方法文章

用于互连神经元微尺度组装的磁性平台制备

4.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62013

⸱

2021年7月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

本文内容

摘要

本研究提出了一种自下而上的方法，通过工程化局部磁力来调控神经元的排列结构。将载有磁性纳米颗粒（MNPs）的类神经元细胞接种于具有垂直磁化的微图案化平台表面，并实现对其的操控。文中还描述了磁性表征、磁性纳米颗粒的细胞摄取、细胞活力检测以及统计学分析方法。

摘要

将神经元引导形成有序神经网络的能力在再生医学、组织工程和生物界面领域具有重要意义。许多研究致力于利用化学和拓扑线索来引导神经元的生长。然而，在大范围内实现微米尺度组织控制的报道仍十分有限。本文介绍了一种有效的方法，通过嵌入微图案化磁性元件的磁性平台，以微米级分辨率将神经元定位在预设位点并引导其轴突发育。研究表明，通过将磁性纳米颗粒（MNPs）导入神经元，可使其转变为对磁场梯度敏感的磁性单元。基于该策略，研究人员制备了一种独特的磁性平台，并在平台上接种了常见的类神经元模型——PC12细胞，同时将其加载超顺磁性纳米颗粒。通过沉积具有稳定垂直磁化的铁磁性（FM）多层薄膜，为磁性图案提供有效的吸引力。这些加载了MNP的PC12细胞在磁性平台上贴附并分化后，优先附着于磁性图案区域，且其神经突的生长方向与图案形状高度一致，形成取向明确的神经网络。本文还提供了磁性特性、细胞对MNP的摄取、细胞活力以及结果统计分析的定量表征方法。该方法通过调控磁力实现了对神经网络形成的控制，并改善了神经元与电极之间的界面连接，有望成为体外神经网络研究的有效工具，并为新型治疗性生物界面提供新方向。

引言

神经元的微图形化在组织再生1,2,3,4,5以及神经电子器件的开发6,7,8方面具有巨大潜力。然而，像生物组织中那样，在高空间分辨率下实现神经元的微米级精确定位仍面临重大挑战。在此尺度上构建预设结构，需要通过局部控制胞体运动和轴突生长来引导神经细胞的突起。以往研究已提出利用化学和物理信号9,10,11,12来引导神经元生长。本文介绍一种新方法，即通过磁场梯度控制细胞定位13,14,15<....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有生物反应均须在生物安全柜中进行。

1. 磁性平台的制备

  1. 光刻
    1. 使用刻划笔将载玻片切割成 2 × 2 cm2 的尺寸。将载玻片依次置于丙酮和异丙醇中超声清洗各 5 分钟。用超高纯度（UHP）氮气吹干。
    2. 采用旋涂法在载玻片上涂覆光刻胶，转速为 6,000 rpm，持续 60 秒，以获得 1.5 µm 的厚度，并在 100 °C 下烘烤 60 秒。使用与光刻胶匹配的适当波长光源，通过光掩模或无掩模光刻技术对样品进行带有特定图案的曝光。
    3. 在显影液中显影 40 秒，显影液按制造商说明用去离子水（DW）稀释；随后用去离子水清洗 45 秒，并用 UHP 氮气吹干。在光学显微镜下检查图案。
  2. 溅射沉积
    1. 将样品放入沉积系统的主腔室，等待本底真空达到约 5 × 10-8 托。打开气体流量，设定氩气流量为标准溅射条件（本文为 28 sccm [标准立方厘米/分钟]）。点燃溅射靶材，然后将溅射气压设定为 3 mTorr。
    2. 逐步提高各靶材的功率，直至达到所需的沉积速率。
      ​注意：Pd 沉积速率：0.62 Å/s = 1.0 nm/16 秒；Co80Fe20 沉积速率：0.32 Å/s，0.2 nm....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

制备了具有不同几何形状的磁性平台（图 1A）。通过溅射沉积磁性图案：14层Co80铁20 以及 Pd 分别为 0.2 nm 和 1 nm。电子显微镜显示磁性图案的总高度约为 18 nm（图1B）。这种独特的铁磁多层沉积形成了相对于基底平面具有垂直磁各向异性（PMA）的稳定平台，可使载有磁性纳米颗粒的细胞被整个磁性图案吸引，而不仅限于图案边缘22,37. 通过磁输运测量表征了铁磁多层结构的参数，为此制备了铁磁多层膜的十字形器件（图1C 插图），并通过反常霍尔效应（AHE）测量垂直于衬底的磁化强度38，其中反常霍尔效应电阻与垂直磁化强度成正比。反常霍尔效应随磁场变化的测量显示出典型的垂直磁各向.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

