研究利普托梅宁格疾病直接靶向治疗的穆林·奥马亚异种格拉夫特模型

瘦素疾病（LMD）是CCS的一种侵略性晚期转移，其中肿瘤细胞进入CSF并渗透到大脑和脊髓¹的表面。导致LMD的最常见癌症包括乳腺癌和肺癌以及黑色素瘤^2。LMD 会导致许多神经症状和症状，如头痛、颅神经麻痹、颈部僵硬和放射病变。LMD患者的预后通常非常差（平均存活率以周为单位衡量），并且是普遍致命的^{3，4，5，6，7。}手术、放疗和全身化疗的治疗是姑息的。LMD的系统治疗可能会失败，因为药物渗透到CSF在完整的BBB或血液CSF屏障穿过胆囊丛^1。

因此，直接在CSF中施用癌症治疗（例如药物和抗体治疗，包括检查点抑制剂和细胞疗法）可以克服这一限制^。通过植入头皮下方的 Ommaya 水库，可以从患者身上获取和采样 CSF。该设备允许对癌症制剂（如甲氨蝶酯和链球菌）进行管理，并用于诊断研究（例如，LMD 的细胞学诊断以监测对治疗的反应）的 CSF 采样，而无需进行脊柱水龙头。穆林奥马亚水库被设计成模仿那些临床上使用。储层需要组装一个接入端口和隔膜部件，并修改鼠标罐装技术，使设备在整个药物研究期间保持永久完整。此设备已被指定为"穆林奥玛亚"。

与渗透输液泵技术不同，该技术要求制备多余的液体体积，以预先填充管子中的空位，并在频繁注射⁹时连续输液，Murine Ommaya将药物溶液的浪费降到最低。它允许使用汉密尔顿注射器、微型接入端口和自动喷油器在任何给定时间使用少量（3-7 μL）有效施用多种单剂量治疗。实时测试药物对LMD的疗效可以通过成像来确定。使用这种方法，各种化疗、抗体和细胞免疫疗法（作为单一或组合剂）可以针对LMD进行测试，将体内发现转化为患者的合理治疗策略。为了进一步提高LMD患者衍生异种移植（PDX）模型的成像能力，与制造商合作开发与Mryine Ommaya兼容的磁共振成像（MRI）版本，无需组装即可使用。MRI 功能是有益的，特别是对于 PDX 模型，其中来自 CSF 的循环肿瘤细胞 （CTC） 的数量有时是限制因素，而且通常当预贴标签的 CTC 不可行时。

本文描述了一个详细的协议，从注射CTC开始，使小鼠与LMD。然后，通过手术植入穆林奥马亚，并通过穆林奥马亚进行多个药物治疗步骤。作为演示概念的证明，进行了体内并排比较，其中穆林人类表皮生长因子受体2（Her2）抗体称为克隆7.16.4（人类相当于特拉斯塔祖马布）被交付^10。抗体通过Murine Ommaya（直接靶向或院内治疗）或腹内注射（系统疗法）瞄准Her2^- 乳腺癌细胞。结果表明，接受直接体内免疫治疗的LMD小鼠比接受同一疗法的老鼠存活时间要长得多。通过Murine Ommaya治疗的小鼠的CNS转移几乎在第三周治疗的第三剂中完全倒退，从而改善了整体存活率。

