本文介绍了RatWalker系统，该系统通过重新设计MouseWalker装置，以适应大鼠更大的体型和体重。该系统采用全内反射失配（FTIR）技术、高速视频采集以及开源分析软件，用于追踪并量化步态参数。
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摘要
摘要
帕金森病（PD）是一种进行性神经退行性疾病，由黑质致密部多巴胺能（DA）神经元的丢失引起。步态异常在帕金森病患者中十分常见，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步幅缩短，且在疾病早期即已出现。因此，在帕金森病动物模型中对运动模式进行定量分析，对于疾病进程中及治疗干预后的表型特征刻画具有重要意义。大多数帕金森病病例为特发性；然而，遗传性帕金森病形式的发现揭示了相关基因突变和变异，例如Pink1和Parkin的功能丧失性突变，这两种蛋白均参与线粒体质量控制，可用于构建动物模型。小鼠在缺失Pink1和Parkin（单独或联合缺失）后对神经退行性变具有抵抗性；而在大鼠中，Pink1缺失（而非Parkin缺失）会导致黑质DA神经元丢失和运动功能障碍。本文报道了傅里叶变换红外成像（FTIR成像）技术的应用，用于检测在出现明显可见运动异常之前，联合缺失Pink1和Parkin的年轻雄性大鼠（2月龄）在自由行走时的步态变化。这些大鼠随着年龄增长（在4–6月龄时）会出现后肢拖行的表型，该表型此前已在Pink1基因敲除（KO）大鼠中被报道。
引言
帕金森病（PD）是最常见的与年龄相关的神经退行性运动障碍，由黑质致密部多巴胺（DA）神经元的丧失引起。黑质DA神经元的丢失及其向纹状体的多巴胺输入减少，导致PD患者出现明显的运动功能障碍1,2。PD患者的特征性运动表现统称为帕金森综合征，包括肌强直、静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和小写症3。此外，步态异常在PD患者中十分常见，并在疾病早期即已出现1,4,5。尽管某些生活方式（如健康饮食和规律锻炼）被认为有助于延缓PD的进展，但目前尚无治愈PD的方法，仅能通过药物缓解症状。因此，仍需进一步研究，以期开发更有效的治疗手段。因此，对PD动物模型步态模式的表征，是评估模型相关性以及针对PD的治疗干预是否能够预防或改善运动功能障碍的关键工具。
已有多种帕金森病（PD）动物模型被用于测试治疗方法，但每种模型均有其局限性。例如，使用神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）处理的动物模型，已提供了大量关于黑质多巴胺（DA）神经元丢失及其后续纹状体适应过程的重要信息，并揭示了线粒体在PD发病机制中的作用；然而，MPTP模型的致病背景属于毒性机制，而非人类PD中典型的神经退行性过程6。其他化学诱导模型包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）和鱼藤酮。6-OHDA是首个通过在DA神经元中选择性蓄积从而诱导PD的试剂，最终导致神经元死亡并产生类似PD的症状。该模型最初用于通过检测动物对苯丙胺和阿扑吗啡的行为反应来追踪DA的耗竭情况7。这种PD诱导方法已被证明在筛选影响DA及其受体的药理学物质方面具有实用价值8。尽管6-OHDA模型在追踪可量化运动功能障碍方面效果显著，但该模型无法反映神经元逐渐丢失以及路易小体形成对动物的影响。另一种诱导方法——鱼藤酮模型，已被证实可导致黑质-纹状体神经元进行性退变，并伴随酪氨酸羟化酶和DA转运体的减少，因而更适用于长期追踪神经元丢失过程9。经鱼藤酮处理的大鼠表现出运动迟缓、姿势不稳和步态不稳等症状10。然而，该方法在不同品系大鼠之间表现出显著差异，因而引发了关于鱼藤酮是否为可靠PD模型的质疑11,12,13。尽管已有研究表明PD诱导会影响大鼠的步态分析，但截至目前，基因诱导的PD大鼠模型尚未被广泛用于自由行走状态下的步态分析。
分析自由行走啮齿类动物运动功能障碍的一种方法是运动学步态分析，该方法可通过全内反射成像（FTIR）实现。这一成熟的技术基于FTIR光学触觉传感器，能够在啮齿动物沿跑道移动时记录并追踪其足印14,15,16。与其他方法相比，FTIR不依赖于动物体表的任何标记物，因而不会干扰足印的采集。视频数据的生成可获得四肢的数字化足印，进而整合为多种啮齿类模型的动态且可重复的行走模式。基于成像的步态分析原理是针对每个单独的足爪，测量其在沿跑道行走过程中与地面接触面积随时间的变化。每次站立相表现为足爪接触面积的增加（制动阶段）和随后的面积减小（推进阶段）。之后进入摆动相，此时无足爪信号被检测到。视频分析完成后，可生成多个参数，用于比较野生型（WT）与帕金森病（PD）模型之间的差异。部分参数示例包括：步长（单步中足爪移动的距离）、摆动持续时间（足爪脱离跑道的时间长度）、摆动速度（步长与摆动持续时间的函数关系）以及步态模式（对角步、侧向步或骨盆带步）。
