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方法文章

从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

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DOI：

10.3791/62005

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2021年1月25日

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

本文内容

摘要

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。

摘要

对脂肪细胞分化和功能机制的理解在很大程度上得益于永生化白色前脂肪细胞系的应用。然而，这些培养的细胞系存在局限性，无法完全反映目前已知存在于白色脂肪组织库中异质性脂肪细胞群体的多样化功能谱。为了提供一种更具生理相关性的模型以研究白色脂肪组织的复杂性，已开发并优化了一种实验方案，可实现从新生小鼠中同时分离原代白色和棕色脂肪细胞前体细胞、在体外快速扩增，并进一步诱导其分化为成熟且功能完整的脂肪细胞。相较于成年小鼠，从新生小鼠中分离原代细胞的主要优势在于其脂肪组织库正处于活跃发育阶段，因此是增殖性前脂肪细胞的丰富来源。采用本方案分离的原代前脂肪细胞在达到汇合后可迅速分化，并在4–5天内完全成熟，这一时间窗口准确反映了新生小鼠体内脂肪垫的发育过程。利用该策略制备的原代培养细胞可实现高效扩增和高度可重复的研究，适用于基因筛选和表型筛选，并可用于研究遗传性小鼠模型中脂肪细胞自主性的表型特征。本方案为在体外研究脂肪组织的复杂性提供了一种简单、快速且经济的方法。

引言

肥胖是由于能量摄入与能量消耗之间长期失衡所致。随着肥胖的发展，白色脂肪细胞发生显著的细胞体积增大，导致微环境中出现缺氧、细胞死亡、炎症以及胰岛素抵抗1。功能失调且肥大的脂肪细胞无法有效储存过量脂质，这些脂质转而积聚于其他组织中，从而抑制胰岛素的作用2,3。能够改善脂肪细胞功能并恢复组织间正常脂质分布的干预手段，被认为有望用于治疗以胰岛素抵抗为特征的肥胖相关疾病，例如2型糖尿病。利用永生化细胞系（如3T3-L1、F442A和10T ½）在脂肪细胞中进行表型筛选，已被证实有助于鉴定调控脂肪生成的遗传因子，并分离出具有抗糖尿病特性的促脂肪生成分子4,5,6,7。然而，这些细胞系并不能完全反映脂肪组织库中细胞类型的异质性，后者包括白色、棕色、米色及其他具有独特特性的脂肪细胞亚型，这些细胞共同参与机体系统的稳态调节8,9,10。此外，培养的细胞系对外部刺激的反应能力通常较弱。

相比之下，原代脂肪细胞的培养能更准确地重现体内脂肪生成的复杂性，且原代脂肪细胞表现出显著的功能性反应。原代前脂肪细胞通常从成年小鼠脂肪组织的基质血管组分中分离获得11,12,13,14。然而，由于成年动物的脂肪库主要由完全成熟的脂肪细胞组成，其更新速率极慢15,16,17，因此该方法获得的前脂肪细胞数量有限，且增殖速率较低。因此，从新生小鼠中分离前脂肪细胞更为理想，可获得大量快速增殖的细胞，并能在体外进行分化。本文描述了一种受Kahn等人18早期关于原代棕色脂肪细胞研究启发的方案，可高效分离白色和棕色前脂肪细胞，并在体外扩增和分化为功能完整的原代脂肪细胞（图1A）。与从成年小鼠相比，从新生小鼠分离原代细胞的优势在于，其脂肪库正处于快速生长阶段，因而富含活跃增殖的前脂肪细胞17。采用本方案分离的细胞具有较高的增殖能力，可实现培养体系的快速扩增。此外，新生小鼠来源的前脂肪细胞比成年个体的前体细胞具有更高的分化潜能，从而降低不同培养孔间分化程度的差异，提高实验的可重复性。

