家猪脑组织的提取与解剖

摘要

本方案详细介绍了完整取出猪脑并分离神经科学研究中常涉及的多个脑区的技术。

摘要

猪作为临床前及可转化的动物模型，已被心血管系统、胃肠道系统和营养学等研究领域充分记录并广泛接受，同时猪在神经科学领域也日益被用作大型动物模型。此外，由于猪的脑部生长和发育模式与人类相似，因此它被公认为研究神经发育的合适模型。然而，由于猪在神经科学研究中仍属较为少见的动物模型，研究人员可能对猪的外科手术和解剖操作相对陌生或缺乏实践经验。因此，制定一套标准化的可视化操作流程，详细说明一致性的脑组织提取与解剖方法，将为使用猪模型的研究人员提供重要帮助。本视频展示了一种在保留大脑皮层和脑干完整的前提下取出猪脑的技术，并介绍了对多个常被研究的脑区进行解剖的方法，包括脑干、小脑、中脑、海马体、纹状体、丘脑以及内侧前额叶皮层。本视频旨在为研究人员提供必要的工具与知识，使其能够对四周龄猪稳定地完成脑组织的提取与解剖操作。

引言

猪已被充分记录并广泛接受为心血管系统研究中具有可转化性的动物模型¹，消化系统²，营养^3,4糖尿病⁵毒理学⁶，以及外科技术⁷. 随着在PubMed中以关键词进行检索的结果显示，猪在神经科学领域的应用正开始增加 "猪脑动物模型" 1996年至2005年期间的结果数量是此前10年期间的四倍⁸，目前还有更多研究结果。猪模型受欢迎程度不断上升的一个主要原因是，其大脑在生长、结构和功能方面与人类具有相似性。与人类大脑相比，猪大脑表现出相似的脑回模式、血管化特征以及灰质和白质的分布。⁹此外，猪脑已被用于神经影像学检查、诱发电位记录以及神经外科技术的建立。^8,9与其他动物模型不同，猪和人类在围产期经历脑部生长激增，而并非产前或产后脑部生长激增。出生时，人脑和猪脑的重量分别约为成年脑重的27%和25%，而大鼠脑重仅为成年脑重的12%，恒河猴脑重则为成年脑重的76%¹⁰.

猪作为神经科学研究动物模型进展缓慢的原因之一，在于许多研究人员在这一背景下对猪并不熟悉。研究人员可能不了解猪在该领域的潜在用途，或不清楚使用此类模型所需掌握的正确技术。随着猪在生物医学和临床前研究中的应用日益受到关注，有必要建立标准化的组织取材流程，以确保不同研究间数据的准确比较。尽管已有文献报道过涉及猪脑的解剖和手术技术^11,12,13，但仍缺乏简单且标准化的猪脑组织采集方案，尤其是在生化检测中的应用方面。因此，本视频旨在提供必要的知识，使研究人员能够执行标准化的脑组织提取与解剖操作。本视频将演示一种可保持大脑皮层和脑干完整性的猪脑取出技术，并随后介绍若干关键脑区的解剖方法。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准

注意：在实施安乐死前，通过肌肉注射给予猪混合麻醉剂（替来他明盐酸盐50.0 mg与唑拉西泮盐酸盐50.0 mg，用2.50 mL盐酸氯胺酮（100 g/L）和2.50 mL赛拉嗪（100 g/L）重悬，按0.06 mg/kg体重剂量给药）。待猪完全麻醉后，通过心内注射戊巴比妥钠（390 mg/mL，按1 mL/5 kg体重剂量）实施安乐死。进行脑组织解剖时，建议根据后续组织分析方法选择适当的安乐死方式，应尽可能减少对脑组织的损伤。

1. 猪脑的提取

1. 实施人道安乐死后，在颈部后方、第一与第二颈椎（分别为寰椎和枢椎）之间进行切割，将猪头切除。
2. 将头部固定在经过改装、带有尖刺的台钳上，确保头部完全固定后再继续操作。
   1. 使用手术刀沿颅骨正中线做矢状切口，切口向后延伸至头部后端。
   2. 在头部后端做第二个（横向）切口。
   3. 在吻部末端、与眼睛齐平的位置做第三个（横向）切口。尽可能远离颅骨切割皮肤，以确保充分暴露颅骨。
3. 使用骨锯在颅骨正中线两侧做两条从前向后的纵向切口，切口从眼睛延伸至颅骨曲率的顶点。将锯片向中线方向倾斜，切割深度以刚好穿透颅骨为宜。
   1. 在垂直方向重复上述操作，在颅骨上形成一个矩形的"窗口"。
4. 使用肉钩将颅骨上的矩形部分撬开。先将钩子插入该区域的一个角部，施加向上的压力以松动颅骨片。操作时需确保肉钩仅作用于颅骨层面，避免意外刺入脑组织。
5. 若脑表面仍有脑膜残留，使用镊子和钝头剪刀（或手术刀）轻轻去除脑膜，注意不要切破脑组织。
6. 使用手术刀切除头部后部的肌肉和脂肪组织，暴露颅骨后部区域。
   1. 沿颅骨后部做两个横向切口，注意不要切及脑组织。
   2. 用手牢固按住吻部，向后施力，将颅骨后部掀开，暴露小脑。
7. 将头部从台钳上取下，放置于手术垫上。
8. 使用细长工具（如手术刀的钝端）取出脑组织。将头部倒置，轻柔地以舀取动作将脑组织从颅腔中取出，避免损伤脑表面。
   ​注意：取出脑组织时需切断颅神经。操作应轻柔，切勿强行拉扯。当脑组织与颅骨及脊柱完全分离后，其将自然脱落。