为了验证傅里叶变换红外光谱（FTIR）在揭示大鼠早期步态模式变化方面的实用性，我们采用了一种帕金森病（PD）的遗传性大鼠模型。尽管大多数PD病例为特发性；但遗传性PD形式的发现揭示了与该病相关的基因突变和变异，例如Pink1和Parkin这两个参与线粒体质量控制的蛋白发生的功能丧失性突变17，这些突变可用于构建动物模型18。遗憾的是，小鼠在缺失这些蛋白（单独或联合缺失）后对神经变性具有抵抗性19,20,21。在大鼠中，Pink1缺失（而非Parkin缺失）会导致黑质多巴胺（DA）神经元丢失和运动功能障碍22，但外显不完全。因此，我们构建了一种Pink1/Parkin双基因敲除（DKO）大鼠模型，该模型表现出先前在雄性Pink1基因敲除（KO）大鼠中报道的明显可见的后肢拖曳表型22，且发生率显著提高：在4至6个月龄的雄性大鼠中，发生率从30–50%上升至100%。
尽管该方法在分析小鼠运动功能缺陷方面效果良好14，但此前尚无非商业化的傅里叶变换红外成像（FTIR）步态系统能够满足大鼠的体型和体重需求。本文介绍了如何构建RatWalker，这是一种基于MouseWalker14改进而来的FTIR步态成像系统，但已针对大鼠的体型和体重进行了适应性调整。该系统利用一种光学效应——傅里叶变换红外成像（FTIR），实现对动物足印的可视化，并进而记录用于分析。当动物足部接触光波导（平台）时，会干扰光路，产生可见的散射效应，该效应通过民用级高速摄像设备捕获，并使用开源软件进行处理。本研究展示了FTIR成像技术在研究帕金森病（PD）遗传性大鼠模型步态变化中的强大能力。例如，尽管雄性DKO大鼠最早在4个月龄时才出现明显的视觉可辨运动异常（如后肢拖行），但利用FTIR技术，我们能够在雄性DKO大鼠2个月龄时即发现其步态异常。
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方案
所有动物实验均经内布拉斯加大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 步态装置
注意：RatWalker 参照 MouseWalker14 设计，其尺寸根据大鼠与小鼠步长的差异按比例调整。该装置由侧面照明背光、行走通道外壳、光波导行走通道、反射镜和相机组成（图 S1）。在行走通道和背光波导的两侧，采用交错排列的 LED 灯带，以适应额外的材料结构。表 S1 列出了构建改进型步态装置所需的材料。
- 使用背光（图 S2）生成动物的轮廓影像，供软件用于确定其位置、运动方向及形态测量特征。背光装置由亚克力扩散板、光波导、反射层和LED灯带分层组成，并安装于标准铝制框架内（表 S1）。
- 使用通道围栏（图 S3）引导动物沿平台行进并将其导向巢穴笼。该围栏由透明亚克力板经二氯甲烷溶剂焊接而成（表 S2）。
- 使用行走通道（图 S4）作为产生发光脚印的介质。该通道由透明亚克力制成，通过侧边LED灯带照明，并固定于铝制角槽中（表 S3）。
- 在行走通道正下方以45度角放置一面镜子（图 S5），用于反射通道底面以便摄像。该装置由一块1/4"厚的玻璃镜组成，由亚克力材料和成排的角撑板支撑并固定成所需角度（表 S4）。
- 使用三脚架固定的民用级高速运动相机进行视频拍摄。
2. 仪器设备设置
- 根据图S1，将背光源、行走道和反射镜对齐，放置在实验台、工作台或稳定的推车上。确保每个组件相对于行走道居中。
- 使用水平仪，确保各组件水平对齐。
- 将行走道外壳安装在行走道上方。
- 使用70%乙醇清洁所有接触表面。务必使用非研磨性擦拭布，以防划伤行走道表面。
- 将高速摄像机安装在57英寸三脚架上，并置于反射镜中线位置，距离足够远以确保整个行走道均位于视野范围内。在视频设置菜单中，确保高速摄像机设置为1080p模式下以每秒120帧（fps）进行线性采集，并关闭任何自动调节或优化功能。
- 插入并打开背光源和行走道的LED灯带。可能需要调暗背光源以减少背景干扰。
3. 动物适应
注意：在首次实验前一周，让动物通过改良的步态装置进行训练。
