本文介绍了一种快速摘除性腺并从小型硬骨鱼类中采血的实验方案，以日本青鳉（Oryzias latipes）为模型，用于研究性类固醇激素在动物生理学中的作用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
性类固醇由性腺产生，在所有脊椎动物中通过向大脑和垂体提供反馈，在脑和垂体组织可塑性以及生殖的神经内分泌调控中发挥关键作用。硬骨鱼类具有更高的组织可塑性以及生殖方式的多样性 与哺乳动物相比，鱼类在性类固醇的作用及其作用机制研究方面具有独特策略，是理想的模型生物。通过性腺切除术去除性类固醇的主要来源，并结合血液采样测定类固醇水平，已在较大体型鱼类中建立了成熟且可行的技术体系，是研究性类固醇功能与效应的有力手段。然而，这些技术在小型硬骨鱼类模型中的应用面临诸多挑战。本文详细描述了日本青鳉（Japanese medaka）雌雄个体的性腺切除术操作步骤，以及后续的血液采样方法。这些方案在青鳉中表现出高度可行性，表现为高存活率、对鱼类寿命和表型安全、以及性类固醇清除效果的可重复性。结合该小型硬骨鱼类模型的其他优势，这些技术的应用将显著促进对脊椎动物中性类固醇介导的神经内分泌生殖调控反馈机制及组织可塑性的理解。
引言
在脊椎动物中，性类固醇主要由性腺产生，通过多种反馈机制在脑-垂体-性腺（BPG）轴的调控中发挥重要作用1,2,3,4,5。此外，性类固醇还影响脑内神经元的增殖与活性6,7,8，以及垂体内包括促性腺激素细胞在内的内分泌细胞的活动9,10，因此在脑和垂体的可塑性中起关键作用。尽管在哺乳动物中的研究相对充分，但非哺乳动物物种中由性类固醇介导的BPG轴调控机制仍远未明确，导致对进化上保守原则的理解不足11。目前关于性类固醇在脑和垂体可塑性中作用的研究仍有限，因此有必要进一步探究性类固醇在不同脊椎动物物种中的作用及其效应。
在脊椎动物中，硬骨鱼类已成为研究多种生物学和生理学问题（包括应激反应）的有力模型动物
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验操作和动物处理均遵循挪威生命科学大学关于实验动物福利的建议进行。使用去势手术的实验已获得挪威食品安全局批准（FOTS 编号 24305）。
注意：实验使用成年雄性和雌性日本青鳉（6-7 个月大，体重约 0.35 g，体长约 2.7 cm）。性别通过区分第二性征（如背鳍和臀鳍的大小与形状）确定，具体方法如文献42,47所述。
1. 仪器和溶液的准备
- 配制麻醉剂储备液（0.6% 三卡因）。
- 将 0.6 g 三卡因（MS-222）溶于 100 mL 10 倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 将 1 mL 三卡因储备液分装至多个 1.5 mL 塑料管中，于 -20 °C 保存备用。
- 通过向 2 L 水族箱水中加入 18 g 氯化钠配制复苏用水（0.9% NaCl 溶液）。溶液于室温保存备用。
- 通过将剃须刀片对角折断以制备切口工具，获得尖锐的端点（图 1A）。
- 将 25 µL 肝素钠加入 500 µL 1 倍浓度 PBS 中，配制血液抗凝溶液（0.05 U/µL 肝素钠）。抗凝溶液于 4 °C ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案详细描述了在小型模式硬骨鱼类日本青鳉中进行性腺切除术和采血的每一步操作。雌性鱼卵巢切除术（OVX）后的存活率为100%（10条鱼中存活10条），而雄性鱼在睾丸切除术后存活率为94%（18条鱼中存活17条）。同时，在完成采血操作后，所有鱼（共38条）均存活。
假手术雌性表现出产卵行为（图6A）且所有卵子均受精并进行胚胎发育（图6B假手术的雄鱼在术后1-2周内也能够使卵子受精。6条与部分性腺切除雄鱼共同饲养的部分性腺切除雌鱼中，有2条在2个月后出现产卵行为，且受精率达到100%。相比之下，完全性腺切除的鱼类即使在4个月后也未观察到雌鱼产卵或雄鱼使卵子受精的现象。
若操作正确，鱼类的体型会略有改变（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
如先前文献报道，去势手术和采血长期以来被用于其他模式物种，以研究性类固醇激素在调控BPG轴中的作用。然而，这些技术似乎仅适用于体型较大的动物。考虑到常用辐鳍鱼类模式生物日本青鳉（Japanese medaka）体型较小，本文提供了一种适用于该物种的、可行的去势手术与采血详细实验方案。
去势鱼的存活率接近100%，表明去势手术在青鳉中具有可行性。同样，采血操作对鱼类存活率无显著影响，因其采血后存活率亦达100%。此外，假手术处理的雌鱼与假手术处理的雄鱼共同饲养后，可正常产卵并产生100%受精率的卵，表明切口与缝合操作不影响鱼类的繁殖能力。换言之，这些鱼健康状况良好，能够正常产卵。此外，部分去势的鱼类表现出 与假手术组鱼类相比，部分性腺切除的鱼类体内性类固醇激素浓度相似，且部分雌鱼仍可产卵，雄鱼仍可使卵子受精。这些结果表明，性腺切除手术应以高精度进行，即必须完全切除卵巢或睾丸。
如图8所示，鱼类在去势手术后4周时切口及缝合痕迹已完全消失，且术后4个月鱼类仍存活且.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Lourdes Carreon G Tan 女士在鱼类饲养方面提供的帮助。本工作由挪威生命科学大学（NMBU）、日本促进科学基金（JSPS）资助（项目编号 18H04881 和 18K19323），以及住友基金会基础科学研究项目对 S.K. 的资助支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃毛细管 | GD1 | 带纤维丝的玻璃毛细管 GD-1；Narishige | |
| 肝素钠盐 | H4784-1G | Sigma-Aldrich | |
| 针头拉拔器 | P97 | Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 Model P-97；Sutter Instrument | |
| 尼龙线 | N45VL | 聚酰胺缝合线，0.2 公制；Crownjun | |
| 塑料管 | T9661 | Eppendorf Safe-lock 微量离心管 1.5 ml，Sigma-aldrich | |
| 剃刀刀片 | - | Astra Superior Platinum 双面剃须刀片 绿色，salonwholesale.com | |
| 硅胶毛细管 | a16090800ux0403 | Uxcell 硅胶管 1 mm 内径 x 2 mm 外径，amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich 化学 |
参考文献
- Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
