本方案详细介绍了完整取出猪脑并分离神经科学研究中常涉及的多个脑区的技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
猪作为临床前及可转化的动物模型，已被心血管系统、胃肠道系统和营养学等研究领域充分记录并广泛接受，同时猪在神经科学领域也日益被用作大型动物模型。此外，由于猪的脑部生长和发育模式与人类相似，因此它被公认为研究神经发育的合适模型。然而，由于猪在神经科学研究中仍属较为少见的动物模型，研究人员可能对猪的外科手术和解剖操作相对陌生或缺乏实践经验。因此，制定一套标准化的可视化操作流程，详细说明一致性的脑组织提取与解剖方法，将为使用猪模型的研究人员提供重要帮助。本视频展示了一种在保留大脑皮层和脑干完整的前提下取出猪脑的技术，并介绍了对多个常被研究的脑区进行解剖的方法，包括脑干、小脑、中脑、海马体、纹状体、丘脑以及内侧前额叶皮层。本视频旨在为研究人员提供必要的工具与知识，使其能够对四周龄猪稳定地完成脑组织的提取与解剖操作。
引言
猪已被充分记录并广泛接受为心血管系统研究中具有可转化性的动物模型1，消化系统2，营养3,4糖尿病5毒理学6，以及外科技术7. 随着在PubMed中以关键词进行检索的结果显示，猪在神经科学领域的应用正开始增加 "猪脑动物模型" 1996年至2005年期间的结果数量是此前10年期间的四倍8，目前还有更多研究结果。猪模型受欢迎程度不断上升的一个主要原因是，其大脑在生长、结构和功能方面与人类具有相似性。与人类大脑相比，猪大脑表现出相似的脑回模式、血管化特征以及灰质和白质的分布。9此外，猪脑已被用于神经影像学检查、诱发电位记录以及神经外科技术的建立。8,9与其他动物模型不同，猪和人类在围产期经历脑部生长激增，而并非产前或产后脑部生长激增。出生时，人脑和猪脑的重量分别约为成年脑重的27%和25%，而大鼠脑重仅为成年脑重的12%，恒河猴脑重则为成年脑重的76%
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
涉及动物受试者的实验程序已获得伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准
注意：在实施安乐死前，通过肌肉注射给予猪混合麻醉剂（替来他明盐酸盐50.0 mg与唑拉西泮盐酸盐50.0 mg，用2.50 mL盐酸氯胺酮（100 g/L）和2.50 mL赛拉嗪（100 g/L）重悬，按0.06 mg/kg体重剂量给药）。待猪完全麻醉后，通过心内注射戊巴比妥钠（390 mg/mL，按1 mL/5 kg体重剂量）实施安乐死。进行脑组织解剖时，建议根据后续组织分析方法选择适当的安乐死方式，应尽可能减少对脑组织的损伤。
1. 猪脑的提取
- 实施人道安乐死后，在颈部后方、第一与第二颈椎（分别为寰椎和枢椎）之间进行切割，将猪头切除。
- 将头部固定在经过改装、带有尖刺的台钳上，确保头部完全固定后再继续操作。
- 使用手术刀沿颅骨正中线做矢状切口，切口向后延伸至头部后端。
- 在头部后端做第二个（横向）切口。
- 在吻部末端、与眼睛齐平的位置做第三个（横向）切口。尽可能远离颅骨切割皮肤，以确保充分暴露颅骨。
- 使用骨锯在颅骨正中线两侧做两条从前向后的纵向切口，切口从眼睛延伸至颅骨曲率的顶点。将锯片向中线方向倾斜，切割深度以刚好穿透颅骨为宜。
- 在垂直方向....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本部分描述了在正确提取和解剖4周龄猪脑后获得的结果示例。图1展示了各个脑区的形态，可在解剖过程中作为参考指南。在移除小脑后，部分脑干可能仍残留在颅骨内（图1B），可在分离所需小脑区域时一并去除。表1列出了各解剖脑区的平均重量（均值 ± 均值标准误）（n=5）。
图1：提取的猪脑。 脑区轮廓，用于解剖过程中的参考。所示区域来自右半球。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述技术适用于约4周龄的猪。为确保脑组织结构的完整性（尤其是在考虑后续生化检测时），必须在猪被人道安乐死后立即进行这些操作步骤。初次学习这些技术时，使用脑图谱或白质纤维束16解剖指南会有所帮助。建议实验人员在正式采集样本用于数据分析之前，先进行多次脑组织提取和解剖练习。其中最具挑战性的步骤是去除颅骨。随着实践经验的积累，这一步骤将变得更容易，因为主要需要通过实际操作来掌握锯颅的位置以及判断颅骨是否已被完全切开。本操作流程与Bassi等12所描述的方法类似，但无需制作六边形颅窗，并提供了该技术操作的可视化教程。
该技术的一个局限性在于，当操作较年长的猪时，由于颅骨随年龄增长而显著增厚，可能需要更长时间才能去除颅骨。如果使用锯子处理较厚的颅骨过于费力或效果不佳，则可能需要改用锤子和凿子（如 Bjarkam 等人13 所示）或电动外科设备（例如骨锯）。此外，该技术并不总能确保完整获取嗅球。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢农学、消费者与环境科学学院信息技术与通信服务部门的 Jim Knoblauch 和 Martin-Booth Hodges，感谢他们在音频和视频的拍摄、录制与编辑方面提供的专业技术支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #4 手柄用 #22 手术刀片 | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" 萨特利骨锯 | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" 带凿端的碎颅器（肉钩） | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5 英寸重型工作台台钳 | Pony | 29050 | |
| 25 cm 屠夫刀 | Victorinox | 5.7403.25 | 使用前需磨利 |
| CM40 轻型锻压 C 型夹 | Bessey | 00655BC3120 | |
| 金刚石磨刀器刀具修整器 | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon 不锈钢手术刀片手柄 #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| 组织镊 | Henry Schein | 101-5132 | |
| 乙烯基解剖垫 | Carolina | 629006 |
参考文献
- Hughes, H. C. Swine in cardiovascular research. Laboratory Animal Science. 36 (4), 348-350 (1986).
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