- 将鼠笼放置在步道末端。
- 安装好围栏并关闭灯光后，将大鼠置于步道远离鼠笼的一端，使其以非强迫方式自然走过步道。
- 让每只大鼠多次通过改良的步态装置，直至其能够顺畅地走完整个步道。
- 在实验前两天重复该过程。
4. 步态实验步骤
- 每次运行开始前，在步道末端放置一个鼠笼，作为大鼠穿越步道的正向提示。
- 关闭房间灯光，打开摄像机，并在将大鼠放置于平台前数秒开始录制。
注意：务必使用相机制造商官方推荐的存储卡。未列明的存储卡可能仍可使用，但无法保证以标称帧率进行完整录制。 - 安装好围栏后，将大鼠置于步道远离鼠笼的一端，使其以无强迫方式自行走过步道。
- 当动物到达步道终点时，停止录制。
- 每次运行之间，以及动物排尿或排便后，使用70%乙醇和非研磨性毛巾清洁步道，并在引入下一只动物前让乙醇完全挥发。
- 在每次观察期间，让大鼠通过步道共7次，选取其中前3次符合通过标准的运行用于分析。
- 若动物朝鼠笼方向连续迈出四步或以上，且过程中未因理毛、停顿或偏离动作而中断，则记该次运行为通过。
注意：建议在每次测量前记录动物的体重。在本研究中，WT（n = 7）和 DKO（n = 8）的体重分别为 200.3 ± 21.67 g 和 296.6 ± 3.85 g（p = 0.004，Welch 校正的非配对 t 检验）。我们未发现任何年龄或体型的大鼠存在实验适用性问题。
5. 视频预处理
注意：高速摄像机拍摄的视频以每秒120帧、1080p分辨率的mp4格式呈现。为减轻后续分析软件的处理负担，首先使用LosslessCut软件（版本3.23.7，https://github.com/mifi/lossless-cut）裁剪掉不必要的视频片段并移除各视频中的音频，然后使用开源软件FFmpeg（版本4.2，http://ffmpeg.org/）将mp4视频流转换为png图像序列。注意：也可使用其他无损格式（如tiff）替代png。
- 在运行 Windows 7 或更高版本操作系统的计算机上创建一个用于存放视频的目录，然后将高速摄像机存储设备中的视频传输至该新建目录中。此外，将 ffmpeg.exe 复制到同一目录下。
- 在 LosslessCut 中，将视频拖拽至界面以打开。删除音频，设置起始和结束剪切点，仅保留视频中具有分析意义的部分，将捕获帧格式设置为 png，然后导出。视频导出后，使用任意命名规则对视频文件进行重命名，并在文件名末尾添加 "_trimmed"。
- 为批量将视频转换为图像序列，请打开命令提示符，使用 "cd [路径到目录]" 命令将工作目录设置为视频所在位置，然后运行以下命令：
for %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
for %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed.MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - 批量处理完成后，在 ImageJ Fiji23 中打开每个图像序列，并将序列裁剪至感兴趣区域（ROI），该区域应包含大鼠活动范围内的地面区域。
- 为减少步道照明带来的背景干扰，将青色通道的颜色平衡最小值提高至 76。
- 将图像序列另存为文件，并将 "_trimmed" 后缀更改为 "_cropped"，将文件保存至对应的 "_cropped" 文件夹中。
6. 步态处理
注意：步态数据使用免费软件 MouseWalker 进行处理和量化（http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/）14。
- 将 MouseWalker 软件解压并安装到一台运行 64 位 Windows 环境且已安装 Microsoft Excel 的 PC 上。
- 启动 MouseWalker.exe 后，为每组运行执行初始尺度校准。加载图像序列，并利用视频中捕获的解剖标志或标尺，测量两个已知距离的点。计算视频帧中每厘米对应的像素数，并将该值连同视频采集帧率一并输入设置表单的参数部分。
- 类似地，测量大鼠的头部、尾部和足部，以确定头长、尾部最大宽度和面积、足部最小与最大面积，以及其他完成 MouseWalker 设置表单中跟踪参数部分所需的特征。用户手册及其他文档请参见 http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ 。