代表性结果表明，本研究所提出的方法在微米尺度上控制和组织神经元网络形成方面具有显著效果。载有磁性纳米颗粒（MNP）的PC12细胞保持了良好的活性，并转化为对磁场敏感的单元，能够被铁磁（FM）电极产生的磁力引导至特定位置。这一点在图5C中表现得最为明显：细胞优先黏附于六边形结构的较大顶点处，而非细线部分。此外，细胞的分支生长也良好地遵循了磁性图案的分布。所有对照实验均明确表明，细胞体及其突起的定位是由磁力所引导的。尽管已有研究证明拓扑结构线索可用于引导神经突生长40,41，但本实验中并非如此，因为未负载磁性纳米颗粒的细胞对图案形状无任何响应。

采用自下而上的方法，利用许多研究机构中常见的标准光刻和溅射沉积技术来调控局部磁力，从而促进众多研究人员采用这些技术。该自下而上的方法可根据研究人员的需求灵活设计复杂图案和形状，在厘米尺度的区域内实现微米级分辨率。尽管实验结果是在玻璃载片上实现的，但原则上也可在其他适用于.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

本研究由科学部资助 & 技术，以色列，以及以色列科学基金会（569/16）。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛（甲醛）水溶液ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6 孔细胞培养板FALCON353846
96 孔细胞培养板SPL life sciences30096
两性霉素 B 溶液Biological Industries03-028-1B
AZ 1514H 光刻胶MicroChemicals GmbH
AZ 351 B 显影液MicroChemicals GmbH
牛血清白蛋白（BSA）Biological Industries03-010-1B
细胞和组织培养瓶BiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL 透气盖，未处理
细胞培养皿Greiner Bio-One627-16035 mm
细胞增殖检测试剂盒（基于 XTT）Biological Industries20-300-1000
离心管BiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% 溅射靶材ACI Alloys99.95%
I 型胶原蛋白Corning Inc.354236大鼠尾，浓度范围 3–4 mg/mL
共聚焦显微镜LeicaTCS SP5
Cy2 标记的驴抗兔二抗Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI 氟封片剂SouthernBiotech0100-20
一次性针头KDL23 G
一次性 注射器Medispo116022764010 mL
供体马血清Biological Industries04-124-1A
ELISA 酶标仪Merk MilliporeBioTek synergy 4 混合型微孔板读板仪
70% 乙醇ROMICAL LTD19-009102-80
无水乙醇（脱水乙醇）Biolab-chemicals52505
胎牛血清（FBS）Biological Industries04-127-1A
新鲜小鼠 β-NGFPeprotech450-34
GMW C 型框架电磁铁Buckley systems LTD3470, 45 mm
32% 盐酸DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJ美国国立卫生研究院，贝塞斯达NeuronJ 插件
电感耦合等离子体（ICP）Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES，FHX22 多视角等离子体
吉时利源表Keithley2400
吉时利开关系统Keithley3700
L-谷氨酰胺Biological Industries03-020-1B
光学显微镜LeicaDMIL LED
无掩模光刻系统Heidelberg Inst.MLA150
显微镜载玻片BAR-NAORBN1042000C
70% 硝酸Sigma-Aldrich438073
正常驴血清（NDS）SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 细胞系ATCCCRL-1721
Pd 溅射靶材ACI Alloys99.95%
青霉素-链霉素-制霉菌素溶液Biological Industries03-032-1B
PrestoBlue 细胞活力试剂Molecular probesA-13261基于刃天青
兔抗 α-微管蛋白抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.
射频磁控溅射系统Orion AJA Int.Orion 8
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基Biological Industries01-100-1A
超声波清洗仪KUDOSSK3210HP频率：53 kHz；超声功率：135 W
SQUID 磁强计Quantum Design, CA
吐温 X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279非离子型表面活性剂
XTT 细胞活力试剂

参考文献

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of a....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PC12

相关文章