。深入认识血管形成现象对于跟上从亚微米到微米尺度制造技术的快速发展尤为重要，这些技术包括立体光刻、数字投影光刻、连续液态界面制造、三维熔融电喷写、基于溶液的三维电喷写以及新兴的生物打印技术17,18,19,20,21。将这些微制造技术的控制能力与对血管生物学的深入理解相结合，是为特定组织构建合适工程化血管系统的关键。

在此，我们介绍一种三维系统，用于研究新生和出芽血管对周围支架几何结构的响应，观察其出芽起源及随后的迁移过程22。通过使用具有镶嵌式分隔结构的三维支架以及两步接种技术，我们成功构建了高度有序的血管网络，且该网络结构清晰、易于分析。这种镶嵌式几何结构提供了一种高通量系统，其各个独立单元内的血管可响应局部微环境。利用多色内皮细胞（ECs），我们追踪了出芽形成的起源及其后续迁移模式，并将其与分隔结构的几何特征及间充质干细胞（SCs）的位置相关联22。

尽管本方案旨在分析几何线索对血管化行为的影响，但该方法可拓展并应用于多种新领域。这种镶嵌式支架和易于成像的网络结构，可直接用于分析不同内皮细胞与基质细胞的相互作用、特定器官细胞的引入及其与血管网络的相互作用、药物对血管网络的影响等。我们所建议的系统具有高度的多功能性，且制备与加工过程简便。

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方案

1. 分割式支架的制备

注意：光刻是一种广泛应用的技术，需要专门的设备，这些设备通常位于纳米加工设施/实验室中。本方案中所述方法已尽可能通用化，以适应广大读者；然而，具体操作步骤可能需要根据读者所拥有的设备进行细微调整。我们建议在纳米加工设施的洁净室中执行这些操作 ，以确保最高的工艺质量。 在开始之前，请确保能够使用掩模对准器（或某种紫外光曝光装置）、匀胶机、加热板、溶剂清洗站、光掩模以及 等离子清洗机。本操作中使用的溶剂和化学品具有危害性，因此请务必格外小心，避免任何化学物质暴露。设计光掩模时，需确认所用硅片和光掩模的尺寸是否与匀胶机和掩模对准器兼容。此外，硅片边缘区域的光刻胶通常会因操作而发生形变；因此，应将图案设计在硅片的中心区域。