该协议得到了南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IS00005974）的批准。

1. 将CTC注入CSF，生成鼠标LMD模型

1. CTC 的准备工作
   1. 计算注射所需的CTC数量，在无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）中，在1.0×10⁴ 细胞/μL下制备单细胞悬浮。在整个过程中将细胞悬浮在冰上或在 4 °C 下。
      注意:当使用需要尝试的细胞系时，请务必用无菌 PBS 清洗细胞两次以去除试用素。使用血细胞计或自动细胞计数器执行细胞计数。如果使用大群（>50只小鼠），在注射之间重新计算细胞并验证细胞的生存能力，以确保每只小鼠管理一致数量的细胞。
2. 术前手术
   1. 用1毫克/千克丁丙诺啡皮下注射小鼠持续释放（Bup-SR）。
      注:不要注入拟切口的面积:选择远离肩骨的注射部位。
   2. 用2-3%异黄素麻醉鼠标，直到它没有表现出正确的反射迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉状态。
   3. 在远离手术区域的位置为小鼠准备手术。将手术部位（即头骨的正部表面）夹上足够的边界区域，以防止毛皮污染切口部位;然后，用抗腐剂使部位饱和，从部位中心工作到周围，然后允许干燥。应用无菌窗帘或无菌胶粘剂支持的塑料窗帘材料，以保护手术现场免受污染。
      注:仪器应提前自动封存，并用玻璃珠消毒器在动物之间重新消毒。
   4. 剃掉头部整个腹腔表面的毛皮，并使用无菌技术准备皮肤。
   5. 用立体定向装置的改装 L 形鼻锥定位鼻子，确保鼻孔保持清晰和开放。使用胶带穿过两个针眼的腹腔表面，轻轻地将皮肤向前拉，将其固定在鼻锥上，并在固定后以大约 90° 角弯曲颈部。管理1.5%异黄素以维持麻醉。
      注:适当的定位将导致切口区域以便于识别腹骨的烧灼脊的方式呈现。
   6. 将身体定位以确保脊柱与西斯特纳巨无霸保持水平，同时对尾部施加轻微牵引力，将胶带放在尾部底部以固定。
3. 手术西斯特纳麦格纳注射
   1. 随着颈部的完全延伸，并开始只是之间的针刺，运行手术剪刀尖向下与轻微的压力穿过腹腔骨。
      注:虽然在这个中线位置，当剪刀尖浸入西斯特纳巨无霸的凹面区域时，一个小的凹陷是明显的。
   2. 在苍白的凹面上方做一个3-5毫米的中线切口。将 5 μL 的细胞悬浮在 1.0 × 10⁴ 细胞/μL（总计 5.0 ×^{10 4} 个细胞）中绘制成 30 G Hamilton 注射器。
   3. 使用具有 1-2 mm 尖端的钝尖钳子轻轻按压西斯特纳巨无霸。在封闭式位置引入提示，并在对 dura 施加向下压力时打开提示。
   4. 重复前一步描述的钝解剖，直到杜拉尔膜很容易识别，相关血管在暴露区域可见。
      注:由此产生的注射窗口确保血管在插入针头时未受损。
   5. 当将钳子打开以收回周围的肌肉时，在杜拉下引入一根30G的非结扎针，以可视化斜面。确保针头只引入斜面本身之外。慢慢地部署注射器柱塞，并在杜拉正下方输送细胞。
   6. 正确放置斜面，观察杜拉下方的注射。小心管理该技术，并使用30G非胸针，以防止对膜的损害，并确保最小的泄漏。如果注意到泄漏，请使用棉尖施用器施加温和的压力。
   7. 通过涂抹伤口夹或皮肤粘合剂的微滴来关闭皮肤。注射成功后，让小鼠在温暖的毯子上从麻醉中恢复过来，持续观察它们，直到它们能够保持胸骨位置并表现出有目的的运动。
   8. 手术后第一周每天监测小鼠。如果小鼠似乎处于疼痛或痛苦之中，根据兽医咨询和指示，每12至24小时注射10毫克/千克皮下注射一次卡洛芬，最长达5天。让小鼠恢复并监测它们至少48至72小时，然后再进入下一步。
      注意:Bup-SR，先发制人，将持续长达72小时，所以额外的镇痛药通常是没有必要的。然而，动物将根据需要提供额外的镇痛药（如果昏昏欲睡，不吃，皱褶）。如果手术部位出现术后感染迹象（即发红、肿胀、发嫩、同位素、高镇痛、超病或脓肿），或者如果小鼠在守卫受影响区域，则对小鼠实施安乐死。如果癌细胞成功注射到CSF中，LMD和肿瘤进展将在1或2周内在CNS中发展（取决于使用的CTC或细胞系的类型）（图1）。

