在小型硬骨鱼类模式生物日本青鳉（Oryzias latipes）中进行性腺切除与采血操作的实验方法

摘要

本文介绍了一种快速摘除性腺并从小型硬骨鱼类中采血的实验方案，以日本青鳉（Oryzias latipes）为模型，用于研究性类固醇激素在动物生理学中的作用。

摘要

性类固醇由性腺产生，在所有脊椎动物中通过向大脑和垂体提供反馈，在脑和垂体组织可塑性以及生殖的神经内分泌调控中发挥关键作用。硬骨鱼类具有更高的组织可塑性以及生殖方式的多样性 与哺乳动物相比，鱼类在性类固醇的作用及其作用机制研究方面具有独特策略，是理想的模型生物。通过性腺切除术去除性类固醇的主要来源，并结合血液采样测定类固醇水平，已在较大体型鱼类中建立了成熟且可行的技术体系，是研究性类固醇功能与效应的有力手段。然而，这些技术在小型硬骨鱼类模型中的应用面临诸多挑战。本文详细描述了日本青鳉（Japanese medaka）雌雄个体的性腺切除术操作步骤，以及后续的血液采样方法。这些方案在青鳉中表现出高度可行性，表现为高存活率、对鱼类寿命和表型安全、以及性类固醇清除效果的可重复性。结合该小型硬骨鱼类模型的其他优势，这些技术的应用将显著促进对脊椎动物中性类固醇介导的神经内分泌生殖调控反馈机制及组织可塑性的理解。

引言

在脊椎动物中，性类固醇主要由性腺产生，通过多种反馈机制在脑-垂体-性腺（BPG）轴的调控中发挥重要作用^1,2,3,4,5。此外，性类固醇还影响脑内神经元的增殖与活性^6,7,8，以及垂体内包括促性腺激素细胞在内的内分泌细胞的活动^9,10，因此在脑和垂体的可塑性中起关键作用。尽管在哺乳动物中的研究相对充分，但非哺乳动物物种中由性类固醇介导的BPG轴调控机制仍远未明确，导致对进化上保守原则的理解不足¹¹。目前关于性类固醇在脑和垂体可塑性中作用的研究仍有限，因此有必要进一步探究性类固醇在不同脊椎动物物种中的作用及其效应。

在脊椎动物中，硬骨鱼类已成为研究多种生物学和生理学问题（包括应激反应）的有力模型动物^12,13生长^14,15，营养生理学^16,17 以及繁殖²硬骨鱼类中，雌性个体的性类固醇主要为雌二醇（E2），雄性个体则主要为11-酮睾酮（11-KT）^18,19，具有 长期以来，鱼类一直是研究跨物种繁殖普遍规律的可靠实验模型。硬骨鱼类在下丘脑-垂体连接方面表现出独特性。^20,21 以及明确的促性腺激素细胞²²，这在阐明调控机制时有时非常方便。此外，由于硬骨鱼类既适用于实验室实验，也适用于野外实验，因此与其他生物相比具有诸多优势。它们的购买和维持成本相对较低^23,24。特别是斑马鱼等小型硬骨鱼模型（Danio rerio）以及日本青鳉（Oryzias latipes），是繁殖力极强且生命周期相对较短的物种，可实现对基因功能和疾病机制的快速分析²³，因此在应对大量生物学和生理学问题时具有更加显著的优势，尤其是考虑到已有众多成熟的实验方案和丰富的遗传工具可供使用 物种²⁵.