2. 猪脑解剖

注意：在解剖过程中，使用脑图谱或纤维束解剖指南¹⁴作为视觉参考可能会有所帮助。每次取出样本后，务必根据具体项目需求妥善保存已解剖的组织样本（下文将更详细描述）。此外，请注意，本视频中展示的所有脑区均来自右侧半球，但不同实验室可能根据实验目的选择不同半球。

1. 为去除脑干（主要是延髓），在小脑尾侧进行冠状切面切割。
2. 为去除小脑，在大脑皮层后方进行冠状切面切割。从此样本中分离出所需的小脑区域（例如蚓部、绒球等），注意确保样本中不包含任何脑干组织。
3. 沿大脑纵裂进行正中矢状切口，以分离大脑的两个半球。切割时应保持连续动作，避免对皮层造成损伤。
4. 为去除中脑，从中脑上丘和下丘腹侧区域解剖获取所需量的组织。
5. 为去除海马体，将解剖刀钝端置于胼胝体后部，从胼胝体后部开始以"J"形动作轻柔地将海马体卷出；完整的海马角呈“豆形”。
6. 纹状体（主要显示尾状核）位于胼胝体下方、海马体前方，是一个灰质与白质相间条纹状的区域。将解剖刀倾斜，切除该区域，切除后可观察到条纹状组织。
7. 为去除内侧前额叶皮层，从前额回至胼胝体方向解剖组织，移除该区域最内侧的部分。去除内侧前额叶皮层后，右侧皮层应予以保留。
8. 为去除丘脑，从中脑前方、脑正中矢状面中心处移除一个球状结构。丘脑呈球形，颜色略深于周围组织。

3. 解剖后处理

1. 解剖完成后，应妥善保存组织样本，以便后续分析。若省略此步骤，组织可能在短短20分钟内发生显著的自溶和降解。
2. 若需进行结构分析，应在解剖时保持各脑区完整；若需制备均一组织样本，则可在保存前将组织剪碎。脑组织常用的保存方法包括冷冻保存以及使用交联剂进行化学固定¹⁵。
3. 对于常规实验室检测（如基因或蛋白表达分析），在长期储存于-80 °C前，应将样本浸入液氮或可稳定遗传物质的溶液中，以实现方便且经济的保存。
4. 若维持组织结构是首要考虑因素，可通过传统固定方法保存脑组织（例如使用醛类固定剂交联蛋白质），固定时可选择在解剖前对动物或目标器官进行灌注或不进行灌注。

结果

本部分描述了在正确提取和解剖4周龄猪脑后获得的结果示例。图1展示了各个脑区的形态，可在解剖过程中作为参考指南。在移除小脑后，部分脑干可能仍残留在颅骨内（图1B），可在分离所需小脑区域时一并去除。表1列出了各解剖脑区的平均重量（均值 ± 均值标准误）（n=5）。

图1：提取的猪脑。 脑区轮廓，用于解剖过程中的参考。所示区域来自右半球。

讨论

本文所述技术适用于约4周龄的猪。为确保脑组织结构的完整性（尤其是在考虑后续生化检测时），必须在猪被人道安乐死后立即进行这些操作步骤。初次学习这些技术时，使用脑图谱或白质纤维束¹⁶解剖指南会有所帮助。建议实验人员在正式采集样本用于数据分析之前，先进行多次脑组织提取和解剖练习。其中最具挑战性的步骤是去除颅骨。随着实践经验的积累，这一步骤将变得更容易，因为主要需要通过实际操作来掌握锯颅的位置以及判断颅骨是否已被完全切开。本操作流程与Bassi等¹²所描述的方法类似，但无需制作六边形颅窗，并提供了该技术操作的可视化教程。

该技术的一个局限性在于，当操作较年长的猪时，由于颅骨随年龄增长而显著增厚，可能需要更长时间才能去除颅骨。如果使用锯子处理较厚的颅骨过于费力或效果不佳，则可能需要改用锤子和凿子（如 Bjarkam 等人¹³ 所示）或电动外科设备（例如骨锯）。此外，该技术并不总能确保完整获取嗅球。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#4 手柄用 #22 手术刀片	Ted Pella, inc.	549-4S-22
11 1/2" 萨特利骨锯	Leica Biosystems	38DI13425
5 1/2" 带凿端的碎颅器（肉钩）	Leica Biosystems	38DI37636
5 英寸重型工作台台钳	Pony	29050
25 cm 屠夫刀	Victorinox	5.7403.25	使用前需磨利
CM40 轻型锻压 C 型夹	Bessey	00655BC3120
金刚石磨刀器刀具修整器	Chef’s Choice	436-3
Shandon 不锈钢手术刀片手柄 #4	ThermoScientific	5334
组织镊	Henry Schein	101-5132
乙烯基解剖垫	Carolina	629006