  1. 使用光刻技术制备具有选定几何结构的支架。
    1. 在旋涂之前，清洁硅片。这可以通过等离子清洗或基于溶剂的方法完成 技术。若使用等离子清洗，请遵循仪器的标准操作程序以获取操作细节。用压缩氮气喷射晶圆，并检查其表面是否无残留物，确保清洁后再进行旋涂。该晶圆将用作基底。 支架即在此基础上构建。
      ​注意：为获得最佳效果，请使用全新的晶圆。晶圆可重复使用，但应 无旧光刻胶、表面缺陷和碎屑。 使用晶圆镊子有助于 操作。
    2. 使用定位导板将硅片置于匀胶机卡盘中央。短暂启动匀胶机旋转硅片，检查其是否准确居中，必要时进行调整，直至硅片完全居中。每次将硅片放置于匀胶机卡盘上时均需执行此操作。将1–4 mL去胶液滴加至硅片表面（具体用量取决于硅片尺寸）。对于4英寸硅片，使用约2 mL去胶液效果较佳。
      1. 将旋涂仪的铺展速度设置为500 rpm，持续5秒，旋涂速度设置为1000 rpm，持续30秒，然后旋涂剥离试剂。检查晶圆以确保其表面涂层均匀。此时晶圆表面残留的任何碎片都将非常明显。任何支架结构中的 有碎屑的区域可能无法使用。旋涂后，转移至加热板上，在 200 °C 下烘烤 1 分钟。
    3. 重复上述步骤两次，共进行三次包被。
    4. 将涂有剥离试剂的硅片用SU-8 2050光刻胶进行旋涂，直至获得约100 µm的厚度。
      1. 每25毫米基底直径分配1毫升光刻胶。
        ​注意：倾倒光刻胶时需小心避免产生气泡。使用4英寸硅片时，倾倒约2英寸直径的圆形区域，适用于SU-8 2050。
      2. 旋涂 SU-8 2050。以 500 rpm 的速度旋涂 5 秒，随后以 1700 至 1800 rpm 的速度继续旋涂，以获得约 100 µm 的厚度。
      3. 可选旋涂完成后，将晶圆置于避光的水平表面上静置过夜以脱气，然后再进行前烘。此步骤有助于去除光刻胶中的气泡，并使缺陷趋于平整。
        ​注意：光刻胶的实际厚度及最终支架的厚度可能因操作误差和设备参数而有所差异。因此，应在步骤1.6中验证支架的厚度，并相应调整旋涂工艺以获得目标厚度。
    5. 曝光前，将晶圆在65 °C下预烘10分钟，随后在95 °C下烘烤40-50分钟。曝光前，用镊子轻压光刻胶边缘测试其表面，确保其不再发粘或呈粘稠状。可将晶圆从加热板上取下，冷却0.5至1分钟后再检查粘性，此操作有助于判断。
      注意：缓慢的升温和降温速率可能有助于防止支架发生翘曲。
  2. 通过带有光刻掩模的紫外光（350–400 nm）照射光刻胶，曝光能量为215–240 mJ/cm²2 对于85 - 110 µm的光刻胶厚度，建议参考光刻胶制造商提供的曝光能量与厚度对应关系指南。
    1. 确保曝光经过适当校准，以验证能量值。根据需要调整曝光时间，以达到所需的曝光能量。此外，掩模对准器可能支持不同的曝光模式：真空接触、硬接触、软接触和接近接触（具体术语可能有所不同）。这些模式通常会影响分辨率和特征对准。作者通常采用 "硬性隐形眼镜" 模式。
    2. 对于具有微小特征或多层结构且对准至关重要的情况，需更仔细地考虑曝光模式及掩模对准仪的操作流程。调整光刻胶厚度参数时，务必考虑其实际高度。具体操作细节请参考所用掩模对准仪的标准操作规程。
      ​注意：光掩模的设计将决定支架的尺寸、隔室几何形状以及每批次获得的支架数量。使用硬质玻璃或石英光掩模可获得最高分辨率；然而，对于这些较大的特征尺寸，通常可使用软性聚合物透明薄膜光掩模>10 µm）。使用薄膜光掩模可能会因特征分辨率较低，导致支架孔隙在z轴方向上出现形貌特征，这可能对细胞行为产生影响。请验证所需的分辨率。 咨询负责制作光掩模的人员，以确保达到所需的分辨率。
  3. 紫外曝光后立即将晶圆在65 °C下烘烤2-5分钟，然后在95 °C下烘烤8-10分钟。
  4. 显影支架以去除未曝光的光刻胶。
    1. 使用少量 SU-8 显影液浸泡支架，持续 7–10 分钟，以溶解任何未显影的光刻胶。
    2. 用异丙醇（IPA）冲洗。
    3. 用压缩氮气吹干晶圆。
      注意：在步骤1.4中需格外小心，避免支架过早释放。使用少量显影液并轻柔操作是实现此目的的关键。
  5. 显影后，将晶圆在 150 °C 下坚膜烘烤 15 分钟。
    注意：硬烘焙后，关闭加热板以使晶圆缓慢冷却，可能有助于防止最终支架发生翘曲或卷曲。
  6. 可选在硬烤之后、剥离之前，评估支架的厚度，因为此时支架仍应轻微附着在晶圆表面。对于此步骤，可采用接触式轮廓仪进行测量，但也可使用其他合适的方法。
  7. 将支架从晶圆上取下。
    1. 将支架浸入SU-8显影液中，使其立即从晶圆上剥离。如果支架未自行剥离，可用晶圆镊子轻轻推动支架。
    2. 去除多余的显影液。
    3. 将支架转移至新容器中，并浸入异丙醇。用异丙醇冲洗至少6次，以确保完全去除所有显影剂。
  8. 使用前将支架风干至少一周。