在众多研究中，摘除性腺（性腺切除术）结合采血技术被用作探讨多种生理学问题的方法，包括其对哺乳动物^26,27,28、鸟类²⁹和两栖类³⁰等脊椎动物生殖生理的影响。尽管性类固醇拮抗剂（如他莫昔芬和氯米芬）可模拟性腺切除对生殖生理的作用，但由于存在双相效应，药物效果往往不一致^31,32。长期暴露于性类固醇拮抗剂可能导致卵巢增大^33,34，从而因产生非健康表型而难以观察其长期作用效果。此外，在使用性类固醇拮抗剂处理后无法进行恢复实验，因而难以确认特定性类固醇的特异性效应。除上述因素外，性类固醇拮抗剂应用的其他权衡问题已有广泛综述^31,32。因此，至今性腺切除术仍被视为研究性类固醇作用的一项有力技术。

尽管在欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）³⁵、蓝头濑鱼（Thalassoma bifasciatum）³⁶、猫鲨（Scyliorhinus canicula）³⁷ 以及鲶鱼（Heteropneustes fossilis 和 Clarias batrachus）^38,39 等体型较大的物种中，性腺切除和采血技术相对容易操作，但在青鳉等小型鱼类中应用时则面临诸多挑战。例如，鱼类麻醉递送系统（Fish Anesthesia Delivery System, FADS）⁴⁰ 在小型鱼类中可行性较低，且容易造成过度的物理损伤。此外，常用于较大鱼类的性腺切除方法⁴⁰ 并不适用于需要极高精度操作以避免严重损伤的小型鱼类。最后，由于这些动物的血管难以接近且血液量极少，采血操作尤为困难。因此，建立一套清晰展示小型真骨鱼类性腺切除与采血每一步骤的标准化方案具有重要意义。

本方案 展示了对日本青鳉（一种原产于东亚的小型淡水鱼类）进行性腺切除术并随后采血的逐步操作流程。日本青鳉具有已测序的基因组，拥有多种可用的分子与遗传工具²⁵，并具备遗传性别的决定系统，使其能够在第二性征 或性腺充分发育之前研究性别差异⁴¹。有趣的是，与其他多数硬骨鱼类不同，日本青鳉具有融合的性腺⁴²。这两种技术合计仅需8分钟即可完成，从而补充完善了该物种已有的视频实验方案系列，包括血管标记⁴³、垂体切片的膜片钳记录⁴⁴、脑神经元的膜片钳记录⁴⁵以及原代细胞培养⁴⁶。这些技术将有助于科研界未来进一步探究性类固醇激素在反馈机制、脑可塑性及垂体可塑性中的作用。

方案

所有实验操作和动物处理均遵循挪威生命科学大学关于实验动物福利的建议进行。使用去势手术的实验已获得挪威食品安全局批准（FOTS 编号 24305）。

注意：实验使用成年雄性和雌性日本青鳉（6-7 个月大，体重约 0.35 g，体长约 2.7 cm）。性别通过区分第二性征（如背鳍和臀鳍的大小与形状）确定，具体方法如文献^42,47所述。

1. 仪器和溶液的准备

1. 配制麻醉剂储备液（0.6% 三卡因）。
   1. 将 0.6 g 三卡因（MS-222）溶于 100 mL 10 倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   2. 将 1 mL 三卡因储备液分装至多个 1.5 mL 塑料管中，于 -20 °C 保存备用。
2. 通过向 2 L 水族箱水中加入 18 g 氯化钠配制复苏用水（0.9% NaCl 溶液）。溶液于室温保存备用。
3. 通过将剃须刀片对角折断以制备切口工具，获得尖锐的端点（图 1A）。
4. 将 25 µL 肝素钠加入 500 µL 1 倍浓度 PBS 中，配制血液抗凝溶液（0.05 U/µL 肝素钠）。抗凝溶液于 4 °C 保存备用。
5. 使用拉针仪将一根 90 mm 长的玻璃毛细管拉制成两根玻璃针（图 1B），具体操作遵循仪器制造商的说明。
   注意：玻璃针的外径为 1 mm，内径为 0.6 mm。
6. 通过切割 1.5 mL 塑料管盖并在其上打孔，制备管盖，使孔径与玻璃针外径匹配（图 1C）。打孔方法：加热一根 9 mm 玻璃毛细管的一端，并将加热后的毛细管刺穿管盖；或者使用针反复刺穿管盖，直至孔径与 9 mm 玻璃毛细管外径相匹配。