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方案

本方案遵循斯克里普斯研究所和威斯康星大学麦迪逊分校医学院与公共卫生学院的动物护理与使用委员会（IACUC）所有指导原则。

1. 脂肪组织库的采集与消化（第1天）

  1. 为每只幼鼠准备两个1.5 mL离心管：一个用于棕色脂肪组织（BAT），另一个用于白色脂肪组织（WAT）。向每管中加入250 µL磷酸盐缓冲液（PBS）和200 µL 2倍分离缓冲液（123 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl2、5 mM葡萄糖、100 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、青霉素-链霉素和4%无脂肪酸牛血清白蛋白）。保持溶液无菌并置于冰上。
  2. 将幼鼠放入小容器中（例如6孔板的一个孔），并将其置于冰上直至出现低体温状态。确保幼鼠不与冰直接接触。用尖头刺破足垫以确认意识丧失，并使用锋利剪刀通过断头法处死幼鼠。
    注意：若处理不同基因型的小鼠，需额外准备一个离心管以收集尾部组织样本（剪取约3 mm）用于基因分型。若立即进行基因分型，则将处死后的幼鼠保持在冰上，直至解剖以收集脂肪组织库。
  3. 计算并称取消化所有脂肪组织库所需的胶原酶量。向每管中加入50 µL浓度为15 mg/mL的I型胶原酶（溶于2倍分离缓冲液中）。在所有组织收集完成前，不要将胶原酶重新悬浮于分离缓冲液中。
  4. 为收集皮下WAT，沿幼鼠腹部切开皮肤（避免刺破腹膜），轻轻将皮肤向下拉至腿部以下。在不取下皮肤的情况下，小心采集脂肪组织库，该组织呈透明（P1或更小）或白色（P2及以上）、薄而细长的形态，附着于股四头肌内侧或上方（图1B）。用PBS冲洗脂肪组织库后，将其放入含有250 µL PBS + 200 µL 2倍分离缓冲液的离心管中，并置于冰上。
    注意：P0和P1小鼠可获得最佳产量。在P0-1幼鼠中，皮下WAT组织库几乎透明；而在P2及以上小鼠中，由于组织已开始变白，提示存在完全成熟且富含脂滴的白色脂肪细胞，因此更易于识别。
  5. 为收集肩胛间BAT，将肩胛区域的皮肤拉过头部。提起肩胛骨之间的深红色组织即为BAT，并在其周围小心剪切，使其与身体分离（图1B）。检查其一致性和颜色；用PBS冲洗；将其放入另一含有250 µL PBS + 200 µL 2倍分离缓冲液的离心管中；并置于冰上。
    注意：从P2及以上小鼠中采集BAT时，应仔细去除包围BAT的白色脂肪组织。该组织为一层位于皮肤与BAT之间的薄而柔软的白色脂肪细胞层，在肩胛骨之间位置更深。
  6. 在所有脂肪组织库收集完毕后，使用小剪刀在各离心管内直接将每个组织库轻轻剪碎4–6次。
  7. 将I型胶原酶溶于适量2倍分离缓冲液中，配制成15 mg/mL的10倍储存液。向每管中加入50 µL 10倍胶原酶溶液，在所有管中加完胶原酶前始终保持离心管置于冰上。
  8. 快速颠倒混匀各管，然后转移至温控混合仪中。在37 °C条件下于摇床中孵育30分钟（频率1,400 rpm，以实现有效样品混合）。

2. 接种前脂肪细胞（第1天）

  1. 消化组织后，将试管放回冰上。
    注意：从这一步开始，所有操作均需在生物安全柜内的无菌条件下进行。
  2. 将消化后的组织通过100 µm细胞筛过滤至新的50 mL离心管中。若仅使用野生型小鼠，或基因型已知，可将相应解离的棕色脂肪组织（BAT）合并；白色脂肪组织（WAT）同样处理。为最大化细胞得率，用1 mL分离培养基（DMEM高糖培养基 + 20% 胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES、1% 青霉素-链霉素）冲洗每个离心管，并通过细胞筛过滤。若基因型未知，则进入步骤2.4。
    注意：FBS是前脂肪细胞增殖与分化的重要决定因素。必须严格测试不同批次的FBS，以确保其性能优良且批次间一致性高。
  3. 将BAT和WAT细胞悬液稀释后，分别接种至6孔板中，每份BAT样本接种2–3孔，每份WAT样本接种4–6孔。例如，若合并了6个BAT样本和6个WAT样本，则将BAT细胞悬液稀释至24–36 mL，WAT细胞悬液稀释至48–72 mL。每孔接种2 mL细胞悬液。
  4. 对于基因型未知的样本，需保持各样本独立；将100 µm细胞筛置于6孔板的每个孔上，每孔过滤一个样本。用1.5 mL分离培养基冲洗离心管，并将冲洗液通过细胞筛滤入孔中，最终每孔体积为2 mL。弃去细胞筛，盖上培养板盖，将培养板转移至培养箱中。
    注意：由于存在漂浮的血细胞、细胞碎片以及裂解细胞释放的脂质，孔内培养基应呈现浑浊状态 。
  5. 接种后1–1.5小时，吸除培养基 ，并用2 mL无血清DMEM洗涤。轻轻振荡培养板，使血细胞从孔底脱落。经过3次洗涤后，加入2 mL新鲜分离培养基，将细胞转移至培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。
    注意：在显微镜下观察细胞。漂浮物（血细胞、细胞碎片）应尽可能少。棕色前脂肪细胞呈小而无透明感的形态，白色前脂肪细胞则呈更细长的形态。棕色和白色前脂肪细胞均应牢固贴附于培养板表面。

