从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

摘要

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。

摘要

对脂肪细胞分化和功能机制的理解在很大程度上得益于永生化白色前脂肪细胞系的应用。然而，这些培养的细胞系存在局限性，无法完全反映目前已知存在于白色脂肪组织库中异质性脂肪细胞群体的多样化功能谱。为了提供一种更具生理相关性的模型以研究白色脂肪组织的复杂性，已开发并优化了一种实验方案，可实现从新生小鼠中同时分离原代白色和棕色脂肪细胞前体细胞、在体外快速扩增，并进一步诱导其分化为成熟且功能完整的脂肪细胞。相较于成年小鼠，从新生小鼠中分离原代细胞的主要优势在于其脂肪组织库正处于活跃发育阶段，因此是增殖性前脂肪细胞的丰富来源。采用本方案分离的原代前脂肪细胞在达到汇合后可迅速分化，并在4–5天内完全成熟，这一时间窗口准确反映了新生小鼠体内脂肪垫的发育过程。利用该策略制备的原代培养细胞可实现高效扩增和高度可重复的研究，适用于基因筛选和表型筛选，并可用于研究遗传性小鼠模型中脂肪细胞自主性的表型特征。本方案为在体外研究脂肪组织的复杂性提供了一种简单、快速且经济的方法。

引言

肥胖是由于能量摄入与能量消耗之间长期失衡所致。随着肥胖的发展，白色脂肪细胞发生显著的细胞体积增大，导致微环境中出现缺氧、细胞死亡、炎症以及胰岛素抵抗¹。功能失调且肥大的脂肪细胞无法有效储存过量脂质，这些脂质转而积聚于其他组织中，从而抑制胰岛素的作用^2,3。能够改善脂肪细胞功能并恢复组织间正常脂质分布的干预手段，被认为有望用于治疗以胰岛素抵抗为特征的肥胖相关疾病，例如2型糖尿病。利用永生化细胞系（如3T3-L1、F442A和10T ½）在脂肪细胞中进行表型筛选，已被证实有助于鉴定调控脂肪生成的遗传因子，并分离出具有抗糖尿病特性的促脂肪生成分子^4,5,6,7。然而，这些细胞系并不能完全反映脂肪组织库中细胞类型的异质性，后者包括白色、棕色、米色及其他具有独特特性的脂肪细胞亚型，这些细胞共同参与机体系统的稳态调节^8,9,10。此外，培养的....

方案

本方案遵循斯克里普斯研究所和威斯康星大学麦迪逊分校医学院与公共卫生学院的动物护理与使用委员会（IACUC）所有指导原则。

1. 脂肪组织库的采集与消化（第1天）

1. 为每只幼鼠准备两个1.5 mL离心管：一个用于棕色脂肪组织（BAT），另一个用于白色脂肪组织（WAT）。向每管中加入250 µL磷酸盐缓冲液（PBS）和200 µL 2倍分离缓冲液（123 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl₂、5 mM葡萄糖、100 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、青霉素-链霉素和4%无脂肪酸牛血清白蛋白）。保持溶液无菌并置于冰上。
2. 将幼鼠放入小容器中（例如6孔板的一个孔），并将其置于冰上直至出现低体温状态。确保幼鼠不与冰直接接触。用尖头刺破足垫以确认意识丧失，并使用锋利剪刀通过断头法处死幼鼠。
   注意：若处理不同基因型的小鼠，需额外准备一个离心管以收集尾部组织样本（剪取约3 mm）用于基因分型。若立即进行基因分型，则将处死后的幼鼠保持在冰上，直至解剖以收集脂肪组织库。
3. 计算并称取消化所有脂肪组织库所需的胶原酶量。向每管中加入50 µL浓度为15 mg/mL的I型胶原酶（溶于2倍分离缓冲液中）。在所有组织收集完成前，不要将胶原酶重新悬浮于分离缓冲液中。
4. 为收集皮下WAT，沿幼鼠腹部切开皮肤（避免刺破腹膜），轻轻将皮肤向下拉至腿部以下。在不....

结果

实验方案的第1部分将获得可在标准光学显微镜下观察到的异质性细胞悬液。通过细胞筛网过滤消化后的组织（第2部分）可去除未消化的组织。然而，部分细胞碎片、血细胞以及成熟脂肪细胞仍可穿过筛网（图1C）。接种后1小时进行轻柔洗涤，可去除非相关细胞，因为前脂肪细胞会迅速贴附于培养孔底部（图1C）。在第3部分中，通过扩增脂肪细胞前体细胞，以获得实验计划所需的细胞数量。尽管从新生小鼠中分离的白色和棕色前脂肪细胞均具有较高的增殖能力，但按每脂肪库计算，白色前脂肪细胞的产量通常约为棕色前脂肪细胞的两倍（图2A）。因此，若需获得同步化的细胞培养体系，必须相应地计算白色前脂肪细胞的起始接种密度。第4部分提供了获得完全成熟脂肪细胞的操作指南。

分化结束时，细胞将充满脂滴，并分别表达白色和棕色脂肪细胞的.......

讨论

脂肪组织对全身胰岛素敏感性和葡萄糖稳态至关重要²⁰。与肥胖相关的脂肪细胞功能障碍与2型糖尿病的发生密切相关。因此，深入理解脂肪组织的基本生物学和生理学特性，可能有助于设计针对代谢性疾病的新型治疗方法。除了直接对从脂肪库中分离的成熟脂肪细胞进行功能和转录分析^21,22外，体外培养的原代脂肪细胞已被证明能够重现脂肪组织病理生理学的多个方面，包括脂肪因子的分泌、在促炎刺激下产生胰岛素抵抗，以及产热程序的激活^23,24,25。尽管已有先前的实验方案描述了从成年小鼠中分离脂肪细胞前体的方法^11,12，但本方案提供了一种高效分离新生幼鼠细胞的方法。该策略可获得数量显著更多的白色和棕色脂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）	Sigma-Aldrich	I7018
6孔板	Corning	353046
AdipoRed（尼罗红）	Lonza	PT-7009
抗霉素A	Sigma-Aldrich	A8674
基准胎牛血清	Gemini Bioproducts LLC	100-106
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
细胞筛	Fisher Scientific	22363549
胶原酶I型	Worthington Biochemical Corp	LS004196
ddH2O	Sigma-Aldrich	6442
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902
DMEM	Sigma-Aldrich	D5030	用于生物能量学研究
DMEM，高糖，含Glutamax	Gibco	10569010
不含钙、镁的DPBS	Gibco	14190144
脂肪酸游离型BSA	Sigma-Aldrich	A8806
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920
明胶	Sigma-Aldrich	G1890
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
去甲肾上腺素	Cayman Chemical	16673
寡霉素	Sigma-Aldrich	75351
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Gibco	15140122
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	557368
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	用于生物能量学研究
外科镊子	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5158
外科剪刀	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5880
ThermoMixer	Eppendorf	T1317
三碘甲腺原氨酸（T3）	Sigma-Aldrich	642511