2. 性腺切除术操作

1. 通过将一管三卡因原液（0.6%）稀释于30 mL水族箱水中，配制0.02%的麻醉溶液 水
2. 准备解剖工具，包括一把超细镊子和两把精细镊子（其中一把尖端相对较宽）、小剪刀、尼龙线和剃刀，具体如步骤1.3所述。
3. 将鱼放入0.02%的麻醉溶液中30-60秒以进行麻醉。
   ​注意：麻醉持续时间取决于鱼的大小和体重 并需进行调整。为确保鱼类完全麻醉，可用镊子轻轻夹捏鱼体。若鱼类无反应，即可开始性腺切除手术。
4. 将鱼从麻醉液中取出，置于解剖显微镜下，水平侧卧于水面外。
5. 雌性动物卵巢切除术（OVX）
   1. 移除产出的卵（位于雌虫体外的卵），如有，并刮除切口区域的鳞片图2A).
   2. 在骨盆鳍与肛鳍之间，肋骨间的区域做一个长约2-2.5 mm的轻柔切口（图2A），使用剃须刀片。然后，用宽头精细镊子逐渐取出卵巢，同时轻轻挤压鱼的腹部。
   3. 使用精细镊子剪切卵巢末端，并将卵巢置于一旁（图2B).
      注意：尽量避免破坏卵巢囊。若卵巢囊被破坏，应尽可能彻底清除性腺残留物，确保不留下任何未排出的卵子。
6. 男性睾丸切除术
   1. 在肛门上方的肋骨之间轻轻做一切口（图2A），然后用精细镊子缓慢地撑开切口。
   2. 用精细镊子轻轻夹住睾丸，缓慢取出。随后剪去睾丸末端，以彻底移除睾丸。图2B）。对于雄性动物去势手术，所有术前准备均与雌性动物相似，直至切口步骤。在抓取睾丸时，有时会误取与睾丸形态相似的脂肪组织。然而，在复位脂肪组织后，可再次尝试寻找睾丸图2B).
      注意：无论雄性还是雌性，进行腹部切口时都应尽量减小切口尺寸，以避免造成过度损伤而引起死亡。有时肠道可能会随性腺一同从切口中脱出，因此在关闭切口前，务必将其妥善放回腹腔内。操作前必须具备关于青鳉腹部卵巢与睾丸位置的先验知识。
7. 缝合切口时，男性和女性的操作方法相同（图3).
   1. 将尼龙线放置在切口区域旁 用超细镊子从切口右侧刺入皮肤，穿过体腔内壁，用精细镊子将缝合线带入图3; 1-2).
   2. 从切口左侧刺入皮肤，穿过体外腔以取出缝线 图3; 3-4).
   3. 关闭切口并打两个结，剪去多余的缝线（图3; 4-6).
      注意：缝线必须足够紧，且鱼体上保留的线应留有足够长度，以防止缝线松脱。从麻醉到缝合的整个操作过程通常不超过6分钟。操作时间过长 可能导致 死亡率
   4. 将鱼放入恢复水中，并在转移至水族系统前至少静置24小时。
      ​注意：去势后的鱼类在恢复水中通常 1–2 小时后即表现出正常行为。因此，根据实验目的，可在该时间间隔后对鱼类进行取样。