3. 前脂肪细胞培养的扩增（第2天至第5天）

  1. 第二天，吸除培养基，用 2 mL 无血清 DMEM 洗涤细胞，然后加入 2 mL 分离培养基。
  2. 每 2 天重复一次步骤 3.1，直至细胞达到 80–90% 汇合度。
    注意：原代棕色前脂肪细胞通常需要 4–5 天达到 80–90% 汇合度，而原代白色前脂肪细胞通常需要 2–3 天。当前脂肪细胞达到 60% 汇合度时，可高效感染病毒颗粒以进行基因敲低或过表达实验。使用适当的病毒感染量感染前脂肪细胞，时间不超过 8 小时。不建议使用阳离子聚合物以提高感染效率，因其常导致细胞毒性，并显著降低被感染前脂肪细胞的脂肪生成潜能。
  3. 传代细胞时，使用 0.1% w/v 明胶的无菌溶液（溶于蒸馏水中；切勿加热）包被新的培养容器。加入足够体积以覆盖培养孔/皿底部。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育，直至细胞准备接种（至少 10 分钟）。
    注意：此步骤为可选。包被细胞培养板不会影响细胞产量或分化潜能，但可显著简化分化中脂肪细胞的维持与操作。
  4. 当细胞达到亚汇合密度（85–95%）时，吸除培养基，用 PBS 洗涤，加入胰酶消化 3 分钟以使细胞脱落。加入胰酶体积 2.5 倍的分离培养基以终止胰酶活性。反复吹打细胞悬液以最大程度回收细胞，并转移至新离心管中。用 1 mL 分离培养基冲洗培养孔，将冲洗液并入初次收集液中。
  5. 将细胞在 800–1200 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液，用 3–5 mL 分离培养基重悬细胞。计数细胞，并稀释至所需终浓度。
    注意：例如，以 50,000–80,000 个细胞/mL 的密度接种（分别对应 6、12 和 24 孔板加入 2.5、1 和 0.5 mL）可在 72–96 小时内达到完全汇合。
  6. 吸除步骤 3.3 中的包被液，用 PBS 洗去多余明胶。接种细胞后，将培养板放回培养箱中继续培养至完全汇合。

4. 白色和棕色前脂肪细胞的分化（第7 - 12天）

  1. 当脂肪前体细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并更换为成脂分化培养基，该培养基由含10%胎牛血清（FBS）的DMEM组成，其中包含170 nM胰岛素、1 µM地塞米松和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。若为棕色脂肪（BAT）前体细胞进行分化，还需添加1 nM三碘甲腺原氨酸（T3）。将诱导成脂分化的当天记为分化的第0天。
    注意：白色和棕色脂肪前体细胞在达到汇合后均可自发分化。然而，为最大程度促进脂肪细胞分化，应使用上述传统的促脂肪生成诱导剂组合（棕色脂肪前体细胞额外添加T3）。
  2. 48小时后（分化的第2天），更换为维持培养基，该培养基由含10% FBS的DMEM和170 nM胰岛素组成（棕色脂肪细胞额外添加1 nM T3）。
    注意：在第2天，通过标准明场显微镜观察，可见细胞内开始出现少量脂滴积累。
  3. 此后每2天重复步骤4.2一次，直至细胞用于实验。
    注意：在分化的第4至第5天，大多数细胞将呈现富含脂质的状态。终末分化的脂肪细胞可继续在体外培养更长时间，或在此阶段直接用于实验。

5. 生物能量学实验的重新铺板

注意：如果计划在96孔板中对成熟脂肪细胞进行生物能量学研究，则需执行以下步骤。理想情况下，应使用刚刚完全分化（第4或第5天）的细胞。以下所述操作步骤从6孔板中的1个孔开始。