2. 支架纤连蛋白包被

  1. 进行消毒时，将支架浸入70%乙醇（v/v）中至少15分钟，并在使用前用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次。
    ​注意：SU-8支架较为脆弱，容易断裂。建议使用钝头弯头镊子进行操作，且应极其小心。将支架浸入液体中可避免支架与表面之间的静电相互作用，从而更便于操作。
  2. 在PBS中配制50 µg/mL的人纤维连接蛋白稀释液，并通过蛋白吸附覆盖支架。
    1. 每接种一个支架，取1.5 µL纤维连接蛋白储备液（1 mg/mL）与28.5 µL PBS混合。建议仅配制一份纤维连接蛋白稀释液供所有支架使用，以避免移液误差。
      1. 对于10个支架，将15 µL纤维连接蛋白储备液加入285 µL PBS中，最终得到300 µL的50 µg/mL纤维连接蛋白稀释液。
    2. 将支架稀疏地放置在疏水表面（例如非组织培养（nonTC）10 cm培养皿）上，并用步骤2.2.1中配制的纤维连接蛋白稀释液以每支架30 µL覆盖。
      ​注意：确保支架腔室内无气泡残留。若存在气泡，可通过轻轻晃动支架液滴或轻微吹打去除。
    3. 盖上培养皿盖，将覆盖有纤维连接蛋白的支架置于37 °C、100%湿度的培养箱中孵育至少1小时。
    4. 孵育后，用PBS轻轻冲洗支架以去除残留的纤维连接蛋白。支架可在4 °C的PBS中保存最多一周，以备后续使用。

3. 内皮细胞接种

  1. 根据制造商说明，将基础培养基与其对应的培养基试剂盒组分（包括抗生素溶液（青霉素/链霉素）、胎牛血清（FBS）和内皮细胞生长添加剂）混合，配制内皮细胞（EC）培养基。
  2. 用EC培养基制备浓度为 4 × 106 个细胞/mL 的人脂肪微血管内皮细胞（HAMEC）悬液。
    注意：若所用内皮细胞已预先转染以表达荧光蛋白，或经无毒细胞质膜染料预染色（下文简称标记的ECs），则可进行实时成像。
  3. 使用镊子将一个经纤维连接蛋白包被的支架放入非组织培养处理的24孔板的每个孔中。
  4. 在每个支架上滴加25 µL HAMEC细胞悬液。注意避免悬液从支架上流失，以免影响细胞贴附。
  5. 盖上培养板盖子，置于37 °C、5% CO2 和100%湿度的培养箱中孵育。孵育时间至少60分钟，最多90分钟。
    注意：孵育期间，将培养板置于培养箱内的轨道摇床上可促进细胞在支架壁上的附着。轨道摇床转速不应超过5 rpm。
  6. 孵育结束后，用移液器向每孔加入700 µL EC培养基。
    注意：可见部分内皮细胞位于孔底，因部分细胞未能附着于支架而穿过支架孔隙沉降。
  7. 继续培养内皮化支架，直至通过荧光显微镜观察到支架壁上内皮细胞达到汇合（使用标记ECs时），或培养3天（使用未标记ECs时），以确保细胞充分汇合。每隔一天更换一次培养基。

4. 支持细胞接种与共培养

  1. 通过混合500 mL低糖Dulbecco改良Eagle培养基（低糖DMEM）、57.5 mL胎牛血清（FBS）、5.75 mL非必需氨基酸（NEAA）、5.75 mL GlutaMAX以及5.75 mL青霉素-链霉素-制霉菌素溶液，配制牙髓干细胞（DPSC）培养基（DPSCm）。
  2. 使用镊子将内皮化支架转移至新的非组织培养处理的24孔板中，以去除附着在孔底的内皮细胞（ECs）。
    1. 使用1 mL移液器或真空抽吸法弃去当前孔板中的全部培养基。注意避免将真空直接作用于支架表面。
    2. 每孔放置一个支架，最好置于孔中央，以避免因表面张力效应导致液体流向孔壁。用轻微真空吸干支架周围区域，但避免支架完全干燥。
  3. 在纤维蛋白预凝胶溶液中制备DPSC悬液。
    1. 用PBS稀释凝血酶和纤维蛋白原储备液，使其终浓度分别为5 U/mL和15 mg/mL。
    2. 在5 U/mL凝血酶稀释液中制备浓度为8 × 106 DPSC/mL的细胞悬液，并将12.5 µL该悬液分装至各个离心管中，每管对应一个待接种的支架。
    3. 将5–50 µL移液器（或类似规格）设定至12.5 µL，吸取15 mg/mL纤维蛋白原溶液并充满枪头。
    4. 不更换枪头，将移液器体积调整至25 µL。此时枪头内液体上升，靠近枪头出口处留出一段空隙。
    5. 缓慢按压移液器按钮，使液体到达枪头出口但不渗出。保持按钮在此位置，将枪头插入含有凝血酶细胞悬液的微量离心管中，确保枪头接触液面。
      ​注意：凝血酶与纤维蛋白原接触后会立即启动纤维蛋白交联反应。下一步操作应迅速完成。
    6. 轻缓释放按钮，将细胞悬液吸入枪头内。充分混合两种组分，避免产生气泡。
  4. 迅速将混合液滴加至内皮化支架表面。对每个支架重复上述步骤，注意每次使用均需更换枪头，以防止枪头内部意外形成纤维蛋白凝胶。
  5. 盖上孔板盖子，将支架置于37 °C、5% CO2、100%湿度条件下孵育30分钟。
  6. 孵育结束后，向每孔加入1 mL DPSC与EC培养基1:1混合液。
    1. 培养1周，每隔一天更换一次培养基。
    2. 培养期间，从孔中移除培养基，并在不同时间点使用共聚焦显微镜观察构建物，以研究血管发育或其他关注参数。
      ​注：此步骤仅在实验使用标记的ECs时方可进行。详见第6步注释以获取进一步说明。