3. 采血流程

1. 准备工具：玻璃针、硅胶毛细管、带孔的塑料管、空的1.5 mL塑料离心管、小型离心机和胶带。
2. 使用步骤 2.1 中所述的 0.02% 麻醉剂溶液对鱼类进行麻醉，并将鱼置于解剖显微镜下，保持垂直位置（图4A将鱼置于明亮的表面上，以便于观察尾部穿刺静脉。
3. 通过将玻璃针连接到硅胶毛细管上，安装采血装置图4B）。用宽头镊子折断针尖，通过抽吸和吹出的方式将抗凝剂溶液涂布于针内壁。
   注意：为安全起见，建议使用吸管和长度至少为50 cm的硅胶毛细管，以避免吸血时血液直接接触。此外，应确保针尖开口足够大，以便顺利吸取血液。
4. 将针头朝向鱼体的尾柄区域，对准尾柄静脉图 5A）用口吸取血液，直至针管内血液体积至少达到针管总容积的四分之一图5B).
   注意：在将针头从鱼体中取出之前，必须先停止抽吸。
5. 松开针头，并在针尖附近贴上一片胶带。将带孔的盖子盖在收集管上，通过孔洞将针头插入管内，使针尖朝外。图5C).
6. 将鱼放入恢复水中，并在转移至水族系统前至少静置24小时。
   注意：若需从同一条鱼进行第二次采血，应在首次采血一周后采集血液样本。
7. 短暂离心收集的血液1-2秒 1,000 × g 下 室温下收集管中的血液。
8. 直接进行下游应用，或在 -20 °C 保存血液直至使用。
   注意：有关全血中性类固醇的提取，请参考之前的研究⁴⁸.

结果

本方案详细描述了在小型模式硬骨鱼——日本青鳉中进行性腺切除术和采血的每一步操作。雌性青鳉在卵巢切除术（OVX）后的存活率为100%（10条鱼中存活10条），而雄性在睾丸切除术后存活率为94%（18条鱼中存活17条）。同时，在完成采血操作后，所有鱼（共38条）均存活。

假手术组雌鱼表现出产卵行为（图6A），所有卵子均受精并能够进行胚胎发育（图6B）。假手术组雄鱼在术后仅1-2周内也能够使卵子受精。在与部分性腺切除的雄鱼共同饲养的六条部分性腺切除雌鱼中，有两条在两个月后也出现了产卵行为，且受精率达到100%。相比之下，即使经过4个月，完全性腺切除的鱼类中未观察到任何雌鱼产卵或雄鱼使卵子受精的现象。

若操作正确，鱼类的...

讨论

如先前文献报道，去势手术和采血长期以来被用于其他模式物种，以研究性类固醇激素在调控BPG轴中的作用。然而，这些技术似乎仅适用于体型较大的动物。考虑到常用辐鳍鱼类模式生物日本青鳉（Japanese medaka）体型较小，本文提供了一种适用于该物种的、可行的去势手术与采血详细实验方案。

去势鱼的存活率接近100%，表明去势手术在青鳉中具有可行性。同样，采血操作对鱼类存活率无显著影响，因其采血后存活率亦达100%。此外，假手术处理的雌鱼与假手术处理的雄鱼共同饲养后，可正常产卵并产生100%受精率的卵，表明切口与缝合操作不影响鱼类的繁殖能力。换言之，这些鱼健康状况良好，能够正常产卵。此外，部分去势的鱼类表现出 与假手术组鱼类相比，部分性腺切除的鱼类体内性类固醇激素浓度相似，且部分雌鱼仍可产卵，雄鱼仍可使卵子受精。这些结果表明，性腺切除手术应以高精度进行，即必须完全切除卵巢或睾丸。

如图8所示，鱼类在去势手术后4周时切口及缝合痕迹已完全消失，且术后4个月鱼类仍存活且...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃毛细管		GD1	带纤维丝的玻璃毛细管 GD-1；Narishige
肝素钠盐		H4784-1G	Sigma-Aldrich
针头拉拔器		P97	Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 Model P-97；Sutter Instrument
尼龙线		N45VL	聚酰胺缝合线，0.2 公制；Crownjun
塑料管		T9661	Eppendorf Safe-lock 微量离心管 1.5 ml，Sigma-aldrich
剃刀刀片		-	Astra Superior Platinum 双面剃须刀片 绿色，salonwholesale.com
硅胶毛细管		a16090800ux0403	Uxcell 硅胶管 1 mm 内径 x 2 mm 外径，amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich 化学