  1. 胰蛋白酶消化前，准备96孔板的包被。向每孔加入50 µL 0.1%明胶。将板置于组织培养孵箱中，直至细胞准备接种。
  2. 在分化第4或第5天，吸除培养基，用1 mL PBS洗涤，然后加入300 µL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（适用于6孔板的1个孔）。轻轻倾斜培养板，确保胰蛋白酶完全覆盖孔底；室温孵育2分钟。加入700 µL维持培养基以终止胰蛋白酶作用，用移液器反复吹打以最大程度回收细胞，并将细胞悬液转移至新的1.5 mL离心管中。
  3. 以1200 × g 离心5分钟。弃上清，将沉淀重悬于1 mL维持培养基中，并计数细胞。
    注意：6孔板中的1个孔通常可获得约150万至180万个细胞。
  4. 将细胞稀释至终浓度为：棕色脂肪细胞60,000至80,000个细胞/mL，白色脂肪细胞100,000至120,000个细胞/mL。每孔接种100 µL细胞悬液至明胶包被的96孔板中。
    注意：6孔板中的1个孔所提供的细胞数量最多可接种两个96孔板。对于生物能量学实验，需采用低密度接种（30–40%融合度），以便准确测量耗氧量，并避免在检测过程中孔内氧气耗尽。
  5. 让细胞贴壁至少48小时。若细胞在板中培养超过48小时，应在2天后更换培养基。
  6. 检测当天，吸除培养基，更换为检测用培养基。在37 °C、无CO2控制的孵箱中孵育1小时，然后按照试剂盒说明书进行检测。

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结果

实验方案的第1部分将获得可在标准光学显微镜下观察到的异质性细胞悬液。通过细胞筛网过滤消化后的组织（第2部分）可去除未消化的组织。然而，部分细胞碎片、血细胞以及成熟脂肪细胞仍可穿过筛网（图1C）。接种后1小时进行轻柔洗涤，可去除非相关细胞，因为前脂肪细胞会迅速贴附于培养孔底部（图1C）。在第3部分中，通过扩增脂肪细胞前体细胞，以获得实验计划所需的细胞数量。尽管从新生小鼠中分离的白色和棕色前脂肪细胞均具有较高的增殖能力，但按每脂肪库计算，白色前脂肪细胞的产量通常约为棕色前脂肪细胞的两倍（图2A）。因此，若需获得同步化的细胞培养体系，必须相应地计算白色前脂肪细胞的起始接种密度。第4部分提供了获得完全成熟脂肪细胞的操作指南。

分化结束时，细胞将充满脂滴，并分别表达白色和棕色脂肪细胞的...

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讨论

脂肪组织对全身胰岛素敏感性和葡萄糖稳态至关重要20。与肥胖相关的脂肪细胞功能障碍与2型糖尿病的发生密切相关。因此，深入理解脂肪组织的基本生物学和生理学特性，可能有助于设计针对代谢性疾病的新型治疗方法。除了直接对从脂肪库中分离的成熟脂肪细胞进行功能和转录分析21,22外，体外培养的原代脂肪细胞已被证明能够重现脂肪组织病理生理学的多个方面，包括脂肪因子的分泌、在促炎刺激下产生胰岛素抵抗，以及产热程序的激活23,24,25。尽管已有先前的实验方案描述了从成年小鼠中分离脂肪细胞前体的方法11,12，但本方案提供了一种高效分离新生幼鼠细胞的方法。该策略可获得数量显著更多的白色和棕色脂...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢西班牙马德里国家生物技术中心的 Cristina Godio、加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所的 Mari Gantner 以及马里兰州巴尔的摩约翰斯·霍普金斯大学的 Anastasia Kralli，他们在 Kahn 等人最初研究的基础上协助优化了本实验方案18。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DK114785 和 DK121196，授予 E.S.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）Sigma-AldrichI7018
6孔板Corning353046
AdipoRed（尼罗红）LonzaPT-7009
抗霉素ASigma-AldrichA8674
基准胎牛血清Gemini Bioproducts LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
细胞筛Fisher Scientific22363549
胶原酶I型  Worthington Biochemical CorpLS004196
ddH2OSigma-Aldrich6442
地塞米松Sigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030用于生物能量学研究
DMEM，高糖，含GlutamaxGibco10569010
不含钙、镁的DPBSGibco14190144
脂肪酸游离型BSASigma-AldrichA8806
FCCPSigma-AldrichC2920
明胶Sigma-AldrichG1890
葡萄糖Sigma-AldrichG7021
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
胰岛素Sigma-AldrichI6634
KClSigma-AldrichP9333
NaClSigma-AldrichS7653
去甲肾上腺素Cayman Chemical16673
寡霉素Sigma-Aldrich75351
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）Gibco15140122
罗格列酮Sigma-AldrichR2408
鱼藤酮Sigma-Aldrich557368
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100用于生物能量学研究
外科镊子ROBOZ Surgical Instrument CoRS-5158
外科剪刀ROBOZ Surgical Instrument CoRS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
三碘甲腺原氨酸（T3）Sigma-Aldrich642511

参考文献

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