2. 穆林·奥马亚组装和植入

1. 车站准备
   1. 消毒站面。将蓝色覆盖物覆盖在表面上，并准备好 图2中指示的所有消毒工具和用品。
2. 术前手术
   1. 应用镇痛 （Bup-SR）， 并保持第 1.2 节中描述的无菌技术。
3. 穆林·奥马亚的手术植入
   1. 使用 25 G（0.51 mm 外径）微型喷射端口和 1 mm 隔膜盘组装 Murine Ommaya 喷射装置。使用氰丙烯酸酯无菌粘合剂，确保约2.5毫米的金属管进入右脑半球（图3A-C）。
      注:该实验室开发了一个与MRI兼容的鼠标Ommaya原型，该实验室已经将两个部件（微型喷射端口和隔膜）3D打印成一个单元（图3D）。单个单元版本由 MRI 测试，可以通过消除装配步骤节省时间。
   2. 用 2-3% 异黄素麻醉鼠标，直到没有右反射的迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉状态。
   3. 剃掉毛皮头部的整个腹腔表面，并根据无菌技术准备皮肤，如先前在第1.2.3步中所述。将鼠标放在带有鼻锥的立体定向装置中，以便在手术过程中继续异黄素管理:将异黄素降至1.5%。轻轻地拧紧耳塞以固定头部，并涂抹眼部润滑剂以遮盖鼠标的眼睛。
   4. 做一个小的皮肤切口（3毫米），然后钝解剖底层皮下组织，以暴露头骨。使用过氧化氢浸泡棉尖施用棒干燥头骨。
   5. 在头骨 0.5 mm 后部和 1.1 mm 侧向的胸腔中钻一个毛刺孔 - 头骨上的解剖点，其中冠状缝合线被下垂缝合线 （图 3A）垂直交叉 - 以及一个 0.9 毫米毛刺孔，以暴露杜拉母体。将微褶皱移到一边，在插入注射端口（深度约 2.5 mm）之前，轻轻地在毛刺孔周围给骨头打分，然后使用氰化物无菌粘合剂贴在头骨上。注射点周围的国家缝合使用4-0无吸收尼龙缝合在中断的缝合模式或钱包字符串缝合^11。
   6. 将手术后的小鼠关在单独的笼子里进行手术恢复。
      注:当多个手术康复的老鼠被安置在同一个笼子里时，Murine Ommaya可能会脱落，可能是由于不断的篡改相互作用。建议在药物疗效试验过程中，将植入的Murine Ommaya植入的小鼠单独安置（或每个笼子不超过2只小鼠）。

3. 穆林·奥马亚治疗

1. 使用穆林奥马亚剂量小鼠
   1. 用2-3%异黄素麻醉鼠标，直到没有纠正反射的迹象。此外，检查尾巴和/或爪捏反射，以确认麻醉的维护。
   2. 使用端口注射适配器和汉密尔顿注射器访问穆林奥马亚。使用钳子，握住微型喷射端口的顶部，轻轻地将端口喷射器适配器完全插入端口的隔膜中。
      注:端口喷油器穿透端口隔膜的方式，将死空间减少到最低限度，并允许通过电动注射器泵进行受控注射（图4A）。在麻醉期间，以1微升/分钟的流动速度注射靶向/新疗法。根据研究人员的判断，治疗将按指定的时间间隔（每日/每周）进行，持续时间为固定时间（周/月）。
      3 到 7 μL 之间的音量是最佳的，因为 3 μL <体积不可靠，7 μL >体积可能会造成太大的压力。Hamilton 注射器的大小范围从 10 到 100 μL 不等，具体取决于每个治疗臂中的鼠标数量。将适当的音量预装到汉密尔顿注射器中将防止重复更换注射器，从而最大限度地减少错误。最好每个治疗手臂奉献 1 个汉密尔顿注射器。
   3. 注射后，使用钳子将 Murine Ommaya 从端口注射适配器中分离出来，并将鼠标放回笼中，从麻醉中恢复过来，如上文第 1.3.7 步所述。
2. 安乐死
   1. 通过从压缩的水箱源中吸入二氧化碳_（CO2），使老鼠安乐死。让小鼠暴露_{在二氧化碳} 浓度增加的状态（即使用室积/分钟 10% 到 30% 的位移速率），以避免或尽量减少不适或苦恼。监测小鼠，直到保证停止心血管和呼吸运动。

在小鼠中，CSF 的总体积约为 35-40 μL，以大约 350 nL/分钟的速度产生:它每天翻12-13次12。为了可视化注射的路线，2%的埃文斯蓝通过穆林Ommaya模型注射，然后15分钟和30分钟被允许过去之前收获的大脑进行分析。染料在15分钟内成功渗透到心室和大脑。在30分钟内，染料在脊髓上变得可见（图4）。

作为概念的证明，BALB/c小鼠被注射了带有荧光酶标签的Her2+TUBO 乳腺癌细胞系，并植入了穆林奥马亚斯。注射癌细胞大约1周后，小鼠开始发展LMD。这些小鼠每周接受一次长达4周的Her2抗体免疫治疗，无论是通过腹内注射进行全身治疗，还是通过Murine Ommaya（图5A）进行内科治疗。