5. 特征性血管标志物的免疫荧光染色

注意：以下步骤可在构建物培养的同一孔中进行。必须始终确保溶液完全覆盖支架。此外，建议（尽管非强制）在可能的情况下于轨道摇床中进行这些步骤。

  1. 第7天，弃去孔中的培养基，向孔中加入PBS冲洗支架，并用真空泵吸除PBS。
  2. 加入4%多聚甲醛固定支架20分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
  3. 使用含0.3% Triton-X的PBS（v/v）对固定后的细胞进行通透处理，持续15分钟，再用PBS洗涤3次，每次5分钟。
  4. 配制含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭液（w/v），覆盖支架，室温孵育1小时。
    ​注意：所有所需溶液的用量取决于待染色支架的数量。请根据需要配制溶液，并保持所述浓度。
  5. 配制并施加一抗染色溶液。
    1. 将兔抗血管性血友病因子（vWF）抗体按1:150稀释，小鼠抗SMA抗体按1:50稀释于新鲜封闭液中。
      注意：也可使用其他内皮细胞标志物，如CD31或VE-Cadherin。
    2. 用一抗溶液覆盖支架，4 °C孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟。
  6. 配制并施加二抗染色溶液。
    1. 将羊抗小鼠Cy3抗体按1:150稀释，羊抗兔Alexa-Fluor 488抗体按1:400稀释于PBS中。
    2. 用二抗溶液覆盖支架，室温孵育至少3小时，或4 °C孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟。染色后的支架可保存于含0.3% PFA的PBS（v/v）中，最长一个月。

6. 支架共聚焦成像与血管发育分析

注意：以下步骤可在选定的最终时间点对已固定和染色的支架进行，或者，如果使用了荧光标记的细胞，则可在细胞培养期间的特定时间点进行，而无需终止实验。对于后者，建议设定特定的时间点；本研究展示了接种干细胞（SCs）前的第0天以及接种后的第1、3、5和7天（图3A）。