- 为获得身体区域数值，使用 ImageJ 打开相同的图像序列，绘制选区以勾勒大鼠轮廓，并执行感兴趣区域（ROI）的像素计数。
- 本出版物所使用的参数与设置（图 S6）。
注意：所提供的参数仅作示例之用，实际参数取决于视频尺度、采集硬件及实验条件。每次重新调整相机或设备位置后，均需重新进行软件校准与调整。在采集画面中包含测量装置可提高准确性并便于校准。 - 完成校准后，加载每段图像序列。选择“自动”将启动足印的自主分配。
- 逐帧浏览序列，手动修正分配错误的足印。完成此步骤后保存结果。
- 最后，选择“评估”以处理足印位置和压力数据。系统将导出一系列图表、图像以及包含定量步态指标的电子表格至结果文件夹中。
7. 数据分析
- 使用每次评估结束时导出的电子表格，其中包含每次运行的定量步态数据。合并每次运行的数据，并按每只大鼠进行平均。使用 GraphPad Prism 7.0a 版本绘制平均数据并进行显著性检验。
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结果
大鼠品系维持
Pink1 和 Parkin 单基因敲除大鼠的构建与鉴定此前已有描述22。Pink1 和 Parkin 单基因敲除大鼠购自 SAGE Labs（现可通过 Envigo 获得）。双基因敲除（DKO）大鼠通过将 Pink1-/- 大鼠与 Parkin-/- 大鼠杂交获得 Pink1+/-/Parkin+/- 子代，再经互交得到 Pink1-/-/Parkin-/- 大鼠（即将通过 Envigo 提供）。为确认 Park6（编码 Pink1 的基因）中 26 bp 的缺失，采用 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' 为正向引物和 5'-CCACCACCCACTACCACTTACT-3' 为反向引物进行基因型鉴定。对于 Park2（编码 Parkin 的基因）中 5 bp 的缺失，则使用正向引物 ...
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讨论
步态障碍是帕金森病（PD）的典型特征，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步幅缩短，这些症状在疾病早期即可出现1,5。多年来，已发展出多种方法用于观察和记录PD啮齿类动物模型中的足印，以进行步态分析，从最初手动量化足印位置的方法，逐步发展为更敏感、能够捕捉动态参数的自动化方法。一些静态方法包括使用指示剂对啮齿类动物的足爪进行"染色"，使其在走过铺设于通道上的记录介质时留下足迹24,25,26。随后通过人工对残留的足印进行量化分析。这些方法通常与视频录像结合使用，以进行手动运动学评分。近年来，出现了更为自动化的步态模式采集与量化方法15,16，并已有商业化系统可供使用。自动步态量化技术为原本静态的足印增加了时间...
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
KS 和 HF 感谢迈克尔·J·福克斯帕金森病研究基金会对其帕金森病研究工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝 | |||
| 1.5” 铝角材（1/8” - 6063) | 尺寸：8' 数量：8 | ||
| 1” 铝制方管（1/16）” - 6063) | 尺寸：8' 数量：4 | ||
| 32号铝板 | 尺寸：10' 数量：1 | ||
| 1” 铝管（1/8” - 6063) | 尺寸：8' 数量：1 | ||
| 丙烯酸树脂 | |||
| 7/32” 透明亚克力板 | 尺寸：4英尺×8英尺' 数量：2 | ||
| 1/8” 白色亚克力板 55%（2447） | 尺寸：4英尺×8英尺' 数量：1 | ||
| 镜像 | |||
| 7/32” 玻璃镜 | 尺寸：60"x12" 数量：1 | ||
| LED | |||
| 5050 LED灯带（绿色） | 尺寸：16.4' 数量：1 | ||
| 5050 LED灯带（红色） | 尺寸：16.4' 数量：1 | ||
| 相机 | |||
| GoPro Hero 6 Black | 数量：1 | ||
| 三脚架 | 尺寸：57" 数量：1 |
参考文献
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