虽然未经治疗的小鼠在第19天死亡，但所有通过穆林·奥马亚接受内科治疗的小鼠都幸存了下来（P = 0.004）。到第4周，观察到肿瘤的完全回归。与接受全身治疗的小鼠相比，接受体内治疗的小鼠总体存活时间要长得多（图5B）。

图1:将循环肿瘤细胞注射到血清异种模型中的西斯特纳巨无霸中，以研究瘦子病和中枢神经系统转移。 （A） 一个图示，显示西斯特纳巨无霸和CSF访问部位的位置，其中使用汉密尔顿注射器注射CTC。（B） 与循环肿瘤细胞注射2周后，患上瘦小板疾病和中枢神经系统转移（大脑和脊髓沿）的小鼠的代表性IVIS图像。细胞被标记为荧光素酶的记者基因。注射盐水的对照动物没有发展成肿瘤（n = 3），实验是在三重体中进行的。缩写:CTC = 循环肿瘤细胞;IVIS = 体内成像系统。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:在小鼠中进行穆林·奥马亚植入的工作站设置示例。（1） 气体麻醉机/蒸发器。（2） 无菌蓝纸窗帘覆盖立体式支架。（3） 立体定型音响设备（支架/舞台、耳塞、鼻锥）。（4） 微钻。（5） 带光的放大镜。（6） 无菌棉敲击施用棒与无菌盐水冲洗容器。（7） 过氧化氢。（8） 珠消毒器。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:穆林·奥马亚装置的植入（A） 一个箭头指向头骨上的布雷格玛位置的插图，以及用微缩钻头在头骨（0.5毫米后/1.1毫米横向）中钻毛刺孔的大致距离。（B） 木林奥玛亚是结合一个金属管和一个1毫米的垫片作为粘合头骨的基础组装。（C） 植入穆林·奥马亚斯的小鼠代表图像:这些小鼠在接受任何注射前都受到监测，以确保它们明亮、警觉和反应。（D） 原型磁共振成像兼容的穆林奥马亚和代表脑磁共振成像图像的穆林奥玛亚植入物的例子。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:使用穆林·奥马亚（A）注射静脉注射，通过穆林·奥马亚进入心室和中枢神经系统。小鼠在注射期间仍然处于麻醉状态。在示例中，Murine Ommaya 连接到连接到预填充汉密尔顿注射器的微型端口。注射使用自动注射集，输液速率为 1 μL/分钟，体积为 5-7 μL。显示的是注入埃文斯蓝的老鼠大脑的图像。圆圈显示穆林·奥马亚的依附位置。在大脑的外部没有发现染料的泄漏。大脑的横截面显示横向心室充满了染料:染料没有穿透大脑的帕伦奇马。（B） 注射埃文斯蓝染料后15分钟和30分钟后老鼠大脑的图像。染料渗入大脑（15分钟），开始在脊髓上循环（30分钟）。在5只小鼠中，4只接受染料进行可视化，1只用作对照。实验在三重中重复。请单击此处查看此图的较大版本。

图5:使用Murine Ommaya的直接靶向免疫疗法可增加乳腺癌相关瘦肉病小鼠的整体存活率。 （A） BALB/c小鼠被注射了由红斑狼菌标记的人类表皮生长因子受体2阳性TUBO细胞，一种穆林乳腺癌细胞系。在西斯特纳大麦格纳注射三天后，穆林·奥马亚斯被植入。小鼠在注射1周后开始发展瘦身病（LMD）。LMD小鼠通过腹内注射或通过内膜（Murine Ommaya）系统地使用人类表皮生长因子受体抗体进行治疗，作为直接靶向方法。每周注射一次，最长达4周。与未经治疗的小鼠相比，接受免疫治疗的小鼠存活的时间要长得多。穆林·奥马亚小鼠在第四周就完全疾病复发，这些小鼠最终治愈了疾病。（B） 这些小鼠的存活率中位数也显著提高（曼特尔-考克斯测试: P = 0.004;n = 每个治疗手臂 5 只小鼠）， 整体存活率高于系统治疗的 LMD 小鼠。缩写: LMD = 瘦身病;IP = 开胃内。请单击此处查看此图的较大版本。

彼得·福赛斯在提交的作品之外，担任Abvie公司、拜耳、布里斯托尔·迈耶斯·斯奎布、BTG、伊诺维奥、诺沃卡雷、托卡根和齐奥法姆的顾问委员会成员。所有其他作者都没有什么可透露的。