  1. 使用共聚焦显微镜，配备5倍物镜、0.5倍放大倍数，并覆盖支架的完整z轴范围，对支架进行成像。该设置可捕获方形和圆形几何结构中的9个独立腔室，或六边形几何结构中的8个完整腔室。同时采集荧光信号和透射光信号，以获得血管网络结构和腔室几何形态（图3A）。
  2. 使用ImageJ（或其他图像处理软件）裁剪每个独立的腔室；在此过程中，仅血管网络标记物具有相关性。移除位于腔室区域之外的所有血管。生成最大强度投影，并将每个单独裁剪的腔室保存为TIFF图像。
    1. 在ImageJ中，点击文件 > 打开，选择包含多个腔室的目标TIFF图像。该图像应至少包含两个通道：荧光标记的血管网络通道和透射光图像通道。
    2. 从工具栏中选择多边形选区工具。切换至透射光通道。在六边形腔室的一个角点处点击，即腔室区域与支架壁的交界处，以开始定义掩膜。按顺序依次点击其余角点，直至回到起始角点，闭合掩膜。
      注：以上说明适用于六边形腔室。当腔室为方形或圆形时，应分别使用矩形或椭圆工具创建合适的掩膜。无论何种形状，掩膜均需紧贴支架内壁进行拟合。
    3. 点击分析 > 工具 > ROI管理器。在ROI管理器（ROI，感兴趣区域）中，点击添加按钮以保存创建的掩膜。新掩膜将显示在左侧列表中。此步骤可确保不同图像之间的分析一致性。
      ​注：在ROI管理器中，可通过点击更多 > 保存将所有已创建的掩膜保存为文件。在保存选区窗口中选择名称和存储位置，保存为.roi文件。如需调用掩膜，可在ROI管理器中点击更多 > 打开，并选择相应的.roi文件。
    4. 选择荧光标记的血管网络图像，点击编辑 > 清除外侧。仅保留掩膜范围内的图像内容，其余部分将被清除。
    5. 在清除后的网络图像打开状态下，点击图像 > 复制。在复制弹出窗口中输入图像名称。若选中了复制超堆栈选项，请取消选中，然后点击确定。系统将生成一个仅包含裁剪后荧光血管网络的新图像。
    6. 点击文件 > 另存为 > Tiff保存裁剪后的图像。选择文件名和存储路径，点击确定。
  3. 对裁剪后的图像进行血管发育分析。
    1. 下载并安装免费分析软件AngioTool，该软件可提供多种血管参数的定量分析工具。软件可从以下网址获取：https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home。
    2. 设置图像的比例尺参数，以获得以毫米为单位的结果，并加载图像。
      1. 点击设置选项卡，在像素距离和毫米距离字段中填入所采集图像的代表性数值。根据上述成像参数，应填入400像素对应1毫米。
      2. 点击打开图像按钮，浏览并选择目标图像。
    3. 在分析选项卡中选择分析参数，以量化血管发育情况。
      1. 在血管直径与强度区域，取消顶部范围选择器中的任何现有标记，并激活代表数值3的标记。
      2. 在血管直径与强度区域的底部范围选择器中，将下限标记移至60，上限标记保持在255。
      3. 勾选去除小颗粒选项框，并将阈值设为100。
      4. 在保存偏好区域，选择用于保存结果的电子表格文件的名称和存储位置，然后点击运行分析按钮。若勾选了保存结果图像选项，AngioTool将生成并保存一张新的jpeg图像，显示血管网络的量化参数。
        ​注：每次分析时，若未更改电子表格文件名，则新获得的结果将作为新行添加至文件底部。
  4. 整理数据并进行统计分析。
    1. 对所有处理后的图像，从电子表格中选择感兴趣的参数（例如总血管长度和血管面积），将其输入统计分析软件，以对获得的结果进行恰当分析（图3C）。

7. 芽体起源检测与迁移追踪的延时成像

  1. 或者，除了按照步骤4.6所述在培养箱中培养支架外，还可将共聚焦显微镜培养室设置为37 °C、5% CO₂2 和100%湿度。
    1. 将接种有细胞的支架置于共聚焦显微镜腔室中，并将成像参数设置为所需数值。
    2. 将图像采集间隔设置为30分钟，总成像时间为72小时。这样可确保延时成像全程无需更换培养基。
      警告：如果需要进行较长时间的延时成像，应仔细进行位置校准，以便能够找回原始成像位置，因为更换培养基时需将培养板从共聚焦培养箱中取出并转移至无菌生物安全柜中。
      注意：内皮细胞从支架壁脱离并形成管状结构将在干细胞接种后（步骤4）1小时内开始，可能需要长达50小时才能完成。初始管状结构形成后，新的出芽将开始从周围血管迁移进入腔室。出芽及后续的网络重塑过程将在整个实验期间持续进行，大约至第10天，血管网络趋于稳定。22根据此信息选择相应的时间间隔起始点和时间步长。
  2. 将完整的时间序列电影文件保存为 TIFF 序列。
  3. 打开 ImageJ 并点击 文件 > 导入 > 图像序列 选择您的文件。这将把您的TIFF序列作为视频打开。
  4. 打开 手动追踪 通过点击插件 插件 > 手动追踪。这将打开 追踪 窗口。
  5. 观察视频并选择要追踪的血管，注意其起源和迁移过程。
  6. 激活 显示参数 盒中并输入30分钟 时间间隔。该 x/y 校准 将取决于成像过程中选择的像素数量。
  7. 从支架轮廓开始手动追踪出芽的血管。
    1. 按压 添加轨迹 按钮。在视频的第一帧上，点击待追踪血管的位置。此后，视频将自动跳转至下一帧。
    2. 单击血管所在位置的第二帧图像。同样，视频将自动跳转到下一帧。
    3. 继续使用同一容器，直至完成全部迁移追踪。
    4. 在追踪窗口中，单击 叠加点 & 线条 在视频中记录血管迁移的可视化路径。这将打开视频的副本，其中包含一个点以表示追踪器的当前位置，并有一条线显示其先前的移动轨迹。
    5. 点击 末端追踪 单击按钮以完成当前容器移动的记录。
    6. 点击 添加轨迹 再次按下按钮，以新的血管重新开始。每次操作时，线条和圆点标记会自动更改为新血管的颜色。重复此步骤，直至完成所有目标血管的追踪。
      注意：x/y 位置、血管流速和移动距离可从弹出窗口中获取 结果每个容器将通过其在最左列中的轨道编号进行识别。该数据可复制并粘贴到电子表格中以进行进一步分析。

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结果

本方案采用立体光刻技术，可制备由SU-8光刻胶制成的镶嵌式支架。所获得的支架具有不同的腔室几何形状（方形、六边形和圆形），且结构特征高度精确、可重复（图1）。

静态平衡图案：正方形、六边形、圆形。结构分析示意图。
图1：分块的正方形、圆形和六边形支架结构的代表性扫描电子显微镜图像（比例尺 = 500 µm）。

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讨论

在工程化组织内部构建丰富的血管网络对于组织构建物的存活和正常功能至关重要1。尽管血管系统的构建已受到大量研究的关注，但仍有许多机制尚待探索和阐明24。特别是，在重建特定组织时，微血管系统应表现出相应的结构特征和组织方式12。目前生成微血管最常用的方法是将内皮细胞与支持细胞共接种于一种适合细胞黏附、增殖和血管形成的三维环境中25。然而，该方法通常形成高度无序的血管网络，难以对微血管行为进行系统研究22。本文所述方案提供了一种新工具，可在高通量系统中生成高度有序的血管网络，且血管结构可随时间被方便地追踪和监测，从而用于研究其发育过程与行为特征。 内皮细胞（ECs）的逐步接种（步骤2-3），随后接种支持细胞（SCs）（步骤4），是实现此类有序网络的关键步骤22。此外，该技术为血管模型提供了真正的三维环境，使血管可在三个维度中迁...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了密歇根大学—以色列研究合作项目的资助。作者谨此感谢Uri Merdler、Lior Debbi 和Galia Ben David提供的大力支持与协助，感谢密歇根大学Lurie纳米制造中心的Nadine Wang博士和Pilar Herrera-Fierro博士，以及Luis Solorio博士在光刻技术方面富有启发性的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Angiotool 免费软件NIH-CCR可在 https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home 免费下载
牛血清白蛋白 ProbuminMillipore82-045-1
牙髓干细胞LonzaPT-5025
ECM 培养基 + 增强试剂盒Sciencell#1001
96% 乙醇Gadot-Group64-17-5
Evicel 纤维蛋白封闭剂Johnson&JohnsonEVB05IL提供凝血酶和纤维蛋白原（BAC2）溶液
GlutaMAXGibco35050061
山羊抗小鼠 Cy3 抗体Jackson115-166-072
山羊抗兔 Alexa-Fluor 488 抗体Thermo-Fisher ScientificA11034
人脂肪微血管细胞Sciencell#7200
人纤维连接蛋白SigmaF0895-5MG储存浓度：1 mg/mL
ImageJNIH可在 https://imagej.nih.gov/ij/download.html 免费下载
异丙醇Gadot-Group67-63-0
Lift-off 试剂Kayaku Advanced Materials, IncG112850商品名为 Omnicoat
低糖 DMEMBiological Industries01-050-1A
小鼠抗 SMA 抗体DakoM0851
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140068
4% 多聚甲醛 PBS 溶液ChemCruzSC-281692
青霉素-链霉素-制霉菌素溶液Biological Industries03-032-1B
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP5368-10PAK
兔抗 vWF 抗体Abcamab9378
硅晶圆Silicon Valley Microelectronics (SVM)晶圆尺寸 4"，类型 N-1-10，厚度 500–550 微米
SU-8 2050 光刻胶Kayaku Advanced Materials, IncY11058
SU-8 显影液Kayaku Advanced Materials, IncY020100
Triton-X 100BioLab LTD57836

